ABSTRACT
Annually, about 40,000 persons are stricken by snake bite accidents in Brazil, being most of the cases are inflicted by Bothrops genus, whose venom can induce serious pathophysiological effects, mainly disorders in hemostasis. Bothrops jararaca venom is characterized by three main actions: proteolytic, coagulant and hemorrhagic. Some clotting factors can be activated by components present in the venom, classified as pro-coagulant activators, responsible for activating factor X or factor II of the coagulation cascade, generating thrombin. So far, only one procoagulant activator of Bothrops jararaca venom BjV has been characterized, bothrojaractivase, a 23 kDa PI-type metalloproteinase. In this work, we used chromatographic techniques to isolate other procoagulant components of BjV. Thus, by means of affinity chromatographies, BjV was purified on HisTrap and Blue Sepharose resins. Fractions capable of coagulating human fibrinogen and rabbit plasma were obtained, and this last substrate is only coagulated by pro-coagulant activators of BjV. Such fractions with high clotting activity were analyzed, concentrated and their activities on different substrates were differentiated by the use of specific inhibitors of metalloproteinases and serine proteinases. Studies are still being carried out to understand which coagulation factors are being activated by these fractions, by using chromogenic substrates, electrophoresis runs, and mass spectrometry.
Anualmente, cerca de 40.000 pessoas são acometidas por acidentes ofídicos no Brasil, sendo a maioria dos casos decorrentes de serpentes do gênero Bothrops, cujo veneno pode induzir graves efeitos fisiopatológicos, principalmente distúrbios na hemostasia. O veneno da espécie Bothrops jararaca é caracterizado por três ações principais: proteolítica, coagulante e hemorrágica. Relacionado à atividade coagulante, alguns fatores da cascata de coagulação podem ser ativados por componentes presentes no veneno, classificados como ativadores do tipo pró-coagulantes, responsáveis por ativar o fator X ou o fator II da cascata, gerando trombina. Até o momento, apenas um ativador pró-coagulante do veneno de Bothrops jararaca BjV foi caracterizado, a bothrojaractivase, uma metaloproteinase do tipo PI, de 23 kDa. Neste trabalho, utilizamos técnicas cromatográficas para isolar outros componentes pró-coagulantes do BjV. Deste modo, por meio de cromatografias de afinidade, o BjV foi purificado em resinas de HisTrap e Blue Sepharose. Foram obtidas frações capazes de coagular o fibrinogênio humano e plasma de coelho, um substrato que somente é coagulado por enzimas pró-coagulantes do BjV. Tais frações com altas atividades coagulantes foram analisadas, concentradas e suas atividades sobre diferentes substratos foram diferenciadas pelo uso de inibidores específicos de metaloproteinases e serinaproteinases. Obtivemos duas frações parcialmente purificadas, com alta atividade específica, e que são inibidas por quelante de metais divalentes o-fenantrolina. Essas frações são capazes de coagular o plasma de coelho, sem coagular o fibrinogênio humano. Estudos ainda estão sendo realizados para entender quais fatores da cascata de coagulação estas frações ativam, pela utilização de substratos cromogênicos específicos, análises eletroforéticas e espectrometria de massa.
