Calpains of Leishmania braziliensis: genome analysis, differential expression, and functional analysis.

BACKGROUND: Calpains are proteins belonging to the multi-gene family of calcium-dependent cysteine peptidases that undergo tight on/off regulation, and uncontrolled proteolysis of calpains is associated with severe human pathologies. Calpain orthologues are expanded and diversified in the trypanosomatids genome. OBJECTIVES: Here, we characterised calpains in Leishmania braziliensis, the main causative agent of cutaneous leishmaniasis in Brazil. METHODS/FINDINGS: In total, 34 predicted calpain-like genes were identified. After domain structure evaluation, reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) during in vitro metacyclogenesis revealed (i) five genes with enhanced expression in the procyclic stage, (ii) one augmented gene in the metacyclic stage, and (iii) one procyclic-exclusive transcript. Western blot analysis revealed that an antibody against a consensus-conserved peptide reacted with multiple calpain-like proteins, which is consistent with the multi-gene family characteristic. Flow cytometry and immunocytochemistry analyses revealed the presence of calpain-like molecules mainly in the cytoplasm, to a lesser extent in the plasma membrane, and negligible levels in the nucleus, which are all consistent with calpain localisation. Eventually, the calpain inhibitor MDL28170 was used for functional studies revealing (i) a leishmaniostatic effect, (ii) a reduction in the association index in mouse macrophages, (iii) ultra-structural alterations conceivable with autophagy, and (iv) an enhanced expression of the virulence factor GP63. CONCLUSION: This report adds novel insights into the domain structure, expression, and localisation of L. braziliensis calpain-like molecules.

Expressão de calpaínas e efeito do inibidor MDL28170 em Leishmania braziliensis / Calpain expression and effect MDL28170, a calpain inhibitor, on leishmania braziliensis

As diversas espécies de Leishmania são parasitas de considerável importância médica e econômica. As drogas atualmente utilizadas no tratamento da leishmaniose apresentam efeitos adversos, alta toxicidade, elevado custo e surgimento de cepas resistentes. Nesse contexto, inibidores proteolíticos é uma alternativa para o tratamento desta doença. Este estudo está focado nas calpaínas, que compreendem uma família de cisteína peptidases neutras dependentes de cálcio, envolvidas numa ampla variedade de funções fisiológicas. As calpaínas estão envolvidas em importantes doenças humanas, portanto inibidores de calpaínas já vêm sendo desenvolvidos e testados para o tratamento dessas doenças, alguns encontra-se em estágios avançados de triagem clínica. Dessa forma, o presente trabalho avalia a expressão e identificação de homólogos das calpaínas em Leishmania braziliensis e o efeito do inibidor de calpaínas MDL28170 em ensaios in vitro. Através da busca por sequências no GenBank, alinhamentos múltiplos, filogenia e análise de domínios conservados nas sequências obtidas, selecionamos como alvo inicial sequências de calpaínas que possuíam o maior número de domínios conservados. A análise da expressão gênica relativa indica que 13 das 20 calpaínas estudadas apresentam níveis constitutivos de mRNA nas formas procíclica e metacíclica de L. braziliensis. A expressão de cinco alvos é maior na forma procíclica, e a de um alvo é maior na forma metacíclica e há expressão estágio específica de apenas um alvo na forma procíclica. [...]

Em ensaios de Western blotting,verificamos que o anticorpo foi capaz de reagir contra uma proteína de 50 kDa. Já na imunolocalização foi possível observar calpaínas dispersas no citoplasma, membrana e núcleo. Além disso, através de citometria de fluxo, as moléculas homólogas às calpaínas foram identificadas em maior abundância no interior das células. Nos ensaios de inibição com o MDL28170, inibidor de calpaínas, foi possível observar a redução da proliferação nas formas promastigotas recém isoladas e múltiplas passagens de forma dose-dependente nas diferentes concentrações do inibidor ao longo de quatro dias. O efeito reversíveldo inibidor também foi avaliado nas formas promastigotas, com taxas menores comparado com o controle. O efeito do inibidor, também foi capaz de diminuir de maneira dose-dependente o índice de associação e aumentou o percentual de células com parasitos aderidos durante o processo de interação com macrófagos peritoneais. O parasito aumentou a expressão de uma peptidse clássica (gp63) quando tratado com o MDL28170, já a expressão de calpaínas e cpb não foi alterada pelo estresse induzido pelo composto. Estes dados sugerem mais estudos para melhor caracterizar as calpaínas em L. braziliensis e sugerem uma maior avaliação para uma possível associação de moléculas similares as calpaínas com a virulência ou não do parasito. Assim este trabalho acrescenta novas possibilidades para a utilização de inibidores de calpaínas como um potencial alvo de desenvolvimento para o tratamento da leishmaniose.

The various species of Leishmania are parasites of considerable medical and economicimportance. The drugs used in the treatment of leishmaniasis have adverse effects, high toxicity,high cost and emergence of resistant strains. In this context, proteolytic inhibitors could be analternative for the treatment of this disease. This study is focused on calpains, which comprise afamily of neutral cysteine peptidases, which are strictly dependent of calcium, and are there ofknown as Calcium Dependent Peptidases.These enzymes play a variety of physiologicalfunctions, and are involved in human diseases, therefore calpains inhibitors are under trial totreat these diseases. Thus, this study aimed to assess calpain expression levels in Leishmaniabraziliensis, as well as the effect of the calpain inhibitor MDL28170 in vitro. Through thesearching for sequencesin GenBank, multiple alignments, and phylogenetic analysis of theobtained sequences conserved domains, selected as an initial target sequences of calpain whichpossessed the greatest number of conserved domains. In this sense, we assessed the expressionlevels of mRNA from a group of twenty sequences containing archetypal calpain domain. Theanalysis indicated that 13 out of the 20 studied calpains have constitutive levels of mRNAbetween the procyclic and metacyclic forms of L. braziliensis, while five calpains presentedhigher expression levels at the procyclic stage, and only one sequence is augmented at themetacyclic stage. One calpain molecule was found to be procyclic-specific.

[...] In Western blotting assays, we found that the anti-calpainTriTryp antibody was able to recognize a 50 kDa protein. The immunolocalization assaysrevealed calpain molecules present at the membrane, nucleus and dispersed throughout thecytoplasm. Also, by flow cytometry, molecules homologous to calpains have been identified inabundance within cells. In inhibition assays employing MDL28170, a potent and specificcalpain inhibitor, it was possible to observe a dose-dependent reduction in the proliferation rate,either in freshly isolated promastigotes or multiple passages parasites. MDL28170 presents areversible inhibitory effect. The inhibitor was also able to decrease in a dose-dependent mannerthe association index and the percentage of host cells with attached parasites during the processof interaction with peritoneal macrophages. Finally, MDL28170 enhanced the expression ofgp63 molecules, while cpb and calpains expression were not affect. Further studies to bettercharacterize the calpain in L. braziliensis should be performed, aiming to add new possibilitiesfor the exploitation of calpain inhibitors as a potential for the treatment of leishmaniasis.