Cryopreservation of Mycobacterium bovis isolates / Criopreservação de isolados de Mycobacterium bovis

Research, development of new biotechnological methods, diagnostic tests, confirmation of results, and reinvestigations are possible because of the availability of well-preserved living organisms maintained without any changes. Cryopreservation is a simpler, more reliable and long-term stable method for culture maintenance. Storage temperature and composition of the suspending vehicle are factors that affect the viability of mycobacterial strains. Three vehicles and three storage temperatures were evaluated to define a suitable cryoprotective medium for the preservation of Mycobacterium bovis strains. Colonies of sixteen M. bovis isolates were used to prepare the suspensions, which were then added to three vehicles: sterile 0.85% saline solution (SS), Middlebrook 7H9 broth (7H9), and Middlebrook 7H9 broth with sodium pyruvate (7H9p) replacing glycerol. Aliquots of these suspensions were frozen by three different methods, directly in the -20C freezer, directly in the -80C freezer, and at -196C by immersion in liquid nitrogen (LN). The frozen aliquots were thawed at room temperature after 45, 90 and 120 days. Mycobacterial viability was assessed by counting the living cells on plates of Stonebrink medium before and after the freezing procedure. Storage at -20C exhibited a lower recovery of M. bovis compared to storage at -80C (Dunns test, p=0.0018) and LN (Dunns test, p=0.1403), yet –80°C showed better results than LN. All three suspending vehicles showed no statistically significant difference in terms of viability (Friedmans test, p=0.7765). Given the low loss proportion of 5% during storage at –20°C and the high cost equipment required for storage at –80°C and LN, we recommend storage at –20°C or –80°C, when this is available, for preservation of M. bovis field strains.(AU)

Pesquisa, desenvolvimento de novos métodos biotecnológicos, testes diagnósticos, confirmação de resultados e reinvestigações são possíveis por causa da disponibilidade de organismos vivos bem preservados e mantidos inalterados. A criopreservação tem mostrado ser um método de manutenção de cultura mais simples, mais confiável e estável em longo prazo. Temperatura de armazenamento e composição do veículo de suspensão são fatores que afetam a viabilidade de cepas micobacterianas. Três veículos e três temperaturas de armazenamento foram avaliados para definir um meio crioprotetor adequado para preservação de estirpes de Mycobacterium bovis. Colônias de 16 isolados de M. bovis foram usadas na preparação de suspensões, as quais foram adicionadas a três veículos: solução salina a 0,85% estéril, caldo Middlebrook 7H9 (7H9) e caldo Middlebrook 7H9 com piruvato de sódio (7H9p) substituindo o glicerol. Alíquotas dessas suspensões foram congeladas por três métodos diferentes, direto em freezer a -20C, direto em freezer a -80C e a -196C por imersão em nitrogênio líquido (LN). As amostras foram descongeladas a temperatura ambiente após 45, 90 e 120 dias. A viabilidade das micobactérias foi avaliada pela contagem de células vivas em placas com meio Stonebrink, antes e depois dos processos de congelamento. Armazenamento a -20C exibiu menor recuperação de M. bovis comparado a -80C (Teste de Dunn, p=0.0018) e LN (Teste de Dunn, p=0.0352). Não houve diferença entre armazenamento a –80°C e LN (Teste de Dunn, p=0.1403), mas –80°C apresentou melhores resultados do que LN. Os três veículos de suspensão não apresentaram diferença estatística (Teste de Friedman, p=0.7765). Dada à baixa proporção de perda (5%) durante o armazenamento a –20°C e ao alto custo do equipamento necessário para o armazenamento a –80°C, nós recomendamos o armazenamento a –20°C ou –80°C, quando disponível, para a preservação das estirpes de campo de M. bovis.(AU)

Cryopreservation of Mycobacterium bovis isolates / Criopreservação de isolados de Mycobacterium bovis

Research, development of new biotechnological methods, diagnostic tests, confirmation of results, and reinvestigations are possible because of the availability of well-preserved living organisms maintained without any changes. Cryopreservation is a simpler, more reliable and long-term stable method for culture maintenance. Storage temperature and composition of the suspending vehicle are factors that affect the viability of mycobacterial strains. Three vehicles and three storage temperatures were evaluated to define a suitable cryoprotective medium for the preservation of Mycobacterium bovis strains. Colonies of sixteen M. bovis isolates were used to prepare the suspensions, which were then added to three vehicles: sterile 0.85% saline solution (SS), Middlebrook 7H9 broth (7H9), and Middlebrook 7H9 broth with sodium pyruvate (7H9p) replacing glycerol. Aliquots of these suspensions were frozen by three different methods, directly in the -20C freezer, directly in the -80C freezer, and at -196C by immersion in liquid nitrogen (LN). The frozen aliquots were thawed at room temperature after 45, 90 and 120 days. Mycobacterial viability was assessed by counting the living cells on plates of Stonebrink medium before and after the freezing procedure. Storage at -20C exhibited a lower recovery of M. bovis compared to storage at -80C (Dunns test, p=0.0018) and LN (Dunn’s test, p=0.1403), yet –80°C showed better results than LN. All three suspending vehicles showed no statistically significant difference in terms of viability (Friedman’s test, p=0.7765). Given the low loss proportion of 5% during storage at –20°C and the high cost equipment required for storage at –80°C and LN, we recommend storage at –20°C or –80°C, when this is available, for preservation of M. bovis field strains.

Pesquisa, desenvolvimento de novos métodos biotecnológicos, testes diagnósticos, confirmação de resultados e reinvestigações são possíveis por causa da disponibilidade de organismos vivos bem preservados e mantidos inalterados. A criopreservação tem mostrado ser um método de manutenção de cultura mais simples, mais confiável e estável em longo prazo. Temperatura de armazenamento e composição do veículo de suspensão são fatores que afetam a viabilidade de cepas micobacterianas. Três veículos e três temperaturas de armazenamento foram avaliados para definir um meio crioprotetor adequado para preservação de estirpes de Mycobacterium bovis. Colônias de 16 isolados de M. bovis foram usadas na preparação de suspensões, as quais foram adicionadas a três veículos: solução salina a 0,85% estéril, caldo Middlebrook 7H9 (7H9) e caldo Middlebrook 7H9 com piruvato de sódio (7H9p) substituindo o glicerol. Alíquotas dessas suspensões foram congeladas por três métodos diferentes, direto em freezer a -20C, direto em freezer a -80C e a -196C por imersão em nitrogênio líquido (LN). As amostras foram descongeladas a temperatura ambiente após 45, 90 e 120 dias. A viabilidade das micobactérias foi avaliada pela contagem de células vivas em placas com meio Stonebrink, antes e depois dos processos de congelamento. Armazenamento a -20C exibiu menor recuperação de M. bovis comparado a -80C (Teste de Dunn, p=0.0018) e LN (Teste de Dunn, p=0.0352). Não houve diferença entre armazenamento a –80°C e LN (Teste de Dunn, p=0.1403), mas –80°C apresentou melhores resultados do que LN. Os três veículos de suspensão não apresentaram diferença estatística (Teste de Friedman, p=0.7765). Dada à baixa proporção de perda (5%) durante o armazenamento a –20°C e ao alto custo do equipamento necessário para o armazenamento a –80°C, nós recomendamos o armazenamento a –20°C ou –80°C, quando disponível, para a preservação das estirpes de campo de M. bovis.

Manual liquid culture on simple Middlebrook 7H9 or MGIT for the diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis.

OBJECTIVES: To compare the performance of liquid culture on simple Middlebrook 7H9 to the one of manual mycobacterial growth indicator tube (MGIT) and solid culture on Ogawa for the diagnosis of smear-negative tuberculosis (SN-TB) in a high-burden, resource-constrained setting. METHODS: Sputum samples from patients with clinical suspicion of SN-PTB admitted to two-third-level hospitals in Lima between September 2005 and May 2008 were cultured in parallel on simple Middlebrook 7H9, manual MGIT and Ogawa. A case of SN-TB was defined as one with a positive culture in any medium. RESULTS: Among samples from 542 patients, 151 (28%) cases of SN-TB were identified. The sensitivity of Middlebrook 7H9 (0.76, 95% CI 0.69-0.83) was not substantially different from that of MGIT (0.85, 95% CI 0.79-0.91). Ogawa had the lowest sensitivity (0.63, 95% CI 0.55-0.71). The median turnaround time was similar for both liquid media (18 days), and it was shorter than that of Ogawa (30 days). CONCLUSIONS: Culture on simple Middlebrook 7H9 performs almost as well as MGIT, at a probably more affordable cost. Further studies on the cost-effectiveness of this overlooked technique should be performed.