Saccharomyces cerevisiae OS303 expression of an alkaline protease from a newly isolated Bacillus subtilis D9 / Expressão de Saccharomyces cerevisiae OS303 de uma protease alcalina de um Bacillus subtilis D9 recém-isolado

The aim of this study was to produce high yield of a local bacterial alkaline protease in the yeast system because the scientific involvement of microorganisms in enzyme production is still not given enough attention in Saudi Arabia. Soil samples were collected from the rhizosphere of some desert plants in Saudi Arabia. Ninety-three alkaline protease producing bacterial isolates were recovered on skimmed-milk agar at pH 9.4 and 45°C for 48 hr. Isolate D9 obtained from the rhizosphere of Heliotropium digynum at Dhahran City was the most potent isolate in respect to enzyme productivity (184.6 U/ml). The full gene of alkaline protease was amplified and showed the expected size (1300 bp). Restriction enzymes analysis also verified the integrity of the PCR product. The sequence of the protease gene revealed an open reading frame of 1329 nt correspond to the full length of the protease gene of isolate D9 encoding a 443 aa protein. After ligation of the amplified gene by the TA cloning method, digestion with appropriate restriction enzymes confirmed the integrity of the cloned gene. The insert was prepared by two PCRs that were conducted with a pair of primers specifically designed for this purpose. The digested and purified cloning vector pRS426/GAL1p-207-Glu-MS was ligated with the insert then transformed into various strains of Saccharomyces cerevisiae via the electroporation method. Maximum protease expression was done by recombinant OS303 in galactose containing media (145.5 U/ml) with an approximately 2-fold increase when compared with the wild OS303 strain., this may be due to ability to activate gal operon.

O objetivo deste estudo foi produzir alto rendimento de uma protease alcalina bacteriana local no sistema de leveduras, já que o envolvimento científico de microrganismos na produção de enzimas ainda não recebe atenção suficiente na Arábia Saudita. Amostras de solo foram coletadas da rizosfera de algumas plantas do deserto na Arábia Saudita. Noventa e três isolados bacterianos produtores de protease alcalina foram recuperados em ágar de leite desnatado a pH 9,4 e 45°C por 48 horas. O isolado D9 obtido da rizosfera de Heliotropium digynum na cidade de Dhahran foi o mais potente em relação à produtividade da enzima (184,6 U/ml). O gene completo da protease alcalina foi amplificado e apresentou o tamanho esperado (1300 pb). A análise de enzimas de restrição também verificou a integridade do produto de PCR. A sequência do gene da protease revelou uma fase de leitura aberta de 1329 nt, correspondendo ao comprimento total do gene da protease do isolado D9 que codifica uma proteína 443 aa. Após a ligação do gene amplificado pelo método de clonagem TA, a digestão com enzimas de restrição apropriadas confirmou a integridade do gene clonado. A inserção foi preparada por dois PCRs que foram conduzidos com um par de primers projetados especificamente para esta finalidade. O vetor de clonagem digerido e purificado pRS426/GAL1p-207-Glu-MS foi ligado com a inserção e então transformado em várias cepas de Saccharomyces cerevisiae por meio do método de eletroporação. A expressão máxima da protease foi feita por OS303 recombinante em meio contendo galactose (145,5 U/ml) com um aumento de aproximadamente duas vezes quando comparado com a cepa OS303 selvagem, e isso pode ser por causa da capacidade de ativar o operon gal.

Different feeding habits influence the activity of digestive enzymes in freshwater fish / Diferentes hábitos alimentares influenciam a atividade das enzimas digestivas em peixes de água doce

The aim of this study was to verify the activity of some digestive enzymes in four fish species with different feeding habits. Knowledge of these enzymatic activities can help us to understand the species" digestive processes. The species chosen for this study were Ctenopharyngodon idella (herbivore), Rhamdia quelen (omnivore), Leporinus obtusidens (omnivore) and Hoplias malabaricus (carnivore). The digestive tract of these species was divided into four portions to estimate enzymatic activity: stomach, anterior, mid and posterior intestine. Ctenopharyngodon idella had the highest amylase and maltase activities in all portions of the gut, followed by L. obtusidens . The highest trypsin activity was observed in all gut portions of H. malabaricus, followed by the mid intestine of L. obtusidens and the anterior intestine of C. idella . The highest chymotrypsin activity was found in all portions of C. idella followed by the anterior intestines of R. quelen, L. obtusidens and H. malabaricus . In the stomach, acid protease activity was significantly lower in R. quelen and L. obtusidens compared to H. malabaricus. Ctenopharyngodon idella showed high activity of enzymes that hydrolyze carbohydrates, represented in this study by amylase and maltase and H. malabaricus showed higher protease activity and low amylase activity. (AU)

O objetivo deste estudo foi verificar a atividade de algumas enzimas digestivas em quatro espécies de peixes com hábitos alimentares diferentes. O conhecimento das atividades dessas enzimas pode nos ajudar a compreender os processos digestivos das espécies. As espécies escolhidas para este estudo foram Ctenopharyngodon idella (herbívoro), Rhamdia quelen (onívoro), Leporinus obtusidens (onívoro) e Hoplias malabaricus (carnívoro). O trato digestivo dessas espécies foi dividido em quatro partes para estimar a atividade enzimática: estômago, intestino anterior, médio e posterior. Ctenopharyngodon idella teve a maior atividade da amilase e maltase em todas as porções do intestino, seguido por L. obtusidens . A maior atividade da tripsina foi observada em todas as porções do intestino de H. malabaricus , seguido pelo intestino médio de L. obtusidens e o intestino anterior de C. idella . A maior atividade de quimotripsina foi encontrada em todas as partes do intestino do C. idella , seguida pelo intestino anterior de R. quelen, L. obtusidens e H. malabaricus . No estômago, a atividade de protease ácida foi significativamente menor em R. quelen e L. obtusidens comparado com H. malabaricus. Ctenopharyngodon idella mostrou alta atividade de enzimas que hidrolisam carboidratos, representadas neste estudo por amilase e maltase e H. malabaricus mostrou maior atividade de proteases e baixa atividade de amilase. (AU)

Different feeding habits influence the activity of digestive enzymes in freshwater fish / Diferentes hábitos alimentares influenciam a atividade das enzimas digestivas em peixes de água doce

The aim of this study was to verify the activity of some digestive enzymes in four fish species with different feeding habits. Knowledge of these enzymatic activities can help us to understand the species" digestive processes. The species chosen for this study were Ctenopharyngodon idella (herbivore), Rhamdia quelen (omnivore), Leporinus obtusidens (omnivore) and Hoplias malabaricus (carnivore). The digestive tract of these species was divided into four portions to estimate enzymatic activity: stomach, anterior, mid and posterior intestine. Ctenopharyngodon idella had the highest amylase and maltase activities in all portions of the gut, followed by L. obtusidens . The highest trypsin activity was observed in all gut portions of H. malabaricus, followed by the mid intestine of L. obtusidens and the anterior intestine of C. idella . The highest chymotrypsin activity was found in all portions of C. idella followed by the anterior intestines of R. quelen, L. obtusidens and H. malabaricus . In the stomach, acid protease activity was significantly lower in R. quelen and L. obtusidens compared to H. malabaricus. Ctenopharyngodon idella showed high activity of enzymes that hydrolyze carbohydrates, represented in this study by amylase and maltase and H. malabaricus showed higher protease activity and low amylase activity.

O objetivo deste estudo foi verificar a atividade de algumas enzimas digestivas em quatro espécies de peixes com hábitos alimentares diferentes. O conhecimento das atividades dessas enzimas pode nos ajudar a compreender os processos digestivos das espécies. As espécies escolhidas para este estudo foram Ctenopharyngodon idella (herbívoro), Rhamdia quelen (onívoro), Leporinus obtusidens (onívoro) e Hoplias malabaricus (carnívoro). O trato digestivo dessas espécies foi dividido em quatro partes para estimar a atividade enzimática: estômago, intestino anterior, médio e posterior. Ctenopharyngodon idella teve a maior atividade da amilase e maltase em todas as porções do intestino, seguido por L. obtusidens . A maior atividade da tripsina foi observada em todas as porções do intestino de H. malabaricus , seguido pelo intestino médio de L. obtusidens e o intestino anterior de C. idella . A maior atividade de quimotripsina foi encontrada em todas as partes do intestino do C. idella , seguida pelo intestino anterior de R. quelen, L. obtusidens e H. malabaricus . No estômago, a atividade de protease ácida foi significativamente menor em R. quelen e L. obtusidens comparado com H. malabaricus. Ctenopharyngodon idella mostrou alta atividade de enzimas que hidrolisam carboidratos, representadas neste estudo por amilase e maltase e H. malabaricus mostrou maior atividade de proteases e baixa atividade de amilase.

Different feeding habits influence the activity of digestive enzymes in freshwater fish

ABSTRACT: The aim of this study was to verify the activity of some digestive enzymes in four fish species with different feeding habits. Knowledge of these enzymatic activities can help us to understand the species' digestive processes. The species chosen for this study were Ctenopharyngodon idella (herbivore), Rhamdia quelen (omnivore), Leporinus obtusidens (omnivore) and Hoplias malabaricus (carnivore). The digestive tract of these species was divided into four portions to estimate enzymatic activity: stomach, anterior, mid and posterior intestine. Ctenopharyngodon idella had the highest amylase and maltase activities in all portions of the gut, followed by L. obtusidens . The highest trypsin activity was observed in all gut portions of H. malabaricus, followed by the mid intestine of L. obtusidens and the anterior intestine of C. idella . The highest chymotrypsin activity was found in all portions of C. idella followed by the anterior intestines of R. quelen, L. obtusidens and H. malabaricus . In the stomach, acid protease activity was significantly lower in R. quelen and L. obtusidens compared to H. malabaricus. Ctenopharyngodon idella showed high activity of enzymes that hydrolyze carbohydrates, represented in this study by amylase and maltase and H. malabaricus showed higher protease activity and low amylase activity.

RESUMO: O objetivo deste estudo foi verificar a atividade de algumas enzimas digestivas em quatro espécies de peixes com hábitos alimentares diferentes. O conhecimento das atividades dessas enzimas pode nos ajudar a compreender os processos digestivos das espécies. As espécies escolhidas para este estudo foram Ctenopharyngodon idella (herbívoro), Rhamdia quelen (onívoro), Leporinus obtusidens (onívoro) e Hoplias malabaricus (carnívoro). O trato digestivo dessas espécies foi dividido em quatro partes para estimar a atividade enzimática: estômago, intestino anterior, médio e posterior. Ctenopharyngodon idella teve a maior atividade da amilase e maltase em todas as porções do intestino, seguido por L. obtusidens . A maior atividade da tripsina foi observada em todas as porções do intestino de H. malabaricus , seguido pelo intestino médio de L. obtusidens e o intestino anterior de C. idella . A maior atividade de quimotripsina foi encontrada em todas as partes do intestino do C. idella , seguida pelo intestino anterior de R. quelen, L. obtusidens e H. malabaricus . No estômago, a atividade de protease ácida foi significativamente menor em R. quelen e L. obtusidens comparado com H. malabaricus. Ctenopharyngodon idella mostrou alta atividade de enzimas que hidrolisam carboidratos, representadas neste estudo por amilase e maltase e H. malabaricus mostrou maior atividade de proteases e baixa atividade de amilase.

Different feeding habits influence the activity of digestive enzymes in freshwater fish

ABSTRACT: The aim of this study was to verify the activity of some digestive enzymes in four fish species with different feeding habits. Knowledge of these enzymatic activities can help us to understand the species' digestive processes. The species chosen for this study were Ctenopharyngodon idella (herbivore), Rhamdia quelen (omnivore), Leporinus obtusidens (omnivore) and Hoplias malabaricus (carnivore). The digestive tract of these species was divided into four portions to estimate enzymatic activity: stomach, anterior, mid and posterior intestine. Ctenopharyngodon idella had the highest amylase and maltase activities in all portions of the gut, followed by L. obtusidens . The highest trypsin activity was observed in all gut portions of H. malabaricus, followed by the mid intestine of L. obtusidens and the anterior intestine of C. idella . The highest chymotrypsin activity was found in all portions of C. idella followed by the anterior intestines of R. quelen, L. obtusidens and H. malabaricus . In the stomach, acid protease activity was significantly lower in R. quelen and L. obtusidens compared to H. malabaricus. Ctenopharyngodon idella showed high activity of enzymes that hydrolyze carbohydrates, represented in this study by amylase and maltase and H. malabaricus showed higher protease activity and low amylase activity.

RESUMO: O objetivo deste estudo foi verificar a atividade de algumas enzimas digestivas em quatro espécies de peixes com hábitos alimentares diferentes. O conhecimento das atividades dessas enzimas pode nos ajudar a compreender os processos digestivos das espécies. As espécies escolhidas para este estudo foram Ctenopharyngodon idella (herbívoro), Rhamdia quelen (onívoro), Leporinus obtusidens (onívoro) e Hoplias malabaricus (carnívoro). O trato digestivo dessas espécies foi dividido em quatro partes para estimar a atividade enzimática: estômago, intestino anterior, médio e posterior. Ctenopharyngodon idella teve a maior atividade da amilase e maltase em todas as porções do intestino, seguido por L. obtusidens . A maior atividade da tripsina foi observada em todas as porções do intestino de H. malabaricus , seguido pelo intestino médio de L. obtusidens e o intestino anterior de C. idella . A maior atividade de quimotripsina foi encontrada em todas as partes do intestino do C. idella , seguida pelo intestino anterior de R. quelen, L. obtusidens e H. malabaricus . No estômago, a atividade de protease ácida foi significativamente menor em R. quelen e L. obtusidens comparado com H. malabaricus. Ctenopharyngodon idella mostrou alta atividade de enzimas que hidrolisam carboidratos, representadas neste estudo por amilase e maltase e H. malabaricus mostrou maior atividade de proteases e baixa atividade de amilase.

Alkaline protease from a new halotolerant alkaliphilic Bacillus agaradhaerens strain ak-r isolated from egyptian soda lakes / Protease alcalina de uma nova estirpe ak-r halotolerante e alcalófila de Bacillus agaradhaerens isolada a partir dos lagos alcalinos egípcios

Alkaline proteases are hydrolytic enzymes that cleave peptide bonds in proteins and peptides in alkaline conditions, which occupy a pivotal importance with respect to their industrial applications. This study aimed to isolate new alkaline protease producing alkaliphilic bacteria from Egyptian soda lakes and optimize the fermentation process to enhance the enzyme production. The extensive screening process of the samples collected from Egyptian soda lakes resulted in isolation of a potent alkaline protease producing alkaliphilic strain AK-R. The isolate was identified as Bacillus agaradhaerens strain AK-R based on 16S rRNA gene analysis (99%). Wheat bran and gelatin supported maximum alkaline protease production as carbon and nitrogen sources, respectively. Strain AK-R is halo-tolerant thermotolerant alkaliphilic bacterium in nature, as it can grow over a wide range of NaCl concentrations (up to 25%) and up to 55 °C, with maximal growth and enzyme production at 2.5-5%, and pH 11 at 35 °C. Among the tested cations, only Mg2+ and Ca2+ ions significantly enhanced the enzyme production by about 1.2, and 1.3 fold compared to control, respectively. Alkaline protease secretion was coherent with the growth pattern, reaching maximal yield after about 32 h (mid stationary phase). In conclusion a new halo-tolerant thermo-tolerant alkaliphilic alkaline protease producing Bacillus agaradhaerens strain AK-R was isolated from Egyptian soda lakes. Optimization of the nutritional and cultivation conditions resulted in increase of enzyme yield by 20 fold. Strain AK-R and its extracellular alkaline protease with salt, pH and temperature, tolerance signify their potential application in laundry and pharmaceuticals industries.

Proteases alcalinas são enzimas hidrolíticas que quebram ligações peptídicas em proteínas e peptídeos em condições alcalinas, o que ocupa uma importância fundamental em relação às suas aplicações industriais. Este estudo teve como objetivo isolar novas proteases alcalinas e produzir bactérias alcalófilas a partir dos lagos salgados alcalinos egípcios e otimizar o processo de fermentação para aumentar a produção de enzimas. O extensivo processo de triagem das amostras coletadas dos lagos salgados alcalinos egípcios resultou no isolamento de uma protease alcalina potente produzindo uma estirpe alcalófila AK-R. O isolado foi identificado como sendo a estirpe AK-R de Bacillus agaradhaerens baseado na análise de genes 16S rRNA (99%). O farelo de trigo e a gelatina suportaram a produção máxima de protease alcalina como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente. A estirpe AK-R é uma bactéria alcalófila halotolerante e termotolerante, pois pode crescer dentro de uma vasta gama de concentrações de NaCl (até 25%) e até 55ºC, com crescimento e produção de enzimas máximos a 2.5-5% e pH 11 a 35ºC. Dentre os cátions testados, somente os íons Mg2+ e Ca2+ aumentaram significativamente a produção de enzimas em cerca de 1.2 e 1.3 em comparação ao controle, respectivamente. A secreção de protease alcalina foi coerente com o padrão de crescimento, atingindo o rendimento máximo após 32h (fase estacionária média). Pode-se concluir que uma nova estirpe AK-R de Bacillus agaradhaerens halotolerante, termotolerante e alcalófila produtora de protease alcalina foi isolada a partir dos lagos salgados alcalinos egípcios. A otimização das condições de nutrição e cultivo resultou num aumento da produção de enzima em 20 vezes. A estirpe AK-R e a sua protease alcalina extracelular com tolerância ao sal, pH e temperatura tornam significantes as suas potenciais aplicações nas indústrias farmacêutica e de lavanderia.

Ação de fatores enzimáticos na obtenção de hidrolisados protéicos de farinha de trigo com baixo teor de fenilalanina / Action of enzymatic factors in obtaining protein hydrolysates of wheat flour, low-phenylalanine

Visando ao preparo de farinha de trigo com baixo teor de fenilalanina (Phe), extraiu-se, enzimaticamente as proteínas, empregando-se uma protease alcalina de Bacillus licheniformis. Em seguida, os extratos protéicos foram hidrolisados pela ação de enzimas comerciais (pancreatina e bromelina) e de extratos enzimáticos obtidos da casca de abacaxi (bruto e purificado), avaliando-se alguns parâmetros enzimáticos, tais como tipo de enzima, tipo de ação enzimática, tipo de associação enzimática e ordem de ação enzimática. O carvão ativado (CA) foi empregado como meio adsorvente e a eficiência da remoção de Phe foi avaliada por espectrofotometria derivada segunda, determinando-se o teor de Phe na farinha de trigo e em seus hidrolisados, após tratamento com CA. O melhor resultado foi encontrado ao se empregar a associação sucessiva do extrato bruto seguida da pancreatina, tendo atingido 66,28 por cento de remoção e o teor final de Phe de 522,44 mg/100 g de hidrolisado.

With the aim of producing wheat flour with low phenylalanine (Phe) content to be introduced in phenylketonuric's diet, the proteins were enzymaticaly extracted, using an alkaline protease from Bacillus licheniformis. Then, the protein extracts were hydrolyzed by the action of commercial enzymes (pancreatin and bromelain) and of enzymatic extracts obtained from pineapple peel (crude and purified). Some enzymatic parameters were evaluated, such as type of enzyme, type of enzyme action, type of enzymatic association and order of enzyme action. The activated carbon (AC) was used as adsorbent and the efficiency of Phe removal was evaluated by second derivative spectrophotometry measuring the Phe content in wheat flour and in their hydrolysates after AC treatment. The best result was found for the successive association of crude extract followed by pancreatin obtaining 66.28 percent of removal and a final Phe content of 522.44 mg/100 g of hydrolysate.

Production of alkaline protease from Cellulosimicrobium cellulans / Produção de protease alcalina porCellulosimicrobium cellulans

Cellulosimicrobium cellulans is one of the microorganisms that produces a wide variety of yeast cell walldegradingenzymes, β-1,3-glucanase, protease and chitinase. Dried cells of Saccharomyces cerevisiae were used as carbon and nitrogen source for cell growth and protease production. The medium components KH2PO4, KOH and dried yeast cells showed a significant effect (p<0.05) on the factorial fractional design. A second design was prepared using two factors: pH and percentage of dried yeast cells. The results showedthat the culture medium for the maximum production of protease was 0.2 g/l of MgSO4.7H2O, 2.0 g/l of(NH4)2SO4 and 8% of dried yeast cells in 0.15M phosphate buffer at pH 8.0. The maximum alkaline protease production was 7.0 ± 0.27 U/ml over the center point. Crude protease showed best activity at 50ºC and pH 7.0-8.0, and was stable at 50ºC.

Cellulosimicrobium cellulans é um microrganismo que produz uma variedade de enzimas que hidrolisam a parede celular de leveduras: β-1,3-glucanase, protease e quitinase. Célulasdesidratadas de Saccharomyces cerevisiae foram usadas como fonte de carbono e nitrogênio para o crescimento celular e produção de protease. Os componentes do meio de cultura: KH2PO4, KOH e células de levedura desidratadas mostraram efeitos significativos (p<0,05) no planejamento experimental fracionário. Um segundo planejamento foi preparado usandodois fatores: pH e porcentagem de células de levedura desidratadas. Os resultados mostraram que o meio de cultura para a produção máxima de protease foi 0,2 g/L de MgSO4.7H2O;2,0 g/L de (NH4)2SO4 e 8% de células de levedura desidratadas em tampão fosfato 0,15M e pH 8,0. A produção máxima de protease alcalina foi 7,0 ± 0,27 U/mL no ponto central. A proteasebruta apresentou atividade ótima a 50ºC e pH 7,0-8,0; e foi estável a 50ºC.

Production of alkaline protease from Cellulosimicrobium cellulans

Cellulosimicrobium cellulans is one of the microorganisms that produces a wide variety of yeast cell wall-degrading enzymes, -1,3-glucanase, protease and chitinase. Dried cells of Saccharomyces cerevisiae were used as carbon and nitrogen source for cell growth and protease production. The medium components KH2PO4, KOH and dried yeast cells showed a significant effect (p 0.05) on the factorial fractional design. A second design was prepared using two factors: pH and percentage of dried yeast cells. The results showed that the culture medium for the maximum production of protease was 0.2 g/l of MgSO4.7H2O, 2.0 g/l of (NH4)2SO4 and 8% of dried yeast cells in 0.15M phosphate buffer at pH 8.0. The maximum alkaline protease production was 7.0 ± 0.27 U/ml over the center point. Crude protease showed best activity at 50°C and pH 7.0-8.0, and was stable at 50°C.

Cellulosimicrobium cellulans é um microrganismo que produz uma variedade de enzimas que hidrolisam a parede celular de leveduras: -1,3-glucanase, protease e quitinase. Células desidratadas de Saccharomyces cerevisiae foram usadas como fonte de carbono e nitrogênio para o crescimento celular e produção de protease. Os componentes do meio de cultura: KH2PO4, KOH e células de levedura desidratadas mostraram efeitos significativos (p 0,05) no planejamento experimental fracionário. Um segundo planejamento foi preparado usando dois fatores: pH e porcentagem de células de levedura desidratadas. Os resultados mostraram que o meio de cultura para a produção máxima de protease foi 0,2 g/L de MgSO4.7H2O; 2,0 g/L de (NH4)2SO4 e 8% de células de levedura desidratadas em tampão fosfato 0,15M e pH 8,0. A produção máxima de protease alcalina foi 7,0 ± 0,27 U/mL no ponto central. A protease bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0-8,0; e foi estável a 50°C.

Secretion of an alkaline protease from a salt- tolerant and alkaliphilic, Streptomyces clavuligerus strain Mit-1

An alkaliphilic and salt- tolerant actinomycete, Streptomyces clavuligerus strain Mit-1, was isolated from Mithapur, the western coast of India. The organism was Gram-positive, having filamentous, long thread like structure. The sporulation started after two days of growth and the optimum level of alkaline protease (130 U/ml) was produced during the early stationary phase. The strain could grow and produce protease with 0-10 percent NaCl (w/v), the optimum being 5 percent NaCl (w/v). Growth and protease production was optimum at pH 9 with substantial decline at neutral pH. Sucrose and gelatin were the best carbon and nitrogen sources respectively, whereas gelatin broth was the preferred medium for protease production. Mit-1 produced substantial protease with various amino acids, when employed as the sole nitrogen sources. Crude substrates, such as molasses, whey and wheat flour had significant effect on enzyme production. The results are quite valuable, as only few actinomycetes, particularly salt-tolerant alkaliphilic ones, have so far been explored for their enzymatic potential and process optimization.

Uma cepa halotolerante e alcalifílica de Streptomyces clavuligerus, Mit-1, foi isolada em Mithapur, na costa oeste da Índia. Esse microrganismo é Gram positivo e apresenta estrutura filamentosa na forma de longas cordas. A esporulação iniciou após dois dias de cultivo e o nível ótimo de produção de protease alcalina (130 U/ml) foi atingido no início da fase estacionária de crescimento. A cepa foi capaz de multiplicar com 0-10 por cento NaCl (w/v), com um ótimo de 5 por cento NaCl (w/v). O ótimo de crescimento e produção de protease foi atingido em pH 9, apresentando declínio substancial em pH neutro. Sacarose e gelatina foram as melhores fones de carbono e nitrogênio, respectivamente, enquanto o caldo gelatina foi o melhor meio para produção de protease. A cepa Mit-1 produziu bastante protease quando vários aminoácidos foram empregados como única fonte de nitrogênio. Substratos crus, como melaço, soro de leite e farinha de trigo, tiveram um efeito significativo na produção da enzima. Os resultados são bastante interessantes, considerando que somente poucos actinomicetos, especialmente os halotolerantes, já foram explorados por seu potencial de produção de enzimas e otimização de processos.

Production of moderately halotolerant, SDS stable alkaline protease from Bacillus cereus MTCC 6840 isolated from lake Nainital, Uttaranchal state, India

A moderately cold active, extracellular alkaline protease producing bacterium was isolated from a fresh water lake. The isolate was found to be a gram-positive, rod shaped organism later identified as Bacillus cereus MTCC 6840. The bacterium produced the maximum amount of enzyme when allowed to grow for 24 h at temperature 25º and pH 9.0. Among a variety of substrates used, fructose as a carbon source and a combination of yeast extract and peptone as nitrogen source, supported the maximum protease production by the organism (120 U/ml). Fe++ and Co++ stimulated the enzyme activity whereas Ca++, Cu++, K+, Mg++ and Mn++ inhibited it to different extents. The protease was found to be highly stable in the presence of NaCl, SDS and acetone. Treatment with EDTA and PMSF resulted in the considerable loss of enzyme activity. The enzyme was found to be optimally active at pH 9.0 and temperature 20ºC.

Uma bactéria produtora de protease alcalina extracelular, moderadamente ativa no frio, foi isolada da água de um lago. Trata-se de um bacilo Gram positivo, identificado como Bacillus cereus MTCC6840. A maior produção da enzima foi em 24h a 25ºC e pH 9,0. A produção máxima de protease (120 U/ml) ocorreu quando foi utilizada frutose como fonte de carbono e uma combinação de extrato de levedura com peptona como fonte de nitrogênio. Fe++ e Co++ estimularam a atividade da enzima, enquanto Ca++, Cu++, K+,Mg++ e Mn++ tiveram efeito inibitório, com intensidades diferentes. A protease permaneceu estável na presença de NaCl, SDS e acetona. O tratamento com EDTA e PMSF causou uma significativa perda na atividade. A enzima apresentou atividade ótima em pH 9,0 e temperatura de 20ºC.

Production of moderately halotolerant, SDS stable alkaline protease from Bacillus cereus MTCC 6840 isolated from lake Nainital, Uttaranchal state, India

A moderately cold active, extracellular alkaline protease producing bacterium was isolated from a fresh water lake. The isolate was found to be a gram-positive, rod shaped organism later identified as Bacillus cereus MTCC 6840. The bacterium produced the maximum amount of enzyme when allowed to grow for 24 h at temperature 25º and pH 9.0. Among a variety of substrates used, fructose as a carbon source and a combination of yeast extract and peptone as nitrogen source, supported the maximum protease production by the organism (120 U/ml). Fe++ and Co++ stimulated the enzyme activity whereas Ca++, Cu++, K+, Mg++ and Mn++ inhibited it to different extents. The protease was found to be highly stable in the presence of NaCl, SDS and acetone. Treatment with EDTA and PMSF resulted in the considerable loss of enzyme activity. The enzyme was found to be optimally active at pH 9.0 and temperature 20ºC.

Uma bactéria produtora de protease alcalina extracelular, moderadamente ativa no frio, foi isolada da água de um lago. Trata-se de um bacilo Gram positivo, identificado como Bacillus cereus MTCC6840. A maior produção da enzima foi em 24h a 25ºC e pH 9,0. A produção máxima de protease (120 U/ml) ocorreu quando foi utilizada frutose como fonte de carbono e uma combinação de extrato de levedura com peptona como fonte de nitrogênio. Fe++ e Co++ estimularam a atividade da enzima, enquanto Ca++, Cu++, K+,Mg++ e Mn++ tiveram efeito inibitório, com intensidades diferentes. A protease permaneceu estável na presença de NaCl, SDS e acetona. O tratamento com EDTA e PMSF causou uma significativa perda na atividade. A enzima apresentou atividade ótima em pH 9,0 e temperatura de 20ºC.

Secretion of an alkaline protease from a salt- tolerant and alkaliphilic, Streptomyces clavuligerus strain Mit-1

An alkaliphilic and salt- tolerant actinomycete, Streptomyces clavuligerus strain Mit-1, was isolated from Mithapur, the western coast of India. The organism was Gram-positive, having filamentous, long thread like structure. The sporulation started after two days of growth and the optimum level of alkaline protease (130 U/ml) was produced during the early stationary phase. The strain could grow and produce protease with 0-10% NaCl (w/v), the optimum being 5% NaCl (w/v). Growth and protease production was optimum at pH 9 with substantial decline at neutral pH. Sucrose and gelatin were the best carbon and nitrogen sources respectively, whereas gelatin broth was the preferred medium for protease production. Mit-1 produced substantial protease with various amino acids, when employed as the sole nitrogen sources. Crude substrates, such as molasses, whey and wheat flour had significant effect on enzyme production. The results are quite valuable, as only few actinomycetes, particularly salt-tolerant alkaliphilic ones, have so far been explored for their enzymatic potential and process optimization.

Uma cepa halotolerante e alcalifílica de Streptomyces clavuligerus, Mit-1, foi isolada em Mithapur, na costa oeste da Índia. Esse microrganismo é Gram positivo e apresenta estrutura filamentosa na forma de longas cordas. A esporulação iniciou após dois dias de cultivo e o nível ótimo de produção de protease alcalina (130 U/ml) foi atingido no início da fase estacionária de crescimento. A cepa foi capaz de multiplicar com 0-10% NaCl (w/v), com um ótimo de 5% NaCl (w/v). O ótimo de crescimento e produção de protease foi atingido em pH 9, apresentando declínio substancial em pH neutro. Sacarose e gelatina foram as melhores fones de carbono e nitrogênio, respectivamente, enquanto o caldo gelatina foi o melhor meio para produção de protease. A cepa Mit-1 produziu bastante protease quando vários aminoácidos foram empregados como única fonte de nitrogênio. Substratos crus, como melaço, soro de leite e farinha de trigo, tiveram um efeito significativo na produção da enzima. Os resultados são bastante interessantes, considerando que somente poucos actinomicetos, especialmente os halotolerantes, já foram explorados por seu potencial de produção de enzimas e otimização de processos.

Characterization and stability of extracellular alkaline proteases from halophilic and alkaliphilic bacteria isolated from saline habitat of coastal Gujarat, India

The present study deals with the isolation and characterization of the moderately halophilic-alkaliphilic bacteria from a saline habitat in western India. Eight different bacterial strains were isolated using enrichment techniques at 20% (w/v) NaCl and pH 10. The isolates exhibited diversity towards gram's reaction, colony and cell morphology. They were able to grow and produce alkaline protease over a broad range of NaCl, 5-20% (w/v) and pH, 8-10. None of the isolates could grow at pH 7, and one could not grow even at pH 8. Crude and partially purified proteases from strain S5 were subjected to characterization with reference to pH, salt stability and protein folding. Optimum protease activity and stability was recorded at 10% salt and pH 9-9.5. Denaturation kinetics of S5 alkaline protease along with a reference protease was studied at 8M urea followed by renaturation. The S5 alkaline protease could be partially renatured up to 32% of the original activity. Despite of the fact that all the 8 isolates were from the same site, they displayed significant diversity with respect to their salt requirement for growth and enzyme secretion. While the effect of pH was less demarcated on growth, the protease production was significantly affected. Isolate S5 produced substantial amount of halotolerant and alkaline protease. The activity and stability of the alkaline protease in a broader range of pH and salt would definitely make this enzyme an important candidate for various industrial applications.

O presente estudo relata o isolamento e caracterização de bactérias moderadamente halofilicas e alcalífilicas de um habitat salino no oeste da Índia. Oito cepas diferentes de bactérias foram isoladas empregando técnicas de enriquecimento em NaCl a 20% (p/v) e pH 10. As cepas apresentaram diversidade em relação à coloração de Gram e à morfologia das colônias e células. As cepas foram capazes de multiplicar e produzir protease alcalina em uma ampla faixa de concentração de NaCl (5 a 20%) e pH (8 a 10). Nenhuma das cepas foi capaz de se multiplicar em pH 7, e uma não se multiplicou nem em pH 8.0. Proteases naturais e parcialmente purificadas da cepa S5 foram submetidas à caracterização com relação ao pH, estabilidade salina, e estrutura protéica. Atividade e estabilidade ótimas da protease foram obtidas com 10% de sal e pH 9-9,5. A cinética de denaturação da protease de S5, juntamente com uma protease de referencia, foi avaliada com uréia 8M seguida de renaturação. A protease alcalina de S5 foi renaturada a 32% da atividade original. Apesar de provenientes do mesmo local, as oito cepas mostraram grande diversidade em relação à exigência de sal para multiplicação e secreção enzimática. Enquanto o efeito do pH na multiplicação foi menos marcante, o efeito na produção de protease foi significativamente afetada. A cepa S5 produziu uma quantidade substancial de protease alcalina e halotolerante. A atividade e estabilidade da protease alcalina em uma faixa mais ampla de pH e sal tornam essa enzima uma importante candidata para diversas aplicações industriais.