Efecto de la ausencia de suero fetal bovino sobre la morfología y organelas de células fibroblásticas / Effect of the absence of fetal bovine serum on the morphology and organelles of fibroblast cells

RESUMEN Los fibroblastos son células constituyentes de los tejidos conectivo. Los fibroblastos gingivales (FGs), células responsables de la síntesis de la matriz extracelular (MEC) en el tejido conectivo gingival, participan en la regulación de los procesos de cicatrización y de reparación de la encía. Debido a su potencial regenerativo, los FGs podrían ser células capaces de contribuir a mejorar los procesos de cicatrización, a nivel local y sistémico e, incluso, ser utilizadas como un modelo celular útil en la comprensión de los aspectos fisiopatológicos de la cavidad oral. El objetivo del presente trabajo fue describir el impacto de la concentración del suero fetal bovino (SFB), en la supervivencia, el crecimiento y la expresión de marcadores celulares en los FGs. Cultivos celulares de FGs fueron realizados durante 7 días, utilizando medio de cultivo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's médium), en ausencia y presencia de 10% de SFB. Análisis morfológicos e inmunohistoquímicos de la actina, mitocondrias, lisosomas y retículo endoplasmático (RE) fueron usados para evaluar el impacto de la concentración del SFB sobre los FGs. Los resultados indican que los FGs cultivados en presencia de 10% de SFB tuvieron una tasa de crecimiento más elevada en comparación con los FGs, cultivados en ausencia de SFB. El marcaje de los elementos celulares indica la ausencia de alteraciones en las organelas celulares de los FGs, cuando son cultivados en ausencia de SFB. En conclusión, los FGs son capaces de sobrevivir, proliferar y conservar sus características morfológicas, cuando son cultivados en presencia y ausencia de SFB.

ABSTRACT Fibroblasts are constituent cells of connective tissues. Gingival fibroblasts (GFs), cells responsible for the synthesis of the extracellular matrix (ECM) in the gingival connective tissue, participate in the regulation of healing and repair processes of the gingiva. Due to their regenerative potential, GFs could be cells capable of contributing to improve the healing processes at the local and systemic level and even be used as a useful cellular model in understanding of the physiopathological aspects of the oral cavity. The aim of the present work was to describe the impact of the concentration of fetal bovine serum (FBS) on the survival, growth and expression of cell markers in GFs. Cell cultures of GFs were performed for 7 days using DMEM culture medium (Dulbecco's Modified Eagle's medium) in the absence and presence of 10% FBS. Morphological and immunohistochemistry analyzes of actin, mitochondria, lysosomes and endoplasmic reticulum (ER) were used to evaluate the impact of FBS concentration on GFs. The results indicate that GFs cultured in the presence of 10% FBS had a higher growth rate compared to GFs cultured in the absence of FBS. The marking of the cellular elements indicates the absence of alterations in the cellular organelles of the GFs when they are cultured in the absence of FBS. In conclusion, GFs are capable to surviving, proliferating and conserving their morphological characteristics when they are cultured in the presence and absence of FBS.

Cultivo de células epiteliales dentales: impacto del suero fetal bovino / Culture of dental epithelial cells: impact of fetal bovine serum

RESUMEN Objetivo. Describir la influencia del Suero Fetal Bovino (SFB) en la supervivencia, crecimiento y expresión de organelas celulares en las células epiteliales dentales de rata. Materiales y métodos. Cultivos de células epiteliales dentales de rata fueron llevados a cabo a 37°C en una atmosfera húmeda, en ausencia y a una concentración de 10% de SFB. Una evaluación morfológica fue realizada durante la proliferación y confluencia de las células en cultivo. Dobles marcajes por inmunofluorencia fueron efectuados haciendo uso de anticuerpos anti-actina, anti-TOMM20 y anti-LAMP1. Resultados. Se evidenciaron células epiteliales dentales circulares u ovoides con núcleos voluminosos durante la proliferación y confluencias de manera similar en las células cultivas en presencia y ausencia de SFB. La carencia de SFB impactó negativamente la proliferación de las células epiteliales. No fueron observadas alteraciones en la localización de los inmunomarcajes anti-actina, anti-TOMM20 y anti-LAMP1 en las dos condiciones de cultivos experimentales. Conclusiones. La supresión del SFB en el cultivo de células epiteliales dentales de rata disminuyó la supervivencia, proliferación y sugiere no tener un impacto sobre las organelas evaluadas.

ABSTRACT Objective. Describe the influence of Fetal bovine serum (FBS) on the survival, growth and expression of cellular organelles in rat dental epithelial cells. Material and methods. Cell cultures of rat dental epithelial cells were carried out at 37°C in a humid atmosphere, in the absence and at a concentration of 10% FBS. Morphological evaluation was performed during the proliferation and confluence of cell in culture. Double immunofluorescence labels were made using anti-Actin, anti-TOMM20A, and anti-LAMP1 antibodies. Results. Circular or ovoid dental epithelial cells with bulky nuclei were evidenced during proliferation and confluences in a similar manner in culturing cells in the presence and absence of FBS. The lack of FBS negatively impacts the proliferation of epithelial cells. No alterations were observed in the localization of the anti-actin, anti-TOMM20 and anti-LAMP1 immunomarkers in both conditions of experimental cultures. Conclusion. FBS suppression in rat dental epithelial cells decreased survival, proliferation and suggests not having an impact on the organelles evaluated.

Expresión inmunohistoquímica de la proteína de membrana asociada a lisosomas en ameloblastos de ratones

Introducción: La formación del esmalte dental comprenden cambios morfofuncionales de los ameloblastos. Estas modificaciones involucran la participación activa de organelas celulares, entre ellas los lisosomas. Objetivo: Identificar la distribución de la proteína de membrana asociada a lisosomas en los ameloblastos. Materiales y métodos: Incisivos en crecimiento continuo de ratones con edades de 7, 14 días y células epiteliales dentales de rata fueron utilizadas para identificar la proteína de membrana asociada a lisosomas tipo 1 (Lamp1) mediante la técnica de inmunohistoquímica. Resultados: Un marcaje citoplasmático de Lamp1 fue identificado en las células ameloblásticas durante todas las etapas del proceso de diferenciación de los ameloblastos, independientemente de sus edades. Lamp1 también fue detectado en las células epiteliales dentales. Conclusiones: Se evidencia la expresión de Lamp1 en los ameloblastos en incisivos de crecimiento continuo y células epiteliales dentales de rata. Próximos estudios deberían abordar el rol funcional de Lamp1 en la formación del esmalte.

Introduction: Tooth enamel formation includes morphological changes in ameloblasts. These modifications involve the active participation of cellular organelles, including lysosomes. Objective: To identify the lysosomal membrane protein distribution in ameloblasts. Materials and method: The lysosomal membrane protein type 1 (Lamp 1) was identified in continuous growth incisor from mice (7, 14 days old) and epithelial rat's cells using the immunohistochemistry technic. Results: A cytoplasmic Lamp 1 marker was identified in ameloblast cells during all the stages of the process, no matter the age. Lamp 1 was detected, too, in the epithelial dental cells. Conclusion: It is evident the expression of Lamp 1 in ameloblasts of continuous growth incisor and epithelial dental rat's cells. Next studies must be done about the functional role of Lamp 1 in tooth enamel formation.

Immunohistochemical study of amelogenin binding proteins in an amelogenin point mutation mouse / Estudio inmunohistoquímico de proteínas de unión de la amelogenina en un ratón con mutación puntual de amelogenina

Amelogenin is one of the enamel matrices secreted by ameloblasts. A mutation of the amelogenin gene can cause hereditary dental enamel defects known as amelogenesis imperfecta (AI). Since lysosome-associated membrane protein-1 (LAMP-1), -3 (LAMP-3), and 78kDa glucose-related protein (Grp78) were identified as binding proteins of amelogenin, several studies have suggested the involvement of these binding proteins with the cell kinetics of ameloblasts in normal or abnormal conditions. The purpose of this study is to investigate the distribution of these amelogenin binding proteins in the ameloblast cell differentiation of mice with a point mutation of the amelogenin gene (Amelx*). The incisors of Amelx* mice had a white opaque color and the tooth surface was observed to be rough under a scanning electron microscope. Among the sequential ameloblast cell differentiation in the Amelx* mice, the shape of ameloblasts at the transition stage was irregular in comparison to those in wild-type (WT) mice. Immunostaining of Grp78 revealed that the whole cytoplasm of the transition stage ameloblasts was immunopositive for Grp78 antibody, while only the distal part of cell was positive in the WT mice. Furthermore, in the Amelx* mice, the cytoplasm of the transition stage ameloblasts was immunopositive for LAMP-1 and LAMP-3. These results suggest that Amelx* may cause the abnormal distribution of amelogenin binding proteins in the cytoplasm of ameloblasts.

La amelogenina es una de las matrices de esmalte secretadas por los ameloblastos. Una mutación del gen de amelogenina puede causar defectos hereditarios del esmalte dental conocidos como amelogénesis imperfecta (AI). Dado que la proteína de membrana asociada a lisosoma-1 (LAMP-1), -3 (LAMP-3) y la proteína relacionada con la glucosa de 78 kDa (Grp78) se identificaron como proteína de unión a amelogenina, varios estudios han sugerido la participación de estas proteínas con la cinética celular de los ameloblastos en condiciones normales o anormales. El objetivo del estudio fue investigar la distribución de LAMP-1, LAM-3 y Grp78 durante la diferenciación celular de ameloblastos de ratones con una mutación puntual del gen de amelogenina (Amelx*). Los incisivos de los ratones Amelx* presentaron un color blanco opaco y se observó en microscopio electrónico de barrido que la superficie del diente era áspera. La diferenciación celular secuencial y la forma de los ameloblastos en la etapa de transición en los ratones Amelx* fue irregular en comparación con los ratones silvestres (RS). La inmunotinción de Grp78 reveló que todo el citoplasma de los ameloblastos en etapa de transición fue inmunopositivo para el anticuerpo Grp78, mientras que solo la parte distal de la célula fue positiva en los ratones RS. Además, en ratones Amelx*, el citoplasma de los ameloblastos en etapa de transición fue inmunopositivo para LAMP-1 y LAMP-3. Estos resultados sugieren que Amelx* puede causar distribución anormal de proteínas de unión a amelogenina en el citoplasma de los ameloblastos.

Immunohistochemical study of amelogenin and lysosome-associate membrane proteins (LAMPs) in cartilage / Estudio inmunohistoquímico de la amelogenina y proteínas de membrana asociadas a lisosomas (LAMPs) en el cartílago

Amelogenin is one of the enamel matrix proteins secreted by ameloblasts during enamel formation in tooth development. Recent studies showed that the amelogenin is expressed in chondrocyte. Lysosome-associated membrane proteins (LAMPs) have been identified as binding partner proteins to amelogenin and it has been suggested they act as signaling receptors of amelogenin. The purpose of this study is to clarify the localization of amelogenin and LAMPs in growth plate cartilage and cartilaginous nodules in micromass culture. Mouse knee joints including tibia growth plate at 4 weeks old and micromass cultures of limb bud mesenchymal cells after 2 weeks were fixed in paraformaldehyde, routinely processed, sections were cut and immunostained with amelogenin, collagen type II and type X, LAMP-1 and -3. The positive immunoreaction of amelogenin was observed both in proliferation and hypertrophic zone cartilage of growth plate after enzymatic pretreatment in immunostaining. Furthermore, cartilaginous nodules in micromass culture were immunopositive to amelogenin. The chondrocytes in the proliferation zone of the growth plate were immunopositive to LAMP-1 but weakly stained in the chondrocytes of hypertrophic zone. These observations indicate that amelogenin may be present in cartilage matrix produced in vivo and in vitro and amelogenin may involve cartilage formation through the LAMP-1 signaling pathway.

La amelogenina es una de las proteínas de la matriz del esmalte secretadas por ameloblastos durante la formación del esmalte en el desarrollo dentario. Estudios recientes demuestran que la amelogenina se expresa en los condrocitos. Las proteínas de membrana asociadas a lisosomas (LAMPs) se han identificado como proteínas de unión asociadas a la amelogenina; se ha sugerido que actúan como receptores de señalización de la amelogenina. El propósito de este estudio fue aclarar la localización de la amelogenina y las LAMPs en el cartílago de crecimiento y nódulos cartilaginosos en cultivos de micromasa. Articulaciones de la rodilla del ratón, que incluían la placa de crecimiento tibial de 4 semanas de edad y cultivos de micromasa de células mesenquimales del brote del miembro después de 2 semanas se fijaron en paraformaldehído y procesaron rutinariamente. Los cortes fueron sometidos a inmunotinción con amelogenina, colágeno tipo II y X, LAMP-1 y LAMP-3 . Se observó inmunorreacción positiva de amelogenina tanto en la zona proliferación e hipertrófica del cartílago de crecimiento después del pretratamiento enzimático. Además, los nódulos cartilaginosos en el cultivo de micromasa eran inmunopositivos para la amelogenina. Los condrocitos en la zona de proliferación de la placa de crecimiento fueron immunopositivos a LAMP-1, mientras que los condrocitos de la zona hipertrófica se tiñeron débilmente. Estas observaciones indican que la amelogenina puede estar presente en la matriz del cartílago producida tanto in vivo e in vitro, además la amelogenina puede estar implicada en la formación de cartílago mediante la vía de señalización de LAMP-1.

Análisis morfométrico de lisosomas: marcadores de transformación celular del epitelio mamario / Morphometric analysis of lysosomes: markers of cellular transformation of the mammary epithelium

ANTECEDENTES: Transformación celular es el mecanismo resultante de la potente acción generada por onco-genes transformantes sobre una célula normal, los cuales con la consiguiente expresión de oncoproteínas determinan drásticos cambios tanto en la morfología como en los volúmenes de los componentes celulares, generando una célula con diferente funcionalidad. OBJETIVO: Precisar las modificaciones que caracterizan al mecanismo transformante en células de epitelio mamario transfectado con el oncogén ras (HC1 Iras) en comparación con su tipo celular normal (HC11GM). MÉTODO: Se estudió con microscopía electrónica de transmisión aplicando técnicas morfométricas a estos tipos celulares con énfasis en los lisosomas, cuantificando variaciones del organelo responsable de la digestión celular. RESULTADOS: Todos los parámetros lisosomales evaluados en el tipo celular transformado presentan diferencias significativas con respecto a la célula normal. CONCLUSIÓN: Las drásticas modificaciones experimentadas por los lisosomas se reflejan en la adquisición de nuevas funcionalidades en la célula transformada.

BACKGROUND: Cellular transformation is the result mechanism of powerful action generated by transforming oncogene over a normal cell, which with the subsequent oncoprotein expression leads to drastic changes in morphology as well as in cell components volumes, generating a cell with a different function. OBJECTIVE: To specify the modifications that characterizes the transforming mechanism in mammary epithelial cells transfected with the ras oncogene comparing them with its normal cell type. METHOD: Transmission electronic microscopy using morphometric techniques was applied to this cell types, emphasizing lysosomes variations, trying to clarify its role in each cell type metabolism. RESULTS: Everyone lysosomal parameters examined in transformed cell type present significant differences regarding to the normal cells. CONCLUSION: The drastic changes in lysosomes reflected in the acquisition of new energy requirements and metabolism in the transformed cell.