ABSTRACT
In the first chapter, studies on substrate recognition and enzymatic activity of GGDEF domains are presented. Many proteins containing GGDEF domains are diguanylate cyclases (DGCs, EC 2.7.7.65), enzymes that catalyze the conversion of 2 GTP molecules into the second messenger c-di-GMP in prokaryotes. This molecule is primarily implicated in the transition between motile and sessile lifestyles, as well several other phenotypes. Redundancy and diversity of GGDEF domain sequences in many bacterial genomes raises the possibility that other enzymatic functions may yet be discovered. To test this hypothesis, i) the effect of point mutations on the structure and enzymatic activity of GGDEF domains is analyzed, ii) the enzymatic specificity of wild-type GGDEF domains from different proteins is also tested, and iii) when non-canonical products are detected, enzymatic models are studied to understand its preferential production. The principal results obtained from these studies are as follows. Seven mutants of the DGC PleD (a GGDEF containing-protein from Caulobacter crescentus) were constructed and the crystallographic structure of two of them was solved, showing that they are unlikely to bind the guanine moiety in its active site. Additionally, five mutants of XAC0610, another DGC from Xanthomonas citr, were constructed and their substrate specificities were evaluated. None of those mutants were able to use ATP as a substrate. Finally, seven different GGDEF domain-containing DGCs from different sources were expressed and purified and their enzymatic specificities were tested with several nucleotide triphosphates. One enzyme, GSU1658 from Geobacter sulfurreducens was particularly promiscuous and shown to produce c-di-GMP, c-di-AMP, c-di-IMP, c-di-2´dGMP, cGAMP, c-GIMP, and c-AIMP. Interestingly, XAC0610 was able to recognize 2´dGTP as substrate. Analysis of enzyme kinetics of XAC0610 in presence of 2´dGTP and/or GTP showed the preferential formation of the hybrid linear product pppGp2´dG. The second chapter present studies on cyanide metabolism in Bacillus with focus on the cyanide dihydratase of Bacillus safensis. Cyanide is widely used in industries due to its high affinity for metals. This same ability confers potent toxicity to this compound. Thus, industries must reduce the cyanide concentration from wastewater before its final disposal. Physical, chemical, and biological methods have been developed to achieve this goal, but knowledge about metabolic pathways and the biology of enzymes involved in cyanide degradation is still scarce. Here, the isolation of a Bacillus safensis strain from mine tailings in Peru is described. Classification of this strain was done through a comparative analysis of 132 core genomes of strains from the Bacillus pumilus group. Sequence analysis determined that a cyanide dihydratase (CynD, EC 3.5.5.1)) encoded in the genome of the isolated strain was likely the enzyme responsible for cyanide degradation. Confirmation of the cyanide degrading activity of CynD from this strain was achieved by cloning, expression and purification of the enzyme and its enzymatic characterization. CynD from this strain was active up to pH 9 and oligomerization patterns analyzed by SEC-MALS and electron microscopy showed that the enzyme forms large helical structures at pH 8 and smaller structures at higher pHs. Finally, we show that CynD expression is strongly induced in the presence of cyanide. The last two years of graduate studies were carried out in the context of the COVID-19 pandemic. Thanks to the large amount of publicly available genomic data, we were able to carry out studies on the worldwide dynamics of the spread of SARS-CoV-2 mutants forms. In the first year of the pandemic, genomic classification of 171,461 genomes showed the presence of five major haplotypes based on nine mutations. The worldwide distribution and the temporal evolution of frequency of these haplotypes was carefully analyzed. All the haplotypes were identified in the six regions analyzed (South America, North America, Europe, Asia, Africa, and Oceania); however, the frequency of each of them was different in each of these regions. As of September 30, 2020, haplotype 3 (or operational taxonomic unit 3, OTU_3) was the most prevalent in four regions (South America, Asia, Africa, and Oceania). OTU_5 was the most prevalent in North America and OTU_2 in Europe. Temporal dynamics of the haplotypes showed that OTU_1 became nearly extinct after 8 months of pandemic (November 2020). Other OTUs are still present in different frequencies all around the world, while currently generating new variants. Based on their temporal dynamics, a classification scheme of 115 SARS-CoV-2 mutations identified from 1,058,020 SARS-COV-2 genomes was also performed. Three types of temporal dynamics of mutations were identified: i) High-Frequency mutations are characterized by a rapid increase in frequency upon its appearance, ii) medium and iii) low-frequency mutations maintain mid or low-frequencies for several months and can be region-specific. Finally, we performed a correlation analysis of the effective reproduction number (Rt) of SARS-CoV-2 harboring the high-frequency mutation N501Y with the level of control measures adopted in specific jurisdictions. We show that Rt is negatively correlated with the level of control measures in eight of the nine countries analyzed. This negative correlation was similar when we analyzed the Rt of SARS-CoV-2 not-harboring N501Y. Thus, the control measures likely diminish the Rt of both SARSCoV-2 wild-type and N501Y
O presente trabalho está dividido em três capítulos sobre linhas de pesquisa diferentes desenvolvidas pelo autor durante o período de doutorado No primeiro capítulo, são apresentados estudos relacionados ao reconhecimento estrutural de substratos e análise enzimática de domínios GGDEF com atividade diguanilato ciclase (EC 2.7.7.65). As proteínas contendo domínios GGDEF estão relacionados à produção enzimática do segundo mensageiro c-di-GMP, a partir de duas moléculas de GTP, em procariotos. Esta molécula está principalmente envolvida na transição entre os estilos de vida móveis e sésseis, bem como vários outros fenótipos. Redundância e diversidade de sequências de domínio GGDEF aumentam a possibilidade de que outras funções enzimáticas ainda possam ser descobertas. Para testar esta hipótese, i) o efeito de mutações pontuais na estrutura e atividade enzimática dos domínios GGDEF é analisado, ii) a especificidade enzimática de domínios GGDEF de enzimas diferentes também é testada e iii) quando produtos não canônicos são detectados, modelos enzimáticos são estudados para entender sua produção preferencial. Como resultados mais importantes, sete mutantes do PleD (uma proteína contendo GGDEF) foram construídos e a estrutura cristalográfica de dois delas foi resolvida, mostrando que é improvável que eles liguem à porção guanina em seu sítio ativo. Além disso, cinco mutantes da proteína XAC0610 de Xanthomonas citri foram construídos e sua capacidade de usar ATP ou GTP como substrato foi avaliada. Nenhum desses mutantes foi capaz de usar ATP como substrato. Finalmente, sete outras proteínas contendo GGDEF foram purificadas e sua especificidade enzimática foi avaliada com vários trifosfatos de nucleotídeos. Uma enzima promíscua chamada GSU1658 mostrou produzir c-di-GMP, c-di-AMP, c-di-IMP, c-di-2´dGMP, c-GAMP, cGIMP e c-AIMP. Curiosamente, o XAC0610 foi capaz de reconhecer 2´dGTP como substrato. A análise da cinética enzimática de XAC0610 na presença de 2´dGTP e GTP mostrou a formação preferencial do produto linear híbrido pppGp2´dG. O segundo capítulo aborda estudos sobre o metabolismo do cianeto em Bacillus com foco na cianeto dihidratase de Bacillus safensis. O cianeto é amplamente utilizado nas indústrias devido à sua alta afinidade com os metais. Esta mesma capacidade confere toxicidade potente a este composto. Assim, as indústrias têm que reduzir a concentração de cianeto das águas residuais antes de sua disposição final. Métodos físicos, químicos e biológicos têm sido desenvolvidos para atingir esse objetivo, mas o conhecimento sobre as vias metabólicas e a biologia das enzimas envolvidas na degradação do cianeto ainda é escasso. Aqui, é descrito o isolamento de uma cepa de Bacillus safensis de rejeitos de minas no Peru. A classificação desta cepa foi feita através de uma análise comparativa de 132 core genomes de cepas do grupo de Bacillus pumilus. Em seguida, determinamos que uma cianeto dihidratase (CynD, EC 3.5.5.1) codificada no genoma da cepa isolada era provavelmente a enzima responsável pela degradação do cianeto. A confirmação da atividade degradante de cianeto de CynD desta cepa foi feita por clonagem, expressão e purificação da enzima e realização de caracterização enzimática. O CynD desta cepa é ativo até pH 9 e os padrões de oligomerização analisados por SEC-MALS mostraram que a enzima forma longas estruturas helicoidais em pH 8 e estruturas menores enquanto o pH aumenta. Finalmente, foi demonstrado que a expressão de CynD é fortemente induzida na presença de cianeto. Os últimos dois anos do doutorado foram realizados no contexto da pandemia COVID- 19. Vários laboratórios se dedicaram a gerar conhecimento para ajudar no combate à pandemia. Nesta situação e graças à grande quantidade de dados genômicos disponíveis publicamente, estudos sobre a dinâmica das mutações do SARS-CoV-2 foram realizados. No primeiro ano da pandemia, a classificação genômica de 171.461 genomas mostrou a presença de cinco haplótipos principais com base em nove mutações. A distribuição mundial e a mudança de frequência desses haplótipos foram analisadas cuidadosamente. Todos os haplótipos foram identificados nas seis regiões analisadas (América do Sul, América do Norte, Europa, Ásia, África e Oceania); no entanto, a frequência de cada um deles foi diferente em cada uma dessas regiões. Em 30 de setembro de 2020, o haplótipo 3 (ou unidade taxonômica operacional 3, OTU_3) era o mais prevalente em quatro regiões (América do Sul, Ásia, África e Oceania). OTU_5 foi o mais prevalente na América do Norte e OTU_2 na Europa. A dinâmica temporal dos haplótipos mostrou que OTU_1 parece perto da extinção após 8 meses de pandemia (novembro de 2020). Outros OTUs ainda estão presentes em diferentes frequências em todo o mundo, mesmo atualmente gerando novas variantes. Com base em sua dinâmica temporal, um esquema de classificação de 115 mutações SARS-CoV-2 identificadas a partir de 1.058.020 genomas SARS-COV-2 também foi feito. Três tipos de dinâmica temporal de mutações foram identificados: i) Mutações de alta frequência, ii) mutações de média frequência e iii) mutações de baixa frequência. Finalmente, foi analisada a correlação do número de reprodução efetiva (Rt) do SARS-CoV-2 que contém a mutação de alta frequência N501Y com o nível de medidas de controle, mostrando que seu Rt está negativamente correlacionado com o nível de medidas de controle em oito dos nove países analisados. Esta correlação negativa foi semelhante quando foi analisado o Rt de SARS-CoV-2 sem a mutação N501Y. Assim, as medidas de controle provavelmente diminuirão o Rt de SARS-CoV-2 tipo selvagem e N501Y