Regulação do processo de migração de células endoteliais (in vitro) por Jararagina-C, uma proteína tipo-disintegrina isolada do veneno de Bothrops jararaca

Jararhagin is a PIII class SVMP with hemorrhagic activity, found in Bothrops jararaca venom. By the process of autolysis, Jararhagin gives rise to Jararhagin-C (JarC), a protein with disintegrin-like and cysteine-rich domains, containing the ECD motif in the disintegrin domain, which selectively recognizes the α2β1 integrin present in platelets and endothelial cells. Several studies have shown the ability of JarC to increase leukocyte adhesion and migration and to promote angiogenesis in experimental models in vivo. However, obtaining JarC from the venom is a limiting factor for the study of this toxin, as it represents about 1% of the crude venom, and expressing this protein in the recombinant form has solved this problem. Escherichia coli was successfully used to express the protein of interest in fusion with the SUMOUlp1 protein. In this work, we used native and recombinant JarC to investigate and compare, in vitro, its action on the migration of endothelial cells CRL-1730 in a Boyden chamber model using type I collagen as substrate and Fetal Bovine Serum (FBS) as cell migration promoting agent. We also verified the gene expression of the IL-8 chemokine by cells incubated with the proteins at 3h, 6h and 24h. Our results showed the effect of both JarC molecules in inhibiting FBS-stimulated cell migration. In the presence of FBS, JarC down regulated the expression of IL-8 at 3h and 6h, however, at 24h there was a slight increase in the expression of this chemokine. Regarding rJarC there was down regulation with 3h, stability with 6h and up regulation with 24h of treatment. However, the behavior of JarC (both in the native and recombinant form) in a culture of cells grown in the absence of FBS was completely different, being possible to observe an up regulation of IL-8 with 3 and 24 hours of stimulation, and a down regulation with 6 hours of stimulation. Our results clearly demonstrate a role for JarC, an ECD-disintegrin, in inhibiting endothelial cell migration. This effect was reproduced by the recombinant protein, confirming that its biological activity is preserved. A protein with an inhibitory action on endothelial cell migration may be a promising tool to treat pathologies that have angiogenesis as a central mechanism, such as age-related macular degeneration or tumor growth.

A Jararagina é uma SVMP de classe PIII com ação hemorrágica encontrada no veneno de Bothrops jararaca. Pelo processo de autólise, a Jararagina dá origem a Jararagina-C (JarC), uma proteína com os domínios tipo-disintegrina e rico em cisteína, contendo o motivo ECD no domínio disintegrina, que reconhece seletivamente a integrina α2β1 presente em plaquetas e células endoteliais. Diversos estudos têm mostrado a capacidade da JarC em aumentar a adesão e migração de leucócitos e promover a angiogênese em modelos experimentais in vivo. Entretanto, a obtenção da JarC a partir do veneno é um fator limitante para o estudo desta toxina, pois ela representa cerca de 1% da massa do veneno seco, e expressar essa proteína de forma recombinante tem solucionado esse problema. A Escherichia coli foi utilizada com sucesso para expressar a proteína de interesse em fusão com a proteína SUMOUlp1. Neste trabalho, utilizamos a JarC nativa e recombinante a fim de investigar e comparar in vitro, sua ação na migração de células endoteliais da linhagem CRL-1730 em modelo de câmara de Boyden usando colágeno tipo I como substrato e Soro Fetal Bovino (SFB) como agente promotor da migração celular. Verificamos também a expressão gênica da quimiocina IL-8 pelas células incubadas com as proteínas em 3h, 6h e 24h. Nossos resultados evidenciaram o efeito de ambas as moléculas de JarC em inibir a migração celular estimulada pelo SFB, sendo a JarC nativa mais eficiente. Na presença de SFB, a JarC regulou negativamente a expressão da IL-8 com 3h e 6h, no entanto, com 24h houve um aumento discreto na expressão desta quimiocina. Com relação a rJarC houve regulação negativa de IL-8 com 3h, estabilidade com 6h e regulação positiva com 24h de tratamento. Porém, o comportamento da JarC (tanto na forma nativa, quanto recombinante) em uma cultura de células cultivadas na ausência de SFB foi completamente diferente, sendo possível observar uma regulação positiva de IL-8 com 3 e 24 horas de estimulo, e uma regulação negativa com 6 horas de estímulo. Nossos resultados demonstram claramente o papel da JarC, uma ECD-disintegrina, inibindo a migração de células endoteliais. Este efeito foi reproduzido pela proteína recombinante, confirmando a sua atividade biológica preservada. Uma proteína com ação inibitória da migração de células endoteliais pode ser uma ferramenta promissora para tratar patologias que tenham a angiogênese como mecanismo central, como por exemplo a degeneração macular relacionada à idade ou ainda o crescimento de tumores.

Efeito da Jararagina-C, uma proteína tipo-disintegrina do veneno de Bothrops jararaca, sobre um modelo experimental in vitro de cicatrização / Effects of Jararhagin-C, a disintegrin-like molecule from Bothrops jararaca venom, on wound healing experimental model

There are a number of specific integrins that anchor endothelial cells to extracellular matrix components, modulating events during angiogenesis and wound healing process. Jararhagin-C is a disintegrin-like molecule containing an ECD sequence isolated from Bothrops jararaca venom which can inhibit platelet aggregation. Endothelial cells in turn express different integrins on its surface according to the environment. This study aimed to investigate the effects of jararhagin-C on human vascular endothelial cells (HUVEC) during initial events related to wound healing process. Firstly it was verified the binding capacity of jararhagin-C on HUVECs through inhibition of cell adhesion assay. Suspensions of HUVECs were incubated with jararhagin-C and seeded on well plates pre-coated with collagen I, IV or fibronectin on its surface. It was not observed a statistic significance decrease in adhesion cells to matrix extracellular. The cell migration assay was performed on HUVECs monolayer in model of wound healing experiment. The cells were grown on collagen I and IV surfaces. After 24 hours of jararhagin-C treatment, cells were stained and analyzed by optical microscope. This molecule induced cell migration on both substrates however the 100% confluence of cells inside the scraped line was observed only with collagen I. The proliferative activity was evaluated by endothelial cells cultivated on collagen I, IV or fibronectin substrate and jararhagin-C treated. The proliferation assay was performed by BrdU method. Jararhagin-C does not interfere in the proliferative capacity of these cells. Finally we analyzed the timecourse of 9 genes involved in the wound healing process. The gene expression was evaluated by Real-time PCR on HUVECs previously adhered to collagen treated by jararhagin-C and compared with a control group of cells treated with PBS. The fold change (Fc) was calculated by ΔΔct equation. At the time interval of 3 hours we observed up-regulation of IL-6, CXCL-6, and MMP-10 (Fc = 3.0; 1.8 and 2.5 respectively) and IL-8 was down-regulated (Fc = -0,7). At 6 hours the genes ESelectin, I-CAM-1, V-CAM, IL-8, Angiopoetin-2 and MMP-10 were up-regulated (FC = 6.0; 7.0; 1,5; 2.0; 2.5 and 2.0 respectively) while IL-6 was down regulated (Fc = -0.5). At 24 hours we observed down regulation of IL-8, CXCL-6 and CD-69 (Fc= -0.5; -0.3 and -0.4 respectively). Our results suggest that jararhagin-C can bind to endothelial cells growing on collagen I surface. Jararhagin-C can modulate HUVEC migration on collagen I and IV surfaces. However this molecule by itself is not able to induce endothelial cells proliferation on these substrates. Jararhagin-C induces upregulation of genes expressed by endothelial cells involved with wound healing process. The jararhagin-C ability to bind to integrin α2β1, as well as collagen, is probably the responsible by the effects observed here.

Integrinas específicas ancoram as células endoteliais aos componentes da matriz extracelular, modulando eventos durante os processos de angiogênese e cicatrização. Jararagina-C (JAR-C) é uma molécula tipo-disintegrina, que contém uma sequência ECD, isolado a partir do veneno de Bothrops jararaca, e age na inibição da agregação plaquetária. As células endoteliais, por sua vez expressam diferentes integrinas na sua superfície de acordo com o ambiente. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do JAR-C nas células endoteliais vasculares humanas (HUVEC) durante os eventos iniciais do processo de cicatrização. Primeiramente, verificamos a capacidade de ligação da JAR-C em HUVECs através de ensaio de inibição da adesão celular. Não observamos nenhuma diminuição estatisticamente significativa na adesão das células ao colágeno I, sugerindo que a JAR-C se liga às HUVECs. Realizamos o ensaio de migração celular em monocamada de HUVECs no modelo experimental de cicatrização de feridas, onde as células foram cultivadas no substrato de colágeno I e IV. Após 24 horas de tratamento com JAR-C, as células foram coradas e analisadas por microscopia óptica. Observamos que esta molécula induziu a migração celular em ambos os substratos, entretanto a confluência de 100% das células no interior da linha raspada ocorreu apenas sobre o substrato de colágeno I. Avaliamos a atividade proliferativa nas células endoteliais cultivadas nos substratos de colágeno I, IV ou fibronectina e tratadas com JAR-C. O ensaio de proliferação foi realizado pelo método de BrdU. Observamos que a JAR-C não interferiu na capacidade proliferativa destas células. Verificamos então a curva tempo-resposta de 9 genes envolvidos no processo de cicatrização. A expressão gênica foi avaliada por PCR em tempo real em HUVEC cultivadas em colágeno e tratada com JAR-C, e comparado a um grupo controle tratado com PBS. O fold change (Fc) foi calculado pela equação de ΔΔct. No intervalo de tempo de 3 horas observamos uma regulação positiva de IL-6, CXCL-6 e MMP-10 (Fc = 3,0; 1,8 e 2,3, respectivamente) e regulação negativa de IL-8 (Fc = - 15 0,7). Após 6 horas os genes de E-selectina, I-CAM-1, V-CAM-1, IL-8, Angiopoetina-2 e MMP-10 também foram regulados positivamente (Fc = 6,0; 7,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 2,0, respectivamente), enquanto IL-6 foi regulado negativamente (Fc = -0,5). Em 24 horas observamos a regulação negativa de IL-8, CXCL-6 e CD-69 (Fc = -0,5, -0,3 e - 0,4, respectivamente). Os nossos resultados sugerem que a JAR-C pode ligar-se a células endoteliais que crescem sobre a superfície de colágeno I. A JAR-C modula a migração HUVEC sobre os substratos de colágeno I e IV. No entanto, esta molécula não induz a proliferação de células endoteliais sobre estes substratos. A JAR-C induz uma regulação positiva de genes expressos por células endoteliais envolvidos com o processo de cicatrização. A capacidade da JAR-C em ligar-se a integrina α2β1, bem como ao colágeno, é, provavelmente, responsável pelos efeitos aqui observados.