Estudio proteómico 2DE-DIGE en plasma sanguíneo de pacientes en etapa infantil con leucemia linfoblástica aguda / 2DE-DIGE proteomic study in blood plasma of patients in childhood stage with acute lymphoblastic leukemia / Estudo proteômico 2DE-DIGE no plasma sanguíneo de pacientes em estágio infantil com leucemia linfoblástica aguda

Resumen En Colombia, durante la última década, la leucemia linfoblástica aguda (LLA) ha causado más del 40% de las muertes por cáncer en menores de edad. Entre los factores que influyen en estas cifras, el diagnóstico tardío es uno de los factores que más afecta el éxito del tratamiento. Por lo anterior, esta investigación se centró en el estudio del proteoma plasmático de niños colombianos diagnosticados con LLA tipo B, en comparación con controles en la búsqueda de proteínas que podrían ser clasificadas como biomarcadores de diagnóstico. En vista de los avances en las herramientas proteómicas y de espectrometría de masas y teniendo en cuenta que son una alternativa para abordar la complejidad molecular de enfermedades como el cáncer, se utilizó una aproximación proteómica basada en una separación por electroforesis bidimensional diferencial (2DE-DIGE) con posterior separación por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) en tándem. Se encontraron ocho proteínas con expresión diferencial en plasma de pacientes con LLA-B, entre las cuales resaltan la Serotransferrina, la Alfa-1-antitripsina, la Haptoglobina, la Alfa-2-glicoproteína de zinc y el Complemento C3.

Abstract In Colombia, during the last decade, acute lymphoblastic leukemia (ALL) has caused more than 40% of cancer deaths in children. Among the factors that influence these figures, late diagnosis is one of the factors that affects the treatment success. Therefore, this research focused on the plasma proteome study of Colombian children diagnosed with B-cell ALL, as compared with healthy controls in the search of proteins that could be classified as diagnostic biomarkers. Now, in view of the advances in the proteomics and mass spectrometry tools and taking into account that they are an alternative to address the molecular complexity of diseases such as cancer, a proteomic approach, based on bidimensional difference gel electrophoretic separation (2DE-DIGE) coupled to LC-MS/ MS, was used. We found eight differentially expressed proteins in plasma from B-cell ALL patients as follows: Serotransferrin, Alpha-1-antitrypsin, Haptoglobin, Zinc-alpha-2-glycoprotein, and Complement C3.

Resumo Na Colômbia, durante a última década, a leucemia linfoblastica aguda (LLA) tem sido o câncer com maior incidência, com mais de 40% das mortes por câncer em menores atribuídas a essa doença. Entre os fatores que influenciam esses números, o diagnóstico tardio talvez seja o fator mais sensível que afeta negativamente o sucesso do tratamento. Esta pesquisa enfocou o estudo do proteoma plasmático de crianças colombianas diagnosticadas com LLA tipo B, dada a sua alta incidência, em comparação com controles na busca por proteínas que poderiam ter potencialidade para serem classificadas como biomarcadores diagnósticos. Agora, em vista dos avanços nas ferramentas de proteômica e espectrometria de massa e sabendo que eles são uma alternativa para abordar a complexidade molecular de doenças como o câncer, usamos uma abordagem proteômica baseada em uma separação por eletroforese bidimensional diferencial (2DE-DIGE) com subsequente separação por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em tandem. Encontramos 8 proteínas com expressão diferencial no plasma de pacientes com LBA, dentre os quais a Serotransferrina, a Alfa-1-antitripsina, a Haptoglobina, a Glicoproteína alfa-2-zinco e o Complemento C3.

Proteomic analysis reveals the enhancement of human serum apolipoprotein A-1(APO A-1) in individuals infected with multiple dengue virus serotypes.

OBJECTIVES: Human serum protein profiling of the individual infected with multiple dengue virus serotypes for identifying the potential biomarkers and to investigate the cause for the severity of dengue virus infection. METHODS: Dengue virus NS1-positive serum samples were pooled into two groups (S2 and S3) based on the molecular serotyping and number of heterotypic infections. The pooled serum samples were subjected to two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) to identify the differentially expressed proteins. The peptide masses of upregulated protein were detected by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight MALDI-TOF mass spectrometry and analysed by MASCOT search engine. The results were compared with the control group (S1). The commonly upregulated protein was validated by quantitative ELISA and compared with control as well as single serotypic infected samples. RESULTS: Based on 2DGE, total thirteen proteins were differentially upregulated in S2 and S3 groups as compared to control. Some of the upregulated proteins were involved in mediating the complement activation of immune response. The apolipoprotein A-1 (APO A-1) was upregulated in S2 and S3 groups. Upon validation, APO A-1 levels were increased in line with the number of heterotypic infection of dengue viruses. CONCLUSION: Heterotypic infection of dengue viruses upregulate the serum proteins involved in the complement pathway in the early phase of infection. There was a significant increase in the level of APO A-1 in three different serotypic infections of dengue virus as compared to control. Further, the role of APO-A1 can be explored in elucidating the mechanism of dengue pathogenesis.

Implementación de una metodología para la separación de proteomas de plasma humano mediante electroforesis bidimensional / Implementation of a methodology to separate human plasma proteomes by two-dimensional electrophoresis / Implementação de uma metodologia para a separação do proteoma do plasma humano por eletroforese bidimensional

En este trabajo se implementaron las condiciones para la separación de proteomas de plasma sanguíneo por electroforesis bidimensional. En muestras de plasma de infante y adulto se evaluaron dos sistemas de pretratamiento de la muestra para reducir el rango dinámico de las proteínas: inmunodepleción de proteínas abundantes y enriquecimiento de proteínas de baja abundancia. Los proteomas se separaron por electroforesis bidimensional y las imágenes se analizaron con el programa Melanie 7.0. Se encontró que ambos métodos de pretratamiento fueron reproducibles y permitieron ver las diferencias en los proteomas de infante y adulto, como muestran los análisis de componentes principales y de clasificación jerárquica tipo heatmap. El porcentaje de recuperación de proteínas fue mayor con la inmunodepleción en comparación con el enriquecimiento proteico. Estos resultados permitieron concluir que con la inmunodepleción, se tiene mayor control de las proteínas eliminadas y por tanto menor pérdida de información, lo que permite su aplicación en estudios exploratorios para la identificación de potenciales biomarcadores de enfermedad.

The conditions to separate blood plasma proteomes by two-dimensional electrophoresis were implemented. In plasma samples from infant and adult two sample pretreatment systems to reduce the proteins dynamic range were evaluated: Immunodepletion of abundant proteins and protein-enrichment of low abundance proteins. Proteomes were separated by two-dimensional electrophoresis and the images were analyzed using Melanie 7.0. It was found that both pretreatment methods were reproducible and allowed to see the differences in the proteomes of infant and adult, as evidenced by the principal component analysis and heatmap, a type of hierarchic classification. The percent recovery of proteins was greater with the immunodepletion method, compared to the protein enrichment system. With these results, we conclude that reducing the complexity of plasma by immunoaffinity showed better control of unrecovered proteins and therefore less loss of information, which allows its application on exploratory studies to identify potential biomarkers of disease.

O objetivo deste trabalho foi otimizar as condições para a separação de proteomas do plasma sanguíneo por eletroforese bidimensional para sua aplicação na procura de potenciais biomarcadores. Trabalhou-se com amostras de plasma de crianças e adultos, avaliando dois sistemas de pre-tratamento da amostra para diminuir o espectro dinâmico das proteínas, imunodepleção de proteínas abundantes e enriquecimento de proteínas de baixa abundância. Os proteomas foram separados por eletroforese bidimensional e as imagens foram analisadas com o programa Melanie 7.0. Foi encontrado que ambos métodos de pre-tratamento foram reprodutíveis e permitiram observar as diferenças nos proteomas de crianças e adultos, como foram evidenciadas com as análises de componentes principais e de classificação hierárquica tipo heatmap. A porcentagem de recuperação de proteínas foi maior na imunodepleção do que obtido pelo enriquecimento proteico. Estes resultados permitiram concluir que com a imunodepleção há um controle mais eficiente das proteínas eliminadas e assim uma menor perda de informação, isto permite sua aplicação em estudos exploratórios orientados na identificação de potenciais biomarcadores da doença.

Microproteínas urinarias en diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos / Urinary microproteins in normoalbuminuric type 2 diabetic patients / Microproteínas urinárias em diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos

En pacientes diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos se observa la presencia de Microproteínas Urinarias (MU) en el rango 68-25 kDa. El objetivo del trabajo fue identificar en distintos estadios de la nefropatía diabética si dicho rango corresponde a un marcador de daño tubular. Se estudiaron 119 orinas espontáneas de pacientes diabéticos tipo 2; se les midió la relación albúmina/creatinina urinaria y la creatinina sérica. Se dividieron en 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urémicos en pre-diálisis y 6 en hemodiálisis. Las MU se detectaron en geles de poliacrilamida en 2 dimensiones para uso clínico y se analizaron con el programa Image J 1.30v. La identificación de las MU se realizó por “immunoblotting” o por espectrometría de masa MALDI-TOF-TOF. El 66% de los normoalbuminúricos presentaron las siguientes MU: orosomucoide, fragmento de 35 kDa de la cadena pesada H4 del inter alfa I inhibidor de tripsina y Beta Trace, las cuales no reflejaron daño tubular debido a que la concentración de las mismas no se incrementó en los pacientes en hemodiálisis, en comparación con los normoalbuminúricos. Dichas proteínas están vinculadas al endotelio vascular y podrían constituir un marcador urinario vascular-tubular renal de utilidad clínica en patologías sistémicas con riesgo cardiovascular y funcionalidad renal conservada.

Urinary excretion of microproteins (MU) was detected in normoalbuminuric type 2 diabetic patients, in the range of 68-25 kDa using SDS-PAGE with silver staining. The purpose of this study was to identify MU in diabetic patients in different grades of diabetic nephropathy, in order to clarify the diagnostic relevance as a marker of renal tubular damage. In the spontaneous urine of 119 type 2 diabetic patients, urinary albumin, urinary creatinine and serum were determined. Five groups were formed: 71 normoalbuminuric, 28 microalbuminuric, 12 macroalbuminuric, 2 in pre-dialysis and 6 in hemodialysis. The MU were separated by two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis for clinical use (2D UC) and were identified by immunoblotting or MALDI-TOF-TOF mass spectrometry and analyzed using Image J version 1.30v. Of the normoalbuminurics patients studied, 66% excreted the following MU: orosomucoid, 35 kDa fragment of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (ITIH4) and Beta Trace; but their concentrations did not reflect tubular damage because they exhibited a progressive downregulation. These proteins are involved in vascular endothelium, and they could be a marker of renal tubular-microvascular disease that would be useful in systemic diseases with cardiovascular risk and with preserved renal function.

Em pacientes diabéticos tipo 2 “normoalbuminúricos” se observa a presença de microproteínas urinárias (MU) em um intervalo compreendido entre 68 e 25 kDa. O objetivo do trabalho é identificar em distintos estágios da nefropatia diabética se tal intervalo corresponde a um marcador de dano tubular. Foram estudadas 119 amostras de urina espontânea de pacientes diabéticos tipo 2; foi medida a reação albumina/creatinina urinária e a creatinina sérica. Dividiram-se em 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urêmicos pré-dialise e 6 em hemodiálise. Foram detectadas as MU em géis de poliacrilamida em duas dimensões para o uso clínico e analisadas com o programa Image J versão 1.30v. A identificação das MU foi realizada por “immunoblotting” ou por espectrometria de massa MALDI-TOF-TOF. 66% de normoalbuminúricos apresentaram as seguintes MU: orosomucoide, Fragmento de 35 kDa da cadeia pesada H4 do interalfa inibidor da tripsina e Beta Trace, as quais não mostraram dano tubular devido a que a concentração das mesmas não está aumentada nos pacientes em hemodiálise, em comparação com os normoalbuminúricos. Estas proteínas estão envolvidas com o endotélio vascular e poderiam constituir um marcador urinário vascular-tubular renal de utilidade clínica em patologias sistêmicas com risco cardiovascular e funcionalidade renal conservada.

Electroforesis bidimensional en orina: una alternativa para el laboratorio clínico / Two dimensional electrophoresis in urine: an alternative for the clinical laboratory / Eletroforese bidimensional em urina: uma alternativa para o laboratório clínico

En este trabajo se presenta un método confiable para el análisis de rutina de proteínas urinarias. El método es la electroforesis bidimensional que combina la electroforesis en acetato de celulosa con la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio seguida de tinción argéntica. La electroforesis bidimensional abre el espectro de proteínas, siendo algunas de ellas identificadas por immunoblotting o espectrometría de masa MALDI. Dichas proteínas son de bajo peso molecular: Orosomucoide (40 kDa), apolipoproteína AI (28 kDa), zinc-alfa 2-glicoproteína (43 kDa), fragmento del perlecan C-terminal LG3 (23 kDa), prostaglandina D2 sintasa tipo-lipocalina (29 kDa) e inter-alfa inhibidor de tripsina cadena pesada H4 (35 kDa). Estas proteínas están incluidas en estudios de falla renal aguda, falla renal crónica, trasplante renal, enfermedad glomerular y enfermedad maligna del tracto urogenital. El método, no invasivo, se aproxima a la tecnología emergente de la proteómica que permite el análisis simultáneo de varias proteínas urinarias como una herramienta para el diagnóstico y monitoreo de una variedad de enfermedades humanas.(AU)

A method suitable for routine clinical analyses of urinary proteins is presented. This method is a two-dimensional electrophoresis procedure, combining cellulose acetate electrophoresis and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels electrophoresis followed by silver staining. The resulting two-dimensional electrophoresis opened the protein spectrum and some of the latter were identified, by immunoblotting or MALDI mass spectrometry. There are low molecular weight protein: Orosomucoid (40 kDa), apolipoprotein AI (28 kDa), Zinc-alpha2-glycoprotein (43 kDa), C-terminal perlecan fragment LG3 (23 kDa), lipocalin-type prostaglandin D2 synthase (29 kDa) and inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (35 kDa). They include studies of acute and chronic kidney injury, renal transplantation, glomerular disease and malignancy of the urogenital tract. This method approaching the emerging proteomic technologies allows simultaneous examination of the patterns of multiple urinary proteins as a powerful non-invasive tool for diagnosis and monitoring of variety of human diseases.(AU)

Neste trabalho é apresentado um método confiável para a análise de rotina de proteínas urinárias. O método é a eletroforese bidimensional que combina a eletroforese em acetato de celulose com a eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio seguida de tinþÒo argÛntea. A eletroforese bidimensional abre o espectro de proteínas, sendo algumas delas identificadas por immunoblotting ou espectrometria de massa MALDI. Tais proteínas sÒo de baixo peso molecular: Orosomucoide (40 kDa), apolipoproteína AI (28 kDa), zinco-alfa2-glicoproteína (43 kDa), fragmento do perlecan C-terminal LG3 (23 kDa), prostaglandina D2 sintase tipo-lipocalina (29 kDa) e inter-alfa inibidor de tripsina cadeia pesada H4 (35 kDa). Estas proteínas estÒo incluídas em estudos de falÛncia renal aguda, falÛncia renal cr¶nica, transplante renal, doenþa glomerular e doenþa maligna do trato urogenital. O método, nÒo invasivo, aproxima-se da tecnologia emergente da prote¶mica que permite a análise simultÔnea de várias proteínas urinárias como uma ferramenta para o diagnóstico e monitoraþÒo de uma variedade de doenþas humanas.(AU)