Riesgo de contaminación por Cronobacter Sakazakii en leches en polvo para la nutrición de lactantes / Risk of Cronobacter Sakazakii contamination in powdered milk for infant nutrition

Introduction: Cronobacter spp. is a bacterial genus that includes 7 species; Cronobacter sakazakii is the clinical specie that is the most reported and associated with meningitis and septicemia in infants. Given that it is transmitted by powdered infant formula (PIF), the WHO recommends that this product be free of Cronobacter, whereas the Chilean Food Sanitary Regulation (RSA) does not consider it. Objective: To assess the risk of C. sakazakii in PIF for consumption by infants. Methodology: A total of 72 PIF samples were analyzed using three brands originating from three countries. Aerobic plate count (APC), Enterobacteriaceae (ENT), and most probable number (MPN) were performed using the methodology described by Puch and Ito (2001). Cronobacter differential agar was used to isolate strains (DFI, Oxoid, England), and the ID32E biochemical kit (Biomeriux, France) was used for phenotyping. The pathogen was identified and genotyped by multilocus sequence typing (MLST) based on the criteria found at http://www.pubmlst.org/cronobacter. Results: Median APC for step 1 and preterm PIF was 300 CFU/g (10-36 000) and 650 CFU (70-30 000), respectively and was higher in Chilean PIF (p=0.016). There were no significant differences for type, country or PIF brand in 75 CFU/g (10-36 000) and 200 CFU/g (10-1 000) ETN (p>0.05). Two strains from two different lots with characteristic strains in DFI agar were identified as C. sakazakii with 0.23 and 2.3 MPN/g. In addition, Franconibacter helveticus, specie closely related to Cronobacter spp, was found in two other strains. Conclusions: The prevalence of Cronobacter sakazakii in all the samples was 2.7% isolated only in PIFs manufactured in Chile. The absence of Cronobacter spp in 25 g must be included in the Chilean RSA.

Introducción: Cronobacter spp es un género bacteriano con 7 especies, siendo C. sakazakii la especie clínica más reportada y asociada a meningitis y septicemia en lactantes. Es transmitida por leche en polvo (LP) por lo que la OMS recomienda su ausencia en este producto. En Chile, el reglamento sanitario de los alimentos (RSA) no lo considera. Objetivo: Evaluar el riesgo por Cronobacter sakazakii en LP destinadas al consumo de lactantes. Metodología: Se analizaron 72 muestras de LP de 3 marcas y 3 países. El recuento de bacterias mesófilas (RAM), Enterobacteriaceae (ENT) y número más probable (NMP) se realizó con la metodología de Puch and Ito (2001). Se utilizó agar diferencial Cronobacter para aislamiento (DFI, Oxoid, England) y kit bioquímico ID32E (Biomeriux, Francia) para fenotipo. El patógeno fue identificado y genotipificado por multilocus sequence typing (MLST) utilizando criterios de http://www.pubmlst.org/cronobacter. Resultados: La medianas de RAM para LP etapa 1 y prematuros fueron 300 UFC/g (10-36 000) y 650 UFC/g (70-30 000), siendo mayor en las muestras de Chile (p=0,016). Para ENT de 75 UFC/g (10-1 060) y 200 UFC/g (30-1 000), no existiendo diferencias significativas por tipo, país o marca de LP (p>0,05). Dos cepas de 2 lotes diferentes características en agar DFI se identificaron como C. sakazaki con 0,23 y 2,3 NMP/g. Además de Franconibacter helveticus en otras 2 cepas, especie relacionada estrechamente con Cronobacter spp. Conclusiones: La prevalencia de C. sakazakii en todas las muestras fue de 2,7% y aisló sólo en LP de elaborados en Chile. La ausencia de Cronobacter spp en 25 g debe ser incorporado en el RSA de Chile.

Presencia de los genes de toxigenicidad nheA, nheBy nheC en cepas de Bacillus cereus aisladas de leches deshidratadas en Costa Rica / Detection of toxigenic genes nheA, nheB and nheC in Bacillus cereus strains isolated from powdered milk samples in Costa Rica

La leche en polvo es un producto de alto consumo humano que no precisa de ser conservado en frío, no obstante, diversos microorganismos pueden deteriorarlo. En la población costarricense, también se observa este alto consumo, por la facilidad del alimento para transporte, preparación y su costo competitivo. Bacillus cereus es una bacteria potencialmente patógena asociada a este tipo de producto, capaz de desarrollar toxinas dependiendo de la presencia o ausencia de los respectivos genes codificantes. En este estudio se determinó la presencia de los genes toxigénicos nheA, nheB y nheC en cepas de B. cereus aisladas de leche deshidratada vendida en el mercado nacional costarricense.Se examinaron cinco lotes diferentes, de diez marcas comerciales de leche en polvo distribuidos en el área metropolitana de San José Costa Rica. Se procedió a cuantificar B. cereus en las muestras de leche en polvo mediante la técnica de Número Más Probable (NMP) e identificar los aislamientos utilizando el equipo automatizado Vitek®. Adicionalmente, se determinó la presencia de los genes nheA, nheB y nheC mediante la técnica de PCR. La frecuencia de aislamiento de Bacillus cereus en las muestras de leche en polvo analizadas alcanzó un 50%, con cantidades que oscilaron entre 3 y >100 NMP/g. Se recuperaron 19 cepas de B. cereus aisladas, cinco fueron positivas para los tres genes toxigénicos, lo cual revela la presencia de B. cereus potencialmente toxigénico en leches deshidratadas del mercado nacional, lo que representa un riesgo para la salud pública.

Powdered milk is a frequently consumed product that does not need to be kept under cold conditions. Nevertheless, different microorganisms may contaminate it. Powdered milk is a highly consumed product by Costa Rican population, and Bacillus cereus is a potentially pathogenic bacteria associated to it, with the ability to develop toxins depending on the presence of the respective codifying genes. The aim of this study was to determine the presence of the toxigenic genes nheA, nheB and nheC from B. cereus strains, found in powdered milk sold at the Costa Rican national market. Five different lots of ten brands of powdered milk, distributed in the metropolitan area of San José, Costa Rica were analyzed. B cereus load was quantified using the Most Probable Number technique and identified using the Vitek® system. The presence of the toxigenic genes was determined using the PCR technique. The isolation frequency of this bacteria in the powdered milk samples analyzed reached 50%, with populations ranging from 3 to >100 MPN/g. Five out from nineteen strains were found positive for the three toxigenic genes, indicating contamination with potentially toxigenic B. cereus in powdered milk distributed in the national market, and an important risk for public health.

Primer estudio de Enterobacter sakazakii en alimentos en Cuba / First study on Enterobacter sakazakii in foodstuffs in Cuba

Enterobacter sakazakii es uno de los microorganismos patógenos emergentes que han hecho su aparición en los últimos años, fundamentalmente como contaminante ocasional de las fórmulas infantiles en polvo. En países en vías de desarrollo no existen suficientes investigaciones sobre este microorganismo, en Cuba este constituye el primer estudio realizado. Conocer la presencia de E. sakazakii en muestras de leche en polvo de importación. Se analizaron 60 muestras de leche en polvo, entera y descremada, provenientes de nueve países, se siguió la técnica recomendada por autoridades reguladoras de EE.UU., con la inclusión de pruebas bioquímicas convencionales como alternativa antes de aplicar el sistema de identificación API 20E. Se empleó el agar hierro Kligler y el agar citrato de Simmons; en aquellas cepas con imagen sugestiva de Enterobacter se comprobó la obtención de triptofano a partir de indol, reacción de Voges Proskauer y rojo de metilo, descarboxilación de lisina y ornitina, dihidrólisis de la arginina, producción de ácido de sacarosa, dulcitol, adonitol, rafinosa y sorbitol. Se obtuvo crecimiento de enterobacterias en 26 muestras. Una sola cepa dio resultado presuntivo de E. sakazakii por pruebas bioquímicas, la misma se confirmó por API 20E para 1,6 por ciento de positividad. En general la calidad microbiológica de las muestras de leche estudiadas fue buena. La técnica empleada para determinar E. sakazakii en muestras de leche en polvo, con la inclusión de pruebas bioquímicas convencionales, es factible de realizar en Cuba, para minimizar los costos asociados a la utilización de API 20E. Sería importante continuar estos estudios en áreas hospitalarias, especialmente aquellas donde se preparan fórmulas lácteas para recién nacidos.

Enterobacter sakazakii is an emerging pathogen that has been isolated in milk powder preparations for infant in the last few years. Practically there is no research works about this microorganism in developing countries; in Cuba this is the first study. To detect the presence of E. sakazakii in imported milk powder samples. Sixty samples of whole and skimmed powdered milk imported from 9 countries were analyzed. Before applying API 20E Kit, the recommended technique by US regulatory bodies including conventional biochemical tests was used. Kligler´s iron agar and Simmons´s citrate agar were employed; other tests such as obtaining of triptophane from indole, Voges Proskauer reaction, methyl red, lysine and ornitine decarboxylation, arginine dihydrolysis, production of sucrose acid, dulcit, adonit, raffinose and sorbitol were performed in presumptive Enterobacter strains. Enterobacteria were isolated in 26 samples. Just one strain was classified as E. sakasakii using the traditional biochemical tests and further confirmed by API 20E for 1.6 percent possitivity of the sample. Generally speaking, the microbiological quality of powered milk samples was good. The technique used to determine E. sakazakii in powered milk samples, including conventional biochemical tests, is feasible to be performed in Cuba in order to reduce costs inherent to the use of API 20E. It is important to conduct these studies in hospital settings, particularly in those areas where milk formulae for neonates are prepared.

Primer estudio de Enterobacter sakazakii en alimentos en Cuba / First study on Enterobacter sakazakii in foodstuffs in Cuba

Enterobacter sakazakii es uno de los microorganismos patógenos emergentes que han hecho su aparición en los últimos años, fundamentalmente como contaminante ocasional de las fórmulas infantiles en polvo. En países en vías de desarrollo no existen suficientes investigaciones sobre este microorganismo, en Cuba este constituye el primer estudio realizado. Conocer la presencia de E. sakazakii en muestras de leche en polvo de importación. Se analizaron 60 muestras de leche en polvo, entera y descremada, provenientes de nueve países, se siguió la técnica recomendada por autoridades reguladoras de EE.UU., con la inclusión de pruebas bioquímicas convencionales como alternativa antes de aplicar el sistema de identificación API 20E. Se empleó el agar hierro Kligler y el agar citrato de Simmons; en aquellas cepas con imagen sugestiva de Enterobacter se comprobó la obtención de triptofano a partir de indol, reacción de Voges Proskauer y rojo de metilo, descarboxilación de lisina y ornitina, dihidrólisis de la arginina, producción de ácido de sacarosa, dulcitol, adonitol, rafinosa y sorbitol. Se obtuvo crecimiento de enterobacterias en 26 muestras. Una sola cepa dio resultado presuntivo de E. sakazakii por pruebas bioquímicas, la misma se confirmó por API 20E para 1,6 por ciento de positividad. En general la calidad microbiológica de las muestras de leche estudiadas fue buena. La técnica empleada para determinar E. sakazakii en muestras de leche en polvo, con la inclusión de pruebas bioquímicas convencionales, es factible de realizar en Cuba, para minimizar los costos asociados a la utilización de API 20E. Sería importante continuar estos estudios en áreas hospitalarias, especialmente aquellas donde se preparan fórmulas lácteas para recién nacidos(AU)

Enterobacter sakazakii is an emerging pathogen that has been isolated in milk powder preparations for infant in the last few years. Practically there is no research works about this microorganism in developing countries; in Cuba this is the first study. To detect the presence of E. sakazakii in imported milk powder samples. Sixty samples of whole and skimmed powdered milk imported from 9 countries were analyzed. Before applying API 20E Kit, the recommended technique by US regulatory bodies including conventional biochemical tests was used. Kligler´s iron agar and Simmons´s citrate agar were employed; other tests such as obtaining of triptophane from indole, Voges Proskauer reaction, methyl red, lysine and ornitine decarboxylation, arginine dihydrolysis, production of sucrose acid, dulcit, adonit, raffinose and sorbitol were performed in presumptive Enterobacter strains. Enterobacteria were isolated in 26 samples. Just one strain was classified as E. sakasakii using the traditional biochemical tests and further confirmed by API 20E for 1.6 percent possitivity of the sample. Generally speaking, the microbiological quality of powered milk samples was good. The technique used to determine E. sakazakii in powered milk samples, including conventional biochemical tests, is feasible to be performed in Cuba in order to reduce costs inherent to the use of API 20E. It is important to conduct these studies in hospital settings, particularly in those areas where milk formulae for neonates are prepared(AU)

Reacción en cadena de la polimerasa para la detección de Salmonella sp. en leche en polvo: optimización del método en 12 horas / Polimerase chain reaction technique for detecting Salmonella sp. in powdered milk: optimization of the method in 12 hours

Los métodos tradicionales para identificar Salmonella sp. se basan en el empleo de medios de cultivo que permiten la recuperación del microorganismo, el aislamiento en medios selectivos, la identificación bioquímica y caracterización serológica. Estos métodos son dispendiosos, tienen baja especificidad, baja sensibilidad y consumen mucho tiempo. El principal objetivo de este trabajo fue estandarizar y optimizar la técnica de PCR para detectar Salmonella sp. en 12 horas, a partir de ADN de cultivos puros y en muestras de leche en polvo, inoculadas intencionalmente con 200, 20 y 2 UFC/mL. Para la extracción del ADN se estudió la conveniencia de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y Chelex® 100. La temperatura de hibridización y las concentraciones de cloruro de magnesio, empleando un diseño factorial incompleto 6x7, permitieron establecer un límite de detección de hasta 10 pg de ADN en cultivos puros de Salmonella typhi. La PCR se basó en la exclusividad de los oligonucleótidos 139-141, los cuales amplificaron una banda de 284 pb para la identificación de género. Los resultados muestran que: (I) la adición de Novobiacina (45 mg/L) o de verde brillante (10 mg/L) como inhibidores de flora acompañante, después de las primeras tres horas del pre-enriquecimiento no selectivo de 6 horas, no influye significativamente en la recuperación de las células bacterianas; (II) obtener biomasa de la primera dilución en base 10 y emplear la técnica de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico para la obtención de ADN, se pueden detectar 2 UFC/mL de Salmonella sp. en leche en polvo y que el tiempo de detección se reduce considerablemente...

The traditional methods to identify Salmonella sp. are based on the culture medium use that allows the recovery of the micro organism, isolation in selective media, biochemical and serologic characterization. These methods are tedious, have a low specificity and sensitivity and they generally consume a long time. The main objective of this study was to standardize and to optimize the PCR technique to detect Salmonella sp. in 12 hours, from DNA of pure cultures and from powdered milk samples, intentionally inoculated with 200, 20 and 2 CFU/mL. For the extraction of DNA, two methods were used: phenol:chloroform:isoamyl alcohol and chelex® 100. The optimization of the temperature of hibridización and the concentrations of Magnesium Chloride, using an incomplete factorial desing 6x7 allowed to establish a detection limit of up to 10 pg of DNA from pure cultures of Salmonella typhi. The PCR was based on the specificity of oligonucleotidos the 139-141, that amplified a band of 284 pb for the gender identification. The results show that: (I) the inhibitor addition of accompanying flora like Novobiocin (45 mg/L) or brilliant green (10 mg/L) as inhibitors of accompanying flora, after the first three hours in the nonselective pre-enrichment of 6 hours, does not significantly influence in the recovery of the bacterial cells, (II) when obtaining biomass of the first dilution in base 10 and using the phenol:chloroform:isoamyl alcohol technique for the extraction of DNA; can be detected 2 CFU/mL Salmonella s.p. from powdered milk and that the PCR technique reduces the time of test considerably...