ABSTRACT
Introducción: Nuestro grupo ha reportado previamente una asociación entre sensibilidad a quimioterapia y la expresión de proteínas MDR (P-Gp y MRP1) en líneas celulares y cultivos primarios de cáncer de próstata, quedando por estudiar la actividad de las mismas. Material y métodos: Se utilizó líneas celulares de cáncer de próstata PC3 y DU145. Se evaluaron los niveles de mARN de P-Gp y MRP1 mediante RT-PCR. La expresión de ambas proteínas se determinó mediante inmunofluorescencia. Se estableció un ensayo funcional en base a la acumulación de sustratos fluorescentes (DiOC2(3) para P-gp y CFDA para MRP1) y al uso de inhibidores específicos para cada proteína (Ciclosporina A para P-Gp y MK571 para MRP1). Las células se incubaron durante 60 minutos a 37ºC con o sin el inhibidor específico, seguido de otra incubación por 60 minutos agregando el sustrato fluorescente. La acumulación del sustrato fluorescente se determinó por citometría de flujo. Resultados: Las líneas celulares utilizadas sólo expresaron MRP1, mientras no se detectó P-Gp (mARN ni proteína). Mediante el ensayo funcional se observó que las células acumulaban más CFDA cuando eran tratadas con MK571. No se observó diferencias en la acumulación de DiOC(2)3 frente al tratamiento con Ciclosporina A. Conclusión: La mayor acumulación intracelular de CFDA frente al tratamiento con MK571 indica que la proteína MRP1 expresada en las líneas celulares utilizadas es funcional. P-Gp no se expresa en las líneas evaluadas. En estudios en curso nos encontramos evaluando la expresión y función de ambas proteínas en cultivos primarios.
Introduction: We have previously reported an association between sensitivity to chemotherapy and the expression of multidrug resistance proteins (MDR) (P-Gp and MRP1) in cell lines and primary cultures of prostate cancer. Activity remains to be studied. Material and methods: Prostate cancer cell lines PC3 and DU145 were used. Levels of mRNA of P-Gpand MRP1 using RT-PCR, were evaluated. The expression of both proteins was determined using immunofluorescence. A functional assay based on the accumulation of fluorescence substrates (DiOC2(3) for P-Gp and CFDA for MRP1) was established. Cells were incubated for 60 minutes at 37C with/without the specific inhibitor, followed by another 60 minutes incubation adding the fluorescence substrate. Accumulation of fluorescence substrate was determined by flow citometry. Results: Cell lines expressed only MRP1, whereas P-Gp (mRNA/protein) was not detected. Using the functional assay, we found that cells accumulated more CFDA when treated with MK571. No differences were seen in the accumulation of DiOC2(3) after treatment with ciclosporin A. Conclusion: The higher intracellular accumulation of CFDA after treatment with MK571 indicates that the MRP1 protein expressed in these cell lines is functional. P-Gp was not expressed in these cell lines. We are currently evaluating the expression and function of both proteins in primary cultures.