Otimização da expressão e purificação de proteína recombinante imunossupressora

The discovery of immunosuppressive drugs in the 1960s enabled immense advances in medicine, being used, for example, in transplant patients, with the purpose of treating and/or preventing graft rejection. Studies in the area continue to grow and evolve, in search of updates to the more targeted and specific therapeutic arsenal. At the Immunochemistry Laboratory of the Butantan Institute, a protein in the venom of the Lachesis muta snake was isolated and identified with immunosuppressive properties, named LMVp. The use of recombinant DNA technology has allowed advances in the synthesis of immunobiologicals, being crucial for research into the structure, function and production of therapeutic medicines. With the aim of achieving more effective performance in obtaining LMVp, this work used competent bacteria from the BL21 DE3 STAR PLYSS strain in an attempt to achieve optimization of the expression, purification and concentration processes of the recombinant protein. However, this optimization path did not prove to be efficient, demonstrating that other strategies must be followed to obtain better LMVp performance.

A descoberta das drogas imunossupressoras na década de 60 possibilitou imenso avanço na medicina, sendo utilizado, por exemplo, em pacientes transplantados, com a finalidade de tratamento e/ou prevenção da rejeição de enxertos. Os estudos na área continuam crescendo e evoluindo, em busca de atualizações do arsenal terapêutico mais direcionado e específico. No Laboratório de Imunoquímica do Instituto Butantan, uma proteína no veneno da serpente Lachesis muta foi isolada e identificada com propriedades imunossupressoras, nomeada LMVp. O uso da tecnologia de DNA recombinante permitiu avanços na síntese de imunobiológicos, sendo crucial para pesquisas sobre estrutura, função e produção de medicamentos terapêuticos. Com o objetivo de alcançar um desempenho mais efetivo na obtenção da LMVp, este trabalho utilizou as bactérias competentes da linhagem BL21 DE3 STAR PLYSS na tentativa de alcançar uma otimização dos processos de expressão, purificação e concentração da proteína recombinante. Entretanto, este caminho de otimização não se mostrou eficiente, demonstrando que se deve seguir outras estratégias para se obter melhor rendimento da LMVp.

Expressão da proteína recombinante Sm29 em Escherichia coli e purificação a partir dos corpúsculos de inclusão

Schistosomiasis is a neglected chronic parasitic tropical disease caused by the trematode worm Schistosoma spp., common in developing countries. Pharmacological treatments are available, but they are not effective due to the global epidemiological situation. A preventive vaccine could effectively contribute to reduce the infection. Among a number of antigens, the tegumental protein Sm29 from adult worm Shistosoma mansoni has been identified as a promising vaccine candidate. The gene Sm29 was cloned with 393 nucleotides, excluding a signal peptide and the transmembrane domain, to express the protein with 130 amino acids, approximately 18 kDa, with theoretical pI 6.5. Our objectives is to obtain the recombinant Sm29 protein expressed in Escherichia coli without histidine tag. Therefore, we must optimize the Sm29 obtaining processe, upstream and downstream, in order to design the industrial process, improving the yield and quality of the product to be used in clinical trials. Cells of E. coli BL21(DE3)_pET28_Sm29 were cultivated in bioreactor for Sm29 expression and they were separated by centrifugation. The cells were resuspended in buffer and lysed in French Press. The inclusion bodies (IB) were recovered by centrifugation and we studied the clarification of IB by washing with different solutions and using different centrifugation forces. The solubilization of IB was tested with 8 M Urea under different pH conditions. After the treatments, the protein profiles were analyzed by SDS-PAGE, to verify the presence of the expected band of ~18 kDa and the removal of contaminants. The washing solutions and the lower centrigugation speed helped to clarify the material, without causing losses. The pH of the solubilization solutions interfere with protein recovery, determining to work above pH 7.5, to seek the best balance between protein recovery and contaminant elimination. To meet regulatory requirements in the industrial process for vaccine production, we aim to replace purification by metal affinity chromatography (IMAC), allowed by the presence of the his-tag, added to the antigen as a purification strategy. Thus, the purification of rSm29 by IMAC was compared with studies of ion exchange chromatography, evaluating the binding of denatured or renatured proteins to the resins. It was found that the initial IB clarification parameters and solubilization conditions interfere in the chromatography and dialysis stages. It was determined that. to date. the best condition of binding is the renatured protein to the anion exchange resin, Q-Sepharose. As we identified an alternative purification method, we cloned the Sm29 gene without the his tag code to express the protein in BL21(DE3). Furthermore, the Sm29 gene was optimized for E. coli codon usage. The optimized gene was also cloned for expression in BL21(DE3), to evaluate whether it would modify the protein synthesis in terms of amount of expression and solubility. The first tests suggest that the amount of protein expression is similar to that obtained with the original gene. Tests of solubilization by pressurization are planned to analyze whether possible structural modifications in rSm29 may improves protein recovery.

A esquistossomose é uma doença tropical parasitária crônica negligenciada, causada pelo verme trematódeo Schistosoma spp., comum em países em desenvolvimento. Os tratamentos farmacológicos disponíveis não são eficazes devido à situação epidemiológica global. Uma vacina preventiva poderia contribuir eficazmente para a reduzir a infecção. Entre uma série de antígenos, a proteína tegumentar Sm29 do verme adulto Shistosoma mansoni foi identificada como uma promissora candidata a vacina. O gene Sm29 foi clonado com 393 nucleotídeos, excluindo um peptídeo sinal e o domínio transmembrana, para expressar a proteína com 130 aminoácidos, aproximadamente 18 KDa, com pI teórico 6,5. Nosso objetivo é obter a proteína Sm29 recombinante expressa em Escherichia coli sem cauda de histidina. Para tanto, devemos otimizar os processos de fermentação dos clones e os processos de purificação, para então, desenhar o processo industrial para melhorar o rendimento e a qualidade do produto a ser utilizado em ensaios clínicos. Células do clone E. coli BL21(DE3)_pET28_Sm29 foram cultivadas em biorreator para expressão de rSm29, separadas por centrifugação, ressuspensas em tampão e lisadas em “French Press”. Os corpos de inclusão (CI) foram recuperados por centrifugação e estudamos a etapa de clarificação dos CI por lavagens com diferentes soluções e forças de centrifugação. Testamos a solubilização dos CI com Ureia 8 M sob diferentes condições de pH. Após os tratamentos, analisamos os perfis proteicos por SDS-PAGE, verificando a banda esperada de ~18 kDa e a remoção de contaminantes. As soluções utilizadas na lavagem e a menor velocidade de centrifugação clarificam o material, sem causar perdas da proteína de interesse. O pH da solução de solubilização interfere na recuperação da proteína, determinando trabalhar com pH acima de 7,5 para buscar o melhor equilíbrio entre recuperação proteica e eliminação de contaminantes. Para atender aos requisitos regulatórios de processo industrial na produção de vacinas, temos o objetivo de substituir a purificação por cromatografia de afinidade a metal (IMAC) para poder remover a cauda de histidina, adicionada ao antígeno como estratégia de purificação. Assim, comparamos a purificação da rSm29 por IMAC com estudos de purificação por trocas iônicas, avaliando a ligação da proteína desnaturada ou renaturada com as resinas. Verificamos que os parâmetros iniciais de clarificação da CI e as condições de solubilização interferem nas etapas de cromatografia e diálise. Determinamos que a melhor condição, até o momento, é a ligação da proteína renaturada à resina de troca aniônica, Q-Sepharose. Identificado um método alternativo de purificação, clonamos o gene Sm29 sem a cauda de histidina e expressamos a proteína em BL21(DE3). Além disso, o gene Sm29 foi otimizado para uso de códons de E. coli. Um gene otimizado foi clonado para expressão em BL21(DE3), para avaliarmos se modificaria a estrutura da proteína durante a síntese da cadeia primária, em termos de quantidade de expressão e solubilidade. Os primeiros testes sugerem que a expressão é semelhante à obtida com o gene original. Testes de solubilização por pressurização estão planejados para analisar se a possível modificação estrutural na rSm29 melhoraria a recuperação do antígeno.

Expressão de uma acetilcolinesterase isolada do veneno da centopeia Cryptops iheringi

Centipedes are a group of venomous arthropods widely distributed around the world, and due to their well-adapted nature to urban areas, they often cause accidents in humans. Despite their limited medical relevance, centipede envenomation can lead to a range of undesirable symptoms such as burning pain, paresthesia, swelling, and superficial necrosis at the bite site, occasionally progressing to a severe condition in rare cases. A clinical study involving patients treated at the Vital Brazil Hospital of the Butantan Institute showed that most centipede accidents were caused by the Cryptops and Otostigmus genera, accounting for about 90% of cases. Literature reports indicate that centipede venom contains several bioactive compounds, some with potential therapeutic interest. However, despite its significant pharmacological importance, very little is known about the active components of these animals' venom. Therefore, centipede venom could be an excellent source of as-yet-unknown toxins with unexplored biotechnological potential. Cryptops is one of the genera most associated with accidents in humans, and so far, there is no literature study on the toxins of its venom. Through a transcriptomic analysis of the venom gland of Cryotops iheringi conducted by our group, a significant proportion of acetylcholinesterase sequences was observed. As cholinesterases are involved in cholinergic synapses present in the central and peripheral nervous systems, this enzyme becomes an attractive target for the development of new drugs. This project was already underway in our group, where the enzyme was cloned into a bacterial vector. Consequently, this work aims to carry out the expression tests and purification of this molecule.

As centopeias são um grupo de artrópodes venenosos amplamente distribuídos pelo mundo, e por serem animais bem adaptados a áreas urbanas, frequentemente provocam acidentes em humanos. Apesar da pouca relevância médica, o envenenamento por lacraias pode causar uma série de sintomas indesejáveis, como dor ardente, parestesia, edema e necrose superficial no local da picada, podendo, em casos raros, evoluir para um quadro grave. Um estudo clínico com pacientes atendidos no Hospital Vital Brazil do Instituto Butantan, mostrou que a maioria dos acidentes com lacraias foram causados pelos gêneros Cryptops e Otostigmus, representando cerca de 90% dos casos. Têm sido relatados na literatura que o veneno das lacraias contém vários compostos bioativos, alguns com potencial interesse terapêutico, no entanto, apesar da importância farmacológica significante, muito pouco se sabe sobre os componentes ativos do veneno destes animais. Portanto, o veneno de lacraias pode ser uma excelente fonte de toxinas ainda desconhecidas e com potencial biotecnológico inexplorado. Cryptops é um dos gêneros mais associados a acidentes em humanos e, que até o presente momento, não há na literatura nenhum estudo sobre as toxinas de seu veneno. Através de uma análise transcriptômica da glândula de veneno de Cryotops iheringi realizado pelo nosso grupo, foi observada uma grande proporção de sequências de acetilcolinesterase. Uma vez que as colinesterases estão envolvidas em sinapses colinérgicas presentes no sistema nervoso central e periférico, esta enzima torna-se um alvo atraente para o desenvolvimento de novas drogas. Este projeto já estava em desenvolvimento pelo nosso grupo, onde foi realizada a clonagem da enzima em vetor bacteriano. Por conseguinte, este trabalho tem como objetivo realizar os testes de expressão e purificação desta molécula.

Purificação de IgM a partir de plasma humano empregando cromatografias de troca catiônica

Human plasma is full of therapeutic proteins that can be used to treat several diseases, among these proteins are immunoglobulins. IgG is currently the most important blood product because it accounts for around 30% of the market, which was estimated at 20 billion dollars in 2016 and continues to grow. IgM has multiple functions, such as controlling infections, producing dendritic cells and controlling tissue homeostasis. Because of its pentameric structure, IgM can also bind to antigens with greater avidity than other immunoglobulins. However, there are no commercially available IgM concentrates. In this work we studied the purification of plasma-derived IgM using liquid chromatography techniques and resins that can be easily scaled up. In the first step, plasma was purified on a Sepharose 4FF gel-filtration column. The enriched IgM fraction called F2 was then used as sample for cation exchange resin purifications. Experiments were initially carried out on Hi-Trap SP FF with the undiluted F2, five times diluted F2 and ten times diluted F2. Then we scaled up the purification using a 23mL SP Sepharose FF column using F2 diluted 10 times as loading sample. Our results indicate that the best of sample volume was 100mL, which corresponds to 63mg of protein. At pH 6.0 36% of IgM was not adsorbed on the column and 50% was adsorbed. At pH 5.0 IgM was recovered only in the Elution fraction, but the recovery was very poor (38%). Finally we carry out a purification at pH 5.0 using NaCl gradient to elute the adsorbed proteins. Due to the low concentration of proteins in the collected fractions, it was only possible to observe by immunoturbidimetry that 37.3% of IgM eluted in the 300mM NaCl to 500mM NaCl gradient. In this fraction, polyacrylamide gels show that IgG and albumin were present. The results obtained were preliminary and did not yet allow comparison of purification using cation exchange resin with anion exchange resins.

O plasma humano está repleto de proteínas terapêuticas que podem ser utilizadas no tratamento de várias doenças, entre essas proteínas estão as imunoglobulinas. O IgG é atualmente o hemoderivado mais importante porque é responsável por cerca de 30% do mercado, que era estimado em 20 bilhões de dólares em 2016 e continua a crescer. IgM tem múltiplas funções, como controle de infecções, produção de células dendríticas e controle da homeostase dos tecidual. Por conta de sua estrutura pentamérica, o IgM também pode-se ligar a antígenos com maior avidez do que outras imunoglobulinas. Entretanto não existem concentrados de IgM disponíveis comercialmente. Neste trabalho estudamos a purificação de IgM derivada de plasma usando técnicas de cromatografia líquida e resinas que podem ser facilmente escalonadas. Na primeira etapa foi feita a purificação de plasma em uma coluna de gel-filtração Sepharose 4FF. A fração enriquecida de IgM F2 foi então usada como amostra de entrada para as purificações em resina de troca catiônica. Primeiramente foram feitos experimentos em Hi-Trap SP FF com a amostra sem diluir, diluída cinco e dez vezes. Em seguida escalonamos a purificação empregando uma coluna SP Sepharose FF de 23mL usando como amostra de entrada F2 diluída 10 vezes. Verificamos que o volume ideal de amostra aplicada era de 100mL que corresponde a 63mg de proteína de amostra. Verificamos que em pH 6,0 36% de IgM não é adsorvido na coluna e 50% é adsorvido. Em pH 5,0 IgM foi recuperado somente na fração de Eluição, porém a recuperação foi muito baixa (38%). O último passo foi realizar uma purificação em pH 5,0 usando gradiente de NaCl para eluição das proteínas adsorvidas. Devido a baixa concentração de proteínas nas frações recolhidas foi possível apenas observar por imunoturbidimetria que 37,3% de IgM elui no gradiente NaCl 300mM ao NaCl 500mM. Nessa fração os géis de poliacrilamida mostram que IgG e Albumina estão presentes. Os resultados obtidos são preliminares e ainda não permitem comparar a purificação em resina de troca catiônica com resina de troca aniônica.

Staphylococcus hominis: a rare cause of endophthalmitis / Staphylococcus hominis: uma causa rara de endoftalmite

ABSTRACT Staphylococcus hominis (S. hominis) is a coagulase-negative Staphylococci and an infrequent cause of endophthalmitis. Due to its ability to produce biofilm, especially in diabetic patients, strains may acquire antibiotic resistance. We present two cases of S. hominis endophthalmitis, one with acute endophthalmitis after intravitreal bevacizumab injection and one with chronic endophthalmitis following undiagnosed penetrating ocular trauma. Although there are only four published S. hominis endophthalmitis cases in the literature, to the best of our knowledge, there has been no previously published case after intravitreal bevacizumab.

RESUMO Staphylococcus hominis (S. hominis) é um estafilococo coagulase-negativo e uma causa pouco frequente de endoftalmite. Devido à sua capacidade de produzir biofilme, especialmente em pacientes diabéticos, cepas dessa bactéria podem adquirir resistência a antibióticos. Este relato apresenta dois casos de endoftalmite por S. hominis: um de endoftalmite aguda após injeção intravítrea de bevacizumabe e outro de endoftalmite crônica após trauma ocular penetrante não diagnosticado. Embora existam apenas quatro casos de endoftalmite por S. hominis publicados na literatura, até onde sabemos não houve nenhum caso publicado anteriormente após bevacizumabe intravítreo.

Use of Schirmer strips and conjunctival swabs for virus detection on the ocular surface of adults: a scoping review / Fitas de Schirmer e swab conjunctival para detecção de vírus na superfície ocular de adultos: scoping review

ABSTRACT Schirmer strips and conjunctival swabs are used in ophthalmology for the collection of tears and fluids. One of the biggest challenges during the COVID-19 pandemic has been accurate diagnosis and, in some cases, ocular manifestations are among the first symptoms. In this context, this study aimed to collect evidence to support the use of Schirmer strips and conjunctival swabs as a method of sample collection for viral analysis. A literature search was conducted following the Scoping Review protocol defined by The Joanna Briggs Institute. Studies were analyzed regarding virus research, collection methods, and sample analysis. The findings support that viruses can be detected on the ocular surface through analysis of Schirmer strips and conjunctival swabs. However, additional studies with larger samples and time data are necessary to confirm these conclusions.

RESUMO A fita de Schirmer e o swab conjunctival são utilizados na oftalmologia como métodos de coleta para lágrimas e fluidos. Durante a pandemia da COVID-19, um dos desafios foi o diagnóstico correto e se sabe que, em alguns casos, as manifestações oculares podem ser um dos primeiros sintomas. Nesse contexto, este estudo tem como objetivo levantar evidência que destaque o uso de fitas de Schirmer e de swabs conjuntivais como método de coleta para análise viral. Conduziu-se uma revisão de literatura seguindo o protocolo para Scoping Review definido pelo Joanna Briggs Institute. Os pesquisadores analisaram os estudos em busca do vírus pesquisado, os métodos de coleta e os métodos de análise. Vírus podem ser detectados na superfície ocular através da análise de fitas de Schirmer e de swabs conjuntivais, entretanto novos estudos com populações maiores e com definições claras de tempo são necessários para conclusões mais assertivas no tema.

Relación estructura-función de la enzima uroporfirinógeno descarboxilasa: implicancias para la comprensión y el tratamiento de la porfiria cutánea tarda / Structure-function relationship of the enzyme uroporphyrinogen decarboxylase: implications for the understanding and treatment of porphyria cutanea tarda / Relação estrutura-função da enzima uroporfirinogênio descarbioxilase: implicações para a compreensão e tratamento da porfiria cutânea tardia / Reconocimiento a la trayectoria del Prof. Dr. Juan Miguel Castagnino†

Resumen La uroporfirinógeno descarboxilasa humana (UROD-h) es la quinta enzima del camino biosintético del hemo y su actividad deficiente, relacionada a mutaciones en su gen, se encuentra asociada a un subgrupo de porfirias. El objetivo de este trabajo fue estudiar la relación entre la dimerización de la enzima y su actividad enzimática y comprobar si la dimerización de UROD-h es imprescindible tanto para la primera etapa de la reacción (urogen→heptagen), como para la segunda etapa (heptagen→coprogen). Con ese objetivo, se expresó y purificó la UROD-h hasta homogeneidad, se analizó el comportamiento dímero-monómero bajo distintas condiciones que pudieran desplazar el equilibrio de dimerización y se evaluó la actividad enzimática en dichas condiciones. Los resultados obtenidos sugieren que la especie activa para la primera etapa de la reacción es el homodímero y que tanto el dímero como el monómero se comportan como especies activas para la segunda etapa de la reacción. Se propone que mutaciones clínicas como la Y311C, existentes en pacientes con porfiria cutánea tarda, podrían afectar la estabilidad del dímero y podrían ser el blanco para futuras terapias génicas.

Abstract Human uroporphyrinogen decarboxylase (UROD-h) is the fifth enzyme in the heme biosynthetic pathway and its deficient activity, related to mutations in its gene, is associated with a subset of porphyrias. The objective of this work was to study the relationship between the dimerisation of the enzyme and its enzymatic activity and to verify if the dimerisation of UROD-h is essential both for the first stage of the reaction (urogen→heptagen), and for the second stage (heptagen→ coprogen). With this objective, the UROD-h was expressed and purified to homogeneity, the dimer- monomer behaviour was analysed under different conditions, which could shift the dimerisation equilibrium, and the enzymatic activity was evaluated under these conditions. The results obtained suggest that the active species for the first stage of the reaction is the homodimer, and both the dimer and the monomer behaved as active species for the second stage of the reaction. It is proposed that clinical mutations such as Y311C, existing in porphyria cutanea tarda patients, could affect dimer stability and could be the target of future gene therapies.

Resumo A enzima uroporfirinogênio descarboxilase humana (UROD-h) é a quinta enzima da via biossintética do heme e sua atividade deficiente, relacionada com mutações em seu gene, está associada a um subgrupo de porfirias. O objetivo deste trabalho foi estudar a relação entre a dimerização da enzima e sua atividade enzimática e comprovar se a dimerização da UROD-h é imprescindível tanto para a primeira etapa da reação (urogênio→heptagênio), quanto para a segunda etapa (heptagênio→coprogênio). Com esse objetivo, a UROD-h foi expressa e purificada até a homogeneidade, o comportamento de dímero-monômero foi analisado sob diversas condições, que puderam deslocar o equilíbrio de dimerização, e a atividade enzimática foi avaliada em tais condições. Os resultados obtidos sugerem que a espécie ativa para a primeira etapa da reação é o homodímero, e tanto o dímero quanto o monômero se comportam como espécies ativas para a segunda etapa da reação. Propõe-se que mutações clínicas como Y311C, existentes em pacientes com porfiria cutânea tardia, poderiam afetar a estabilidade do dímero e poderiam ser o alvo de futuras terapias gênicas em porfiria cutânea tardia.

The importance of considering the possibility of ocular sporotrichosis in areas with high incidence rates of sporotrichosis / Esporotricose ocular: a importância de ser considerada em áreas com grande incidência de esporotricose

ABSTRACT Ocular sporotrichosis involving adnexa can present in 4 types: granulomatous conjunctivitis, dacryocystitis, Parinaud oculoglandular syndrome, and bulbar conjunctivitis. The incidence of ocular sporotrichosis has increased in regions with high incidence rates of sporotrichosis. We present a series of three cases of ocular involvement by the fungus Sporothrix species, including its manifestations, approaches, and relevance in areas where sporotrichosis has considerable incidence rates.

RESUMO A esporotricose ocular envolvendo anexos pode se apresentar de quatro formas: conjuntivite granulomatosa, dacriocistite, Síndrome Oculoglandular de Parinaud e conjuntivite bulbar. A esporotricose ocular, apesar de incomum, tem aumentado em regiões com alta incidência de esporotricose. Apresentamos uma série de três casos de envolvimento ocular pelo fungo Sporothrix sp.: suas manifestações, abordagem e sua relevância em áreas com alta incidência de esporotricose.

Produção e uso de filtros de água com carvão ativado derivado de matérias sustentáveis / Production and use of water filters with activated carbon derived from sustainable materials

Objetivo: avaliar a eficiência de filtros de tratamento de água, usando carvão ativado de diferentes fontes de resíduo de biomassa. Métodos: trata-se de um estudo experimental, descritivo, de caráter quantitativo, realizado no Centro Universitário Católica de Quixadá, Ceará-Brasil, durante o período de janeiro a junho de 2018. Foram preparados filtros de carvão ativados e, posteriomente, sua eficiência no tratamento de água foi avaliada. Resíduos de descarte de madeira, a entrecasca do coco verde, a casca do fruto do caju e do colmo de bambu foram usados como fonte de matéria-prima. O filtro de tratamento de água foi montado, usando o método coluna de cromatografia, adicionando areia e algodão como outros meios filtrantes. Parâmentros físico-químicos foram utilizados na avaliação da eficiência dos filtros construídos. Resultados: a análise de componente principal selecionou dois componentes da qualidade de água, explicando 80,081% da variância total. O coeficiente de correlação cofenética de r=0.9572 indica que o dendograma estimado foi bom, considerando os parâmetros de qualidade da água. Entre os filtros, o bambu apresentou-se como melhor resposta entre filtros testados, sendo responsável pela redução de diversos fatores como cor, turbidez, dureza total e sódio. Conclusão: os fitros de carvão ativado derivado do descarte de madeira e da entrecasca do fruto do caju obtiveram pouca influência na melhoria da qualidade da água, em relação à amostra controle.

Objective: to evaluate the efficiency of water treatment filters using activated carbon from different sources of biomass residue. Methods: this is a descriptive experimental study of a quantitative nature carried out at the Centro Universitário Católica de Quixadá, Ceará-Brazil, during the period from January to June 2018. Activated carbon filters were prepared, and subsequently, their efficiency in water treatment was evaluated. Wood waste, green coconut husk, cashew nut shell, and bamboo stem were used as a source of raw material. The water treatment filter was assembled using the column chromatography method by adding sand and cotton as other filter media. Physicochemical parameters were used to evaluate the efficiency of the built filters. Results: principal component analysis selected two water quality components, explaining 80.081% of the total variance. The cophenetic correlation coefficient of r=0.9572 indicates that the estimated dendrogram was good, considering the water quality parameters. Among the filters, bamboo showed the best response among the filters tested, being responsible for the reduction of several factors such as color, turbidity, total hardness, and sodium. Conclusion: activated carbon filters derived from discarded wood and cashew nut shells had little influence on improving water quality compared to the control sample.

Desenvolvimento de jogos didáticos para o ensino de Bioquímica / Development of educational games for biochemical education

A Pesquisa de Educação em Bioquímica investiga aspectos relacionados ao ensino-aprendizagem, principalmente no ensino superior. Dentre as alternativas às aulas expositivas, os jogos didáticos apresentam-se como recursos que promovem a elaboração de estratégias, a tomada de decisão, o intercâmbio de informações entre os pares, etc. Estas características configuram os jogos didáticos como ferramentas importantes para a aprendizagem ativa. O objetivo deste trabalho foi desenvolver jogos didáticos para o ensino de bioquímica. Para elaboração dos objetos de ensino, utilizou-se uma estratégia baseada em três etapas: definição das características educativas, elaboração do design conceitual e desenvolvimento do jogo e pré-avaliação. A partir da gravação e transcrição de áudio de algumas partidas dos jogos e, quando possível, por questionários, foram feitas avaliações preliminares a fim de inferir o potencial educacional dos recursos didáticos. Dois jogos didáticos foram desenvolvidos: "Pura Proteína! Uma Experiência no Laboratório de Bioquímica" e "Perfil Lipídico". O objetivo principal do primeiro jogo foi desenvolver competências de planejamento e teste de hipóteses cientificas a partir da simulação de experimentos de purificação de proteínas. A construção deste material foi fundamentada em preceitos teóricos do Ensino por Investigação. Pura Proteína é constituído por um tabuleiro e cerca de 4000 cartas e fichas. Os jogadores, ao início do jogo, recebem um desafio: obter uma determinada quantidade de uma proteína específica, purificada a partir de uma solução composta por uma mistura de proteínas. Para a consecução desse objetivo os estudantes recebem informações sobre alguns métodos de purificação de proteínas mais utilizados. Para vencer, os participantes devem combinar métodos de forma eficaz a obter, antes dos outros jogadores, a quantidade de proteína pura desejada. O jogo foi aplicado com estudantes de graduação em Biomedicina e foi feita uma análisedo processo investigativo que empregavam. Verificou-se que o jogo foi capaz de promover a elaboração de um plano de trabalho, tomada de decisão a partir de argumentações, teste e verificação de hipóteses, ao mesmo tempo em que promovia a diversão. O segundo jogo desenvolvido foi "Perfil Lipídico", por meio do qual pretendeu-se explorar a diversidade das estruturas de lipídeos e os grupos químicos que os compunham. O jogo dispõe de quinze lipídeos, distribuídos em ácidos graxos e lipídeos complexos e, para vencer, os jogadores devem descobrir a identidade de um lipídeo a partir de dicas e desenhar sua estrutura. A prática do jogo permitiu diagnosticar pequenos erros conceituais dos jogadores, revelados ao desenhar as estruturas. Ao responder um questionário, os participantes atestaram que este jogo era motivador, de fácil aplicação em sala de aula e que permitiu revisar a estrutura dos lipídeos. Os dois jogos, com objetivos educacionais muito diferentes, foram desenvolvidos a partir de uma estratégia rigorosa, que permitiu o equilíbrio entre as funções lúdicas e educativas, necessário para o sucesso desta estratégia em sala de aula. Em razão da pandemia da COVID-19, os jogos não puderam ser aplicados com o público apropriado, o que impediu uma avaliação mais robusta do potencial educacional. Os dados coletados, no entanto, forneceram indícios de que ambos os objetos de ensino são eficazes para promover o aprendizado de bioquímica, ao mesmo tempo que a diversão própria do jogo

Biochemical Education research focuses on aspects related to teaching and learning, mostly in higher education. Among several methodological alternatives to traditional classes, educational games are tools that promote the development of problem-solving strategies, decision-making, peer exchange of information, etc. These features make educational games valuable tools for active learning. The main goal of the work herein presented was to develop educational games for Biochemical Education. For this purpose, a three-step based strategy was designed: definition of educational features, conceptual game design and development and evaluation. To assess educational potential, qualitative data were obtained by recording and transcribing audio captured during plays, and, when possible, questionnaires were applied. Two educational games were developed: "Pure Protein! An Experiment in the Biochemistry Lab" and "Ten Questions - Lipids". The main learning purpose of the first game was to develop skills in planning and testing scientific hypotheses through a simulation of a protein purification experiment. The game development was based on an Inquirybased learning approach. Pure Protein is a board game set-up with ca. 4000 cards. Players are challenged to obtain an amount of a specific protein, purified from a protein solution. To achieve this goal, students receive general information about common methods used to purify proteins. To win, contestants should efficiently combine methods to obtain the needed protein before their adversaries. The game was applied to Biomedicine undergraduate students, and an analysis of the inquiry process they went through was done. It was verified that the game promotes elaboration of a working plan, decision-making supported by arguments, testing and verifying hypotheses while being a fun and enjoyable activity. The second game is called "Ten Questions - Lipids", by which we intended to explore the structural diversity of lipids and the chemical groups in their composition. The game is based on fifteen molecules, ranging from fattyacids to complex lipids. The goal is to figure out the identity and the structure of a given lipid, using clues given throughout the gameplay. The game application allowed us to assess players conceptual mistakes revealed by their drawings of chemical structures. In questionnaire answers, students stated that the game was motivating, suitable for the classroom and that it promoted the review of lipid structures. Both games, with different learning objectives, were developed using a rigorous strategy, which enables the balance between the ludic and educational functions needed to achieve educational game success. Due to the COVID-19 pandemic, the games werent properly evaluated with different, larger groups. Nevertheless, the collected data suggest that the teaching objects are efficient both in promoting biochemical learning and fun

Isolamento e caracterização das toxinas causadoras de priapismo do veneno do escorpião Leiurus quinquestriatus

Scorpionism is considered a serious public health issue around the world. One of the most important species is the Leiurus quinquestriatus, popularly known as `Death seeker`. It is predominantly found in the Saara and the Arabic peninsula. Its venom causes autonomic reactions as blood pressure oscillations, hypersalivation. Priapism is frequently associated to this scorpion sting. Considering the importance of this issue, the primary objective of this study is to isolate and characterize the toxin(s) involved in priapism present in this venom. Crude desiccated venom was obtained from a qualified commercial supplier. The activity-driven purification strategy was employed in which RP-HPLC steps were developed in order to achieve the highest purity of a fraction capable of inducing priapism in mice. We successfully isolated a fraction named 10C, composed by isoforms. The fraction was further analyzed by MALDI-TOF and ESI-IT- TOF/MS after reduction, alkylation and trypsin digestion and yielded a predominant molecular mass of 7230Da. Comparing the partial sequences in public databases for toxins, we identified similarities with eight toxins: Alpha-insect toxin (Lqq3), Alpha-toxin (Lqq4); Alpha-like toxin (Lqh6); Alpha-mammal toxin (Lqq5); Alpha-like toxin (Lqh3); Alpha-mammal toxin (Lqh2); Neurotoxin 2; Neurotoxin h3.1. The fraction 10C seems to produce fewer side effects as hypersalivation and death than other priapism-inducing toxins isolated from spiders previously studied by our group. Next steps include the complete proteomics of the L. quinquestriatus venom, as well as the identification of the target of these toxins by affinity chromatography and other methods.

O escorpionismo é considerado como um grave problema de saúde pública mundial, considerada uma das espécies mais venenosa, Leiurus quinquestriatus, conhecido popularmente como o perseguidor da morte, encontrada principalmente na região do Saara e a Península Árabe, seu veneno causa manifestações sistêmicas como consequência da hiperativação do sistema nervoso autônomo, levando à sintomas como o priapismo, um efeito incomum à picada do escorpião. O priapismo tem sido descrito com frequência em casos de acidentes por este escorpião. Tendo em vista a relevância desse tema, o objetivo deste trabalho é purificar e isolar o peptídeo responsável por causar o priapismo presente em seu veneno. O veneno bruto dessecado foi adquirido de fornecedor comercial qualificado. As etapas de purificação foram desenvolvidas empregando-se o HPLC em coluna de fase reversa. Foi usada a estratégia de purificação acompanhada de atividade, na qual as frações de veneno obtidas em cada etapa eram testadas quanto a ação do priapismo. Com esta estratégia conseguimos isolar uma fração que se denominou 10C. A fração foi analisada por espectrometria de massa MALDI-TOF e ESI-IT-TOF/MS. Foi encontrado para o pico 10C a massa molecular predominante de 7230Da. A avaliação das sequencias de amino ácidos obtidos após redução e digestão parcial, em comparação contra bases de dados de toxinas mostrou similaridade com oito peptídeos, a saber: Alpha-insect toxin (Lqq3), Alpha-toxin (Lqq4); Alpha-like toxin (Lqh6); Alpha-mammal toxin (Lqq5); Alpha-like toxin (Lqh3); Alpha-mammal toxin (Lqh2); Neurotoxin 2; Neurotoxin h3.1. Os testes em animais sugerem que haja menos efeitos secundários como hipersalivação e morte. Nos próximos passos será realizado o estudo proteômico do veneno bruto e a análise de receptores para esta classe de toxinas com a utilização de técnicas de cromatografia de afinidade.

Purificação da imunoglobulina M a partir da utilização de frações do plasma humano empregando técnicas de cromatografia líquida

Immunoglobulin M (IgM) is a pentamer of approximately 950kDa, consisting of two heavy chains of 75kDa each, two light chains of 25kDa and a J chain of 15kDa. IgM is a promising therapeutic candidate due to increasing evidence suggesting its potential as a tumor marker, anti-inflammatory and immunomodulatory activities. In order to exploit its full potential, it is important that large amounts of IgM are available at low cost. In this work, two purification steps that were already being developed by the laboratory were explored. Purification by metal affinity chromatography (IMAC) and cation exchange of the pool from plasma purification on Sepharose 4FF followed by ANX Sepharose FF was evaluated. In IMAC, the purification was evaluated at pHs 5.0, 6.0 and 7.0 and the results indicate that with pH 6.0 in IMAC-Co2+ we obtained IgM with better recovery and greater purity. By varying the NaCl concentration in the equilibrium buffer between 250mM and 500mM, we found that IgM was obtained with greater purity in the purification in which 250mM NaCl was used in the equilibrium buffer. Using the cation exchange column, the results obtained were not satisfactory. The purity of IgM, calculated by the ImageJ program, was approximately 75%. To increase the purity of IgM, purification on the Superdex 200 gel filtration column will be evaluated.

A imunoglobulina M é um pentâmero de aproximadamente 950kDa, sendo composto por duas cadeias pesadas de 75kDa cada, duas cadeias leves de 25kDa e uma cadeia J de 15kDa. IgM é um candidato terapêutico promissor devido ao aumento de evidências que sugerem seu potencial de marcador tumoral, atividades anti-inflamatória e imunomoduladoras. Com o intuito de que todo seu potencial seja explorado, é importante que grandes quantidades de IgM estejam disponíveis a baixo custo. Nesse trabalho foram exploradas duas etapas de purificação que já estavam sendo desenvolvida pelo laboratório. Aplicou-se cromatografia de afinidade ao metal (IMAC) na fração 350mM proveniente da ANX Sepharose FF, com o intuito de obter IgM com alto grau de pureza. Foi observado que a melhor faixa de trabalho foi em pH 6,0 utilizando como metal imobilizado o cobalto e solução contendo NaCl 250mM. Como segunda estratégia, aplicou-se cromatografia de troca catiônica na fração 350mM diluído 10 vezes com água purificada e ao contrário da IMAC, não obtivemos resultados satisfatórios em relação a pureza de IgM. Apesar dos resultados alcançados, ainda é necessário o desenvolvimento de novas estratégias e estudos para o aumento de IgM, a fim de se obter uma imunoglobulina mais pura para possível uso terapêutico.

Purificação e caracterização inicial de ativadores pró-coagulantes: ativadores de fator de II e/ou X do veneno da serpente Bothrops jararaca

Annually, about 40,000 persons are stricken by snake bite accidents in Brazil, being most of the cases are inflicted by Bothrops genus, whose venom can induce serious pathophysiological effects, mainly disorders in hemostasis. Bothrops jararaca venom is characterized by three main actions: proteolytic, coagulant and hemorrhagic. Some clotting factors can be activated by components present in the venom, classified as pro-coagulant activators, responsible for activating factor X or factor II of the coagulation cascade, generating thrombin. So far, only one procoagulant activator of Bothrops jararaca venom BjV has been characterized, bothrojaractivase, a 23 kDa PI-type metalloproteinase. In this work, we used chromatographic techniques to isolate other procoagulant components of BjV. Thus, by means of affinity chromatographies, BjV was purified on HisTrap and Blue Sepharose resins. Fractions capable of coagulating human fibrinogen and rabbit plasma were obtained, and this last substrate is only coagulated by pro-coagulant activators of BjV. Such fractions with high clotting activity were analyzed, concentrated and their activities on different substrates were differentiated by the use of specific inhibitors of metalloproteinases and serine proteinases. Studies are still being carried out to understand which coagulation factors are being activated by these fractions, by using chromogenic substrates, electrophoresis runs, and mass spectrometry.

Anualmente, cerca de 40.000 pessoas são acometidas por acidentes ofídicos no Brasil, sendo a maioria dos casos decorrentes de serpentes do gênero Bothrops, cujo veneno pode induzir graves efeitos fisiopatológicos, principalmente distúrbios na hemostasia. O veneno da espécie Bothrops jararaca é caracterizado por três ações principais: proteolítica, coagulante e hemorrágica. Relacionado à atividade coagulante, alguns fatores da cascata de coagulação podem ser ativados por componentes presentes no veneno, classificados como ativadores do tipo pró-coagulantes, responsáveis por ativar o fator X ou o fator II da cascata, gerando trombina. Até o momento, apenas um ativador pró-coagulante do veneno de Bothrops jararaca BjV foi caracterizado, a bothrojaractivase, uma metaloproteinase do tipo PI, de 23 kDa. Neste trabalho, utilizamos técnicas cromatográficas para isolar outros componentes pró-coagulantes do BjV. Deste modo, por meio de cromatografias de afinidade, o BjV foi purificado em resinas de HisTrap e Blue Sepharose. Foram obtidas frações capazes de coagular o fibrinogênio humano e plasma de coelho, um substrato que somente é coagulado por enzimas pró-coagulantes do BjV. Tais frações com altas atividades coagulantes foram analisadas, concentradas e suas atividades sobre diferentes substratos foram diferenciadas pelo uso de inibidores específicos de metaloproteinases e serinaproteinases. Obtivemos duas frações parcialmente purificadas, com alta atividade específica, e que são inibidas por quelante de metais divalentes o-fenantrolina. Essas frações são capazes de coagular o plasma de coelho, sem coagular o fibrinogênio humano. Estudos ainda estão sendo realizados para entender quais fatores da cascata de coagulação estas frações ativam, pela utilização de substratos cromogênicos específicos, análises eletroforéticas e espectrometria de massa.

Characterization and distribution of viridans group streptococci isolated from infectious endophthalmitis and keratitis / Caracterização e distribuição de estreptococos do grupo viridans isolados de endoftalmite infecciosa e ceratite

ABSTRACT Purpose: The aims of this study were to characterize alpha-hemolytic streptococci among isolates from cases of infectious endophthalmitis and keratitis and to determine their distributions. Methods: The sample included 27 and 35 nonduplicated isolates of alpha-hemolytic streptococci recovered from patients with infectious endophthalmitis (2002-2013) and keratitis (2008-2013), respectively. Isolates were identified by the optochin susceptibility and bile solubility tests, using a biochemical identification system. The minimum inhibitory concentration was determined by the broth microdilution method. Molecular identification was performed by analyses of three constitutive genes and the complementary multilocus sequence. The molecular epidemiology of Streptococcus pneumoniae was investigated using multilocus sequence typing, and the presence of the capsular polysaccharide-encoding gene was assessed using conventional polymerase chain reaction. Outcomes were evaluated using the patients' medical records. Results: Phenotypic tests differentiated S. pneumoniae from other alpha-hemolytic streptococci, consistent with later molecular identifications. Streptococcus oralis was significantly prevalent among the endophthalmitis isolates, as was S. pneumoniae in the keratitis isolates. High levels of susceptibility to antibiotics were observed, including vancomycin, cephalosporins, and fluoroquinolones. High genetic variability was detected among the 19 S. pneumoniae strains, with 15 predicted to be encapsulated. The medical records of patients with infectious endophthalmitis were reviewed (n=15/27; 56%), and final visual acuity was assessed in 12 cases (44%). Many patients progressed to a final visual acuity state of "no light perception" (6/12; 50%), "light perception" (3/12; 25%), or "hand motion" (1/12; 8%). The medical records of patients with infectious keratitis were also reviewed (n=24/35; 69%), and final visual acuity was assessed in 18 cases (51%). Similarly, most patients progressed to a final visual acuity state of "no light perception" (6/18; 33%), "light perception" (1/18; 6%), or "hand motion" (6/18; 33%). Overall, the majority of patients progressed to a final visual acuity state of "no light perception" (12/30), "light perception" (4/30), or "hand motion" (7/30). Conclusions: The distribution of alpha-hemolytic streptococci in ocular infections suggested the presence of a species-specific tissue tropism. The prognoses of patients with ocular streptococcal infections were highly unfavorable, and antibiotic resistance did not contribute to the unfavorable clinical progressions and poor outcomes.

RESUMO Objetivo: O objetivo deste estudo foi caracterizar os estreptococos alfa-hemolíticos isolados de endoftalmite infecciosa e ceratite e determinar sua distribuição. Métodos: A amostra incluiu 27 e 35 isolados não-duplicados de estreptococos alfa-hemolíticos recuperados de pacientes com endoftalmite infecciosa (2002-2013) e ceratite (2008-2013), respectivamente. Os isolados foram identificados pelos testes de suscetibilidade à optoquina e bile solubilidade, utilizando um sistema de identificação bioquímica. A concentração inibitória mínima foi determinada pelo método de microdiluição em caldo. A identificação molecular foi realizada pela análise de três genes constitutivos e análise complementar de sequências multilocus. A epidemiologia molecular do Streptococcus pneumoniae foi investigada por tipagem de sequência multilocus, e a presença do gene codificador do polissacarídeo capsular foi avaliada por reação em cadeia da polymerase convencional. Os resultados foram avaliados utilizando os prontuários médicos dos pacientes. Resultados: Os testes fenotípicos diferenciaram S. pneumoniae dos outros estreptococos alpha-hemolíticos, consistentes com identificações moleculares posteriores. S. oralis foi significativamente prevalente entre os isolados de endoftalmite, assim como S. pneumoniae nos isolados de ceratite. Foram observados altos níveis de suscetibilidade a antibióticos, incluindo vancomicina, cefalosporinas e fluoroquinolonas. Alta variabilidade genética foi detectada entre as 19 cepas de S. pneumoniae, com 15 previstas para serem encapsuladas. Os prontuários médicos dos pacientes com endoftalmite infecciosa foram revisados (n=15/27; 56%), e a acuidade visual final foi avaliada em 12 casos (44%). Muitos pacientes evoluiram para um estado final de acuidade visual de "sem percepção luminosa" (6/12; 50%), "percepção luminosa" (3/12; 25%) ou "movimentos de mãos" (1/12; 8%). Também foram revisados os prontuários médicos dos pacientes com ceratite infecciosa (n=24/35; 69%), e a acuidade visual final foi avaliada em 18 casos (51%). Da mesma foram, a maioria dos pacientes evoluiu para um estado final de acuidade visual de "sem percepção luminosa" (6/18; 33%), "percepção luminosa" (1/18; 6%) ou "movimentos de mãos" (6/18; 33%). No geral, a maioria dos pacientes evoluiu para um estado final de acuidade visual de "sem percepção luminosa" (12/30), "percepção luminosa" (4/30) ou "movimentos de mãos" (7/30). Conclusões: A distribuição de estreptococos alfa-hemolíticos nas infecções oculares sugeriu a presença de um tropismo de tecido específico da espécie. Os prognósticos dos pacientes com infeções oculares por estreptococos foram altamente desfavoráveis e a resistência a antibióticos contribuiu não para as progressões clínicas des­favoráveis e os maus resultados.

Produção do Oligômero B da toxina pertussis para uso como adjuvante: etapas iniciais e perspectivas / Production of Oligomer B of pertussis toxin for use as an adjuvant: initial steps and perspectives

Butantan Institute produces a whole cell pertussis vaccine through the fermentation, purification and inactivation processes of Bordetella pertussis cells. B. pertussis is a gram- negative cocobacillus that produces several virulence factors, including adhesins and toxins. Pertussis toxin (PT) is a major virulence factor of B. pertussis and it is considered a key component of the protective immune response against B. pertussis. It has been suggested that the protective efficacy of the whole-cell vaccine may in part be related to residual active PT, and the B oligomer of PT has already been demonstrated to act as adjuvant. The present work aimed to produce the B oligomer and evaluate it as an adjuvant for vaccines produced at Butantan Institute. To obtain oligomer B, the bacterium B. pertussis was grown in a solid medium Bordet & Gengou followed by cultivation in liquid medium to be inoculated in the horizontal Wave bioreactor. The production cultures were performed with 100 mL of the above inoculum in a total of 1 L fermentation, in the Wave horizontal bioreactor for at least 20 hours with controlled temperature and agitation. During the upstream steps, we performed the in-process control, evaluating the following parameters: pH, dissolved oxygen, opacity, optical density at 590 nm (OD590nm), microscopy (Gram staining) and presence of agglutinogens. After cultivation, in the downstream process, centrifugation was performed followed by sterile filtration of the supernatant. To check the production of PT toxin, SDS- PAGE electrophoresis and Western Blotting analysis were performed using a NIBSC reference PT, JNIH-5 (10 mg/mL) and the primary antibody NIBSC Anti-Pertussis PT JNIH- 12. For purification of the pertussis toxin, we performed ion exchange chromatography, using HiTrap CM Fast Flow column. The sample was applied to the column in 50 mM sodium phosphate buffer containing 2 M urea (equilibration buffer), pH 6.0. Then, PT was eluted from the column with Buffer A (pH 7.4) and after elution of PT, FHA was eluted in a gradient of 0-50% buffer A and B (50 mM sodium phosphate pH 7.4 containing Urea 2 M and 1 M NaCl) in a flow of 3 mL/min. After the samples were eluted, the column was washed with 100% buffer B (5 column volumes). Growth in the Wave horizontal bioreactor resulted in cultures with an opacity of 50 UOp/mL, O.D (590nm) of 2.47 and a change in pH between 6.5 and 7.8 during the time of cultivation. The agglutinogen test showed the presence of Agg1, Agg2 and Agg3. Microscopic analysis revealed characteristic gram-negative cells of B. pertussis. The analysis by SDS-PAGE and Western blotting showed bands compatible with those of the positive control, corresponding to the PT subunits. In chromatography, the proteins were eluted separately from the same column and the SDS-PAGE and Western blotting showed separate bands of PT and FHA. As a perspective, after the purification of oligomer B, we will evaluate its potential as a vaccine adjuvant.

O Instituto Butantan produz uma vacina contra pertussis de células inteiras através dos processos de fermentação, purificação e inativação das células de Bordetella pertussis. B. pertussis é um cocobacilo gram-negativo que produz vários fatores de virulência, incluindo adesinas e toxinas. A toxina pertussis (PT) é um fator de virulência importante de B. pertussis e é considerada um componente-chave da resposta imune protetora contra B. pertussis. Foi sugerido que a eficácia protetora da vacina de células inteiras pode, em parte, estar relacionada à PT ativa residual, e já foi demonstrado que o oligômero B da PT atua como adjuvante. O presente trabalho teve como objetivo produzir o oligômero B purificado a partir de cultivos de B. pertussis a fim de avaliá-lo como adjuvante de vacinas. Para obtenção do oligômero B, a bactéria B. pertussis foi cultivada em meio sólido Bordet & Gengou seguida por cultivos em meio de cultura líquido e por produção em biorreator horizontal Wave. O cultivo de produção em Wave foi realizado num volume total de 1 L de fermentação por 20 horas, com temperatura e agitação controladas. Durante as etapas de upstream, realizamos os controles em processo, avaliando os seguintes parâmetros: pH, oxigênio dissolvido, opacidade, densidade óptica a 590 nm (D.O 590nm), microscopia (coloração de Gram) e presença de aglutinógenos. Após o cultivo, as células foram separadas do sobrenadante através de centrifugação. O sobrenadante foi filtrado estéril em membranas de 0,22 um. Para verificar a presença da toxina PT, foram realizadas eletroforese por SDS-PAGE e análise Western Blotting usando uma PT de referência NIBSC, JNIH-5 (10 mg/mL) e o anticorpo primário NIBSC Anti-Pertussis PT JNIH-12. Para a purificação da toxina pertussis foi usada cromatografia de troca iônica. A amostra foi aplicada à coluna HiTrap CM Fast Flow em tampão 50 mM fosfato de sódio contendo ureia 2 M (tampão de equilíbrio), pH 6,0. Em seguida, a PT foi eluída da coluna com Tampão A (pH 7,4) e após a eluição da PT, a FHA foi eluída em gradiente de 0-50% tampão A e B (50 mM fosfato de sódio pH 7,4, contendo Ureia 2 M e NaCl 1 M), num fluxo de 3 mL/min. Após a eluição das amostras, a coluna foi lavada com 100% tampão B (5 volumes de coluna).O crescimento no biorreator horizontal Wave resultou em cultivos com opacidade de 50 UOp/mL, D.O (590nm) de 2,47 e alteração no pH entre 6,5 e 7,8 durante o tempo de cultivo. O teste de aglutinógenos mostrou a presença de Agg1, Agg2 e Agg3. A análise microscópica revelou células gram-negativas características de B. pertussis. A análise por SDS-PAGE e Western blotting mostrou bandas compatíveis com as do controle positivo, correspondentes às subunidades de PT. Na cromatografia, as proteínas foram eluídas separadamente da mesma coluna, e o SDS–PAGE e o Western blotting mostraram as bandas separadas de PT e FHA. Como perspectiva, após a purificação do oligômero B, avaliaremos seu potencial como adjuvante de vacinas.

Purificação de IgM do plasma humano empregado cromatografia líquida

Immunoglobulin M (IgM) is a pentameter of approximately 950 kDa and Each subunit is composed of two heavy chains of about 65 kDa, two light chains of 25 kDa and one J or junction chain, with a molecular weight of about 15 kDa. IgM is a promising therapeutic candidate. In the world the first human IgM-enriched immunoglobulin is Pentaglobin ® , it is superior to normal IgG preparations in eliminating infectious pathogens and neutralizing their endoexotoxins. In this work we purified IgM from human plasma with a Sepharose 4FF size exclusion column and modified the cut defined in previous experiments of fraction 2 (IgM enriched fraction), aiming at higher purity and elimination of contaminating proteins, we applied the fraction in the anionic exchange column ANX Sepharose FF and in the affinity column IMAC Co2+. Objectives: To verify the IgM purification strategy using the filtration gel columns, followed by ion exchange and metal affinity chromatography after modifying the location of the cut of the filtration gel column fraction and analyze IgM yield after this modification. Materials and Methods: Plasma was applied directly to the Sepharose 4FF filtration gel column. The IgM rich fraction was subsequently applied to the ANX Sepharose FF anion exchange column, the fraction with the highest IgM recovery was applied to an IMAC Co2+ metal affinity column at pH 5.0 and pH 6.0 O collected from all fractions were analyzed by the Bradford test, polyacrylamide gel and turbidimetry. Results and discussion: The new cut of fraction 2 of Sepharose 4 FF was not higher than the IgM yield, but twice as much total immunoglobulins were recovered, in the ANX column Sepharose 4 FF was recovered 77% of IgM in the fraction 350mM-1, but in this fraction it contains only 60% of immunoglobulins (IgM and IgA), requiring a new purification step, and IgG and Albumin do not bind strongly to the column, eluted in the flowthrough, allowing a good separation of these proteins. The 350mM fraction was applied to the IMAC Co2+ affinity column to increase igM purity at pH 5.0 and 6.0, the IgM recovery in the flowthroug is similar, but in the polyacrylamide gel of pH 6.0 it is possible to analyze that the high mass proteins bind more strongly to the column than at pH 5.0, and in quantitative tests the purification factor of pH 6.0 is higher than pH 5.0.Conclusion: The new cut of fraction 2 of the Sepharose 4FF column was not efficient in reducing contaminant proteins and IgM yield, the ANX Sepharose FF column is efficient in separating IgG and albumin from IgM even with higher protein load, the metal affinity column IMAC Co2+ was not effective in separating total IgM from contaminant proteins even at different pH's employed, and new strategies and studies for increasing immunoglobulin purity need to be developed.

A imunoglobulina M (IgM) é um pentâmero de aproximadamente 950 kDa e cada subunidade é composta por duas cadeias pesadas de cerca de 65 kDa, duas cadeias leves de 25 kDa e uma cadeia J ou de junção, com um peso molecular de cerca de 15 kDa. IgM é como candidato terapêutico promissor. No mundo a primeira imunoglobulina humana enriquecida com IgM é Pentaglobin ® , ele é superior às preparações normais de IgG na eliminação de patógenos infecciosos e neutralização de suas endo-exotoxinas. Neste trabalho purificamos IgM do plasma humano com uma coluna de exclusão por tamanho Sepharose 4FF e modificamos o corte definido em experimentos anteriores da fração 2 (fração enriquecida com IgM), visando de maior pureza e eliminação de proteínas contaminantes, aplicamos a fração na coluna de troca aniônica ANX Sepharose FF e na coluna de afinidade IMAC Co2+. Objetivos: Verificar a estratégia de purificação de IgM empregando as colunas de gel filtração, seguida de troca iônica e cromatografia de afinidade a metal após a modificação da localização do corte da fração da coluna de gel filtração e analisar rendimento de IgM após esta modificação. Materiais e Métodos: O plasma foi aplicado diretamente na coluna de gel filtração Sepharose 4FF. A fração rica em IgM e foi posteriormente aplicado na coluna de troca aniônica ANX Sepharose FF, a fração com maior recuperação de IgM foi aplicada em uma coluna de afinidade a metal IMAC Co2+ em pH 5,0 e pH 6,0 O recolhido de todas as frações foram analisadas pelo ensaio de Bradford, gel de poliacrilamida e turbidimetria. Resultados e discussão: O novo corte da fração 2 da Sepharose 4 FF não se apresentou superior em relação ao rendimento de IgM, porem o dobro de imunoglobulinas totais foram recuperadas, na coluna ANX Sepharose 4 FF foi recuperada 77% da IgM na fração 350mM-1, porém nesta fração contém apenas 60% de imunoglobulinas (IgM e IgA), necessitando de uma nova etapa de purificação, e IgG e a Albumina não se ligam fortemente a coluna, eluiram no flowthrough, permitindo uma boa separação dessas proteínas. A fração 350mM foi aplicada na coluna de afinidade IMAC Co2+ para aumento da pureza de igM em pH 5,0 e 6,0, a recuperação de IgM no flowthroug são parecidos, porém no gel de poliacrilamida do pH 6,0 é possível analisar que as proteínas de alta massa se ligam mais fortemente a coluna que no pH 5,0, e em ensaios quantitativos o fator de purificação do pH 6,0 é superior ao pH 5,0.Conclusão: O novo corte da fração 2 da coluna Sepharose 4FF não foi eficiente para a diminuição de proteínas contaminantes e rendimento de IgM, a coluna ANX Sepharose FF é eficiente na separação de IgG e albumina da IgM mesmo com maior carga de proteínas, a coluna de afinidade a metal IMAC Co2+ não se mostrou efetiva na separação total de IgM de proteínas contaminantes mesmo em diferentes pH’s empregados, sendo necessário desenvolvimento de novas estratégias e estudos para o aumento de pureza das imunoglobulinas.

Effectiveness of vertical subsurface wetlands for iron and manganese removal from wastewater in drinking water treatment plants / Eficacia de humedales subsuperficiales verticales en la remoción de hierro y manganeso de aguas residuales de plantas potabilizadoras / Eficácia das zonas úmidas subsuperficiais verticais na remoção de ferro e manganês das águas residuais de estações de tratamento de água potável

Abstract Population growth and urbanization pose a greater pressure for the treatment of drinking water. Additionally, different treatment units, such as decanters and filters, accumulate high concentrations of iron (Fe) and manganese (Mn), which in many cases can be discharged into the environment without any treatment when maintenance is performed. Therefore, this paper evaluates the effectiveness of vertical subsurface wetlands for Fe and Mn removal from wastewater in drinking water treatment plants, taking a pilot scale wetland with an ascending gravel bed with two types of plants: C. esculenta and P. australis in El Hormiguero (Cali, Colombia), as an example. The pilot system had three upstream vertical wetlands, two of them planted and the third one without a plant used as a control. The wetlands were arranged in parallel and each formed by three gravel beds of different diameter. The results showed no significant difference for the percentage of removal in the three wetlands for turbidity (98 %), Fe (90 %), dissolved Fe (97 %) and Mn (98 %). The dissolved oxygen presented a significant difference between the planted wetlands and the control. C. esculenta had the highest concentration of Fe in the root with (103.5 ± 20.8) μg/g; while P australis had the highest average of Fe concentrations in leaves and stem with (45.7 ± 24) μg/g and (41.4 ± 9.1) μg/g, respectively. It is concluded that subsurface wetlands can be an interesting alternative for wastewater treatment in the maintenance of drinking water treatment plants. However, more research is needed for the use of vegetation or some technologies for the removal or reduction of the pollutant load in wetlands, since each drinking water treatment plant will require a treatment system for wastewater, which in turn requires a wastewater treatment system as well

Resumen El crecimiento de la población y la urbanización imponen una mayor presión al tratamiento de agua potable. Por otra parte, las diferentes unidades de tratamiento, como decantadores y filtros, acumulan altas concentraciones de hierro (Fe) y manganeso (Mn), las cuales, en muchos casos, son descargadas en el ambiente sin ningún tratamiento cuando se hace mantenimiento. Este artículo evalúa la efectividad de humedales subsuperficiales de flujo vertical para la remoción de Fe y Mn provenientes de agua residual en plantas de tratamiento de agua potable, tomando como ejemplo un humedal de flujo ascendente a escala piloto, con un lecho de grava y dos tipos de plantas: C. esculenta y P. australis en El Hormiguero (Cali, Colombia). El sistema piloto consistió en tres humedales verticales de flujo ascendente, dos de ellos plantados y el tercero sin plantas, como control. Los humedales se organizaron en paralelo, cada uno formado por tres lechos de grava de diferente diámetro. Los resultados mostraron que no hubo diferencia significativa en el porcentaje de remoción en los tres humedales para turbidez (98 %), Fe (90 %), Fe disuelto (97 %) y Mn (98 %). El oxígeno disuelto presentó una diferencia significativa entre los humedales plantados y el control. C. esculenta tuvo la concentración más alta de Fe en la raíz, con (103.5 ± 20.8) μg/g; mientras que P. australis tuvo el promedio más alto de concentraciones de Fe en hojas y tallos, con (45.7 ± 24) μg/g y (41.4 ± 9.1) μg/g, respectivamente. Se concluye que los humedales subsuperficiales pueden ser una alternativa interesante para el tratamiento de aguas residuales en el mantenimiento de plantas de tratamiento de agua potable. Sin embargo, se requiere más investigación sobre el uso de vegetación u otras tecnologías para la remoción o reducción de la carga contaminante en humedales, ya que cada planta de tratamiento de agua potable o su sistema de tratamiento de aguas residuales con humedales mantendrá el contaminante en el sistema.

Resumo O crescimento da população e da urbanização impõem uma maior pressão ao tratamento de água potável. Adicionalmente, as diferentes unidades de tratamento, como decantadores e filtros, acumulam altas concentrações de ferro (Fe) e manganês (Mn), as quais, em muitos casos, são liberadas no ambiente durante a manutenção, sem receber nenhum tipo de tratamento. Este artigo avaliou a eficácia de zonas úmidas subsuperficiais de fluxo vertical na remoção de Fe e Mn provenientes das águas residuais de estações de tratamento de água potável, usando como exemplo uma zona úmida a escala piloto com fluxo ascendente, leito de cascalho e dois tipos de plantas, C. esculenta e P. australis, localizada em El Hormiguero (Cali, Colombia). O sistema piloto usou três zonas úmidas verticais de fluxo ascendente, duas delas com plantas e a terceira sem plantas, como controle. As zonas húmidas foram organizadas em paralelo, cada uma sendo formada por três leitos de cascalho de diferente diâmetro. Os resultados mostraram que não houve diferença significativa na porcentagem de remoção das três zonas úmidas em termos de turbidez (98 %), Fe (90 %), Fe dissolvido (97 %) e Mn (98 %). O oxigênio dissolvido apresentou uma diferença significativa entre as zonas úmidas plantadas e a controle. C. esculenta teve a concentração mais alta de Fe na raiz, (103.5 ± 20.8) μg/g, em quanto P. au tralis teve a maior média de concentrações de Fe nas folhas e nos talos, (45.7 ± 24) μg/g e (41.4 ± 9.1) μg/g, respetivamente. Concluiuse que as zonas úmidas subsuperficiais podem ser uma alternativa interessante para o tratamento de águas residuais durante a manutenção de estações de tratamento de água potável. No entanto, mais pesquisa é necessária para determinar a importâncias do uso da vegetação ou outras tecnologias para a remoção ou diminuição da carga contaminante nas zonas úmidas, pois cada estação de tratamento de água potável ou sistema de tratamento de águas residuais com zonas úmidas irá manter oconaminante no sistema.

Enzymatic purification of glucomannan from Amorphophallus oncophyllus using α-Amylase / Purificação enzimática de glucomanan de amorphophallus oncophyllus usando α -amilasas

The international standards for top glucomannan flour require a minimum of 70% glucomannan. The glucomannan content of Amorphophallus oncophyllus flour was approximately 60%, with starch as the major impurity. Elimination of starch was expected to increase the purity of glucomannan. The purpose of this research was to study starch hydrolysis of the flour using α-amylase. Temperature (35.5-84.5oC), time (0.4-3.6 h) and pH (2.2-8.8) of hydrolysis were selected as independent variables. A central composite design of response surface methodology (RSM) was performed to obtain the optimum condition. This approach was a novelty of this enzymatic purification of A. oncophyllus. Glucomannan content, starch content, and solubility were chosen as the response variables. The models were reliable for predicting the responses (R2≥ 0.771). It was predicted that the highest glucomannan content (93.0%) obtained at the lowest starch content (1.14%), which hydrolysed at pH 6.17, 84.5oC and 3.6 h. Prior the verification of the optimum hydrolysed condition from the model, the glucomannan and starch content was 81.59% and 2.27%, respectively. After purification, the absorbance of the ß-1,4 glycosidic bond increased as a sign of higher glucomannan purity. A less rough surface and irregular shape of the grain morphology was observed after purification.

Os padrões internacionais para a farinha de alta calidade de glucomanan requerem um mínimo de 70% de glucomanan. O conteúdo de glucomanano da farinha de Amorphophallus oncophyllus foi de aproximadamente 60%, com o amido como a maior impureza. Esperava-se que a eliminação do amido aumentasse a pureza do glucomanan. O objetivo desta pesquisa foi estudar a hidrólise do amido da farinha usando α-amilase. A temperature (35,5-84,5oC), o tempo (0,4-3,6 h) e o pH (2,2-8,8) da hidrólise foram selecionados como variáveis independentes. Um desenho central composto pertencente á metodologia da superfície de resposta (MSR) foi realizado para obter a condição ótima. Esta abordagem foi uma novidade desta purificação enzimática de A. oncophyllus. O conteúdo de glucomanan, conteúdo de amido e solubilidade foram escolhidos como as respostas. Os modelos foram confiáveis para predizer as respostas (R2≥ 0,771). Os modelos indicaram que o maior conteúdo de glucomanan (93,0%) foram obtidos no menor conteúdo de amido (1,14%),que hidrolisou a um pH 6,17, 84,5ºC e 3,6 h. Antes da verificação da condição hidrolisada ótima do modelo, o conteúdo de glucomanan e amido foi de 81,59% e 2,27%, respectivamente. Após a purificação, a absorbância da ligação ß-1,4 glicosídica aumentou com um sinal de maior pureza de glucomanan. Uma superfície mais lisa e forma irregular da morfologia do grão foi observada após a purificação.

PEGylation strategy to the development of analytical and therapeutic proteins / Potencial da PEGuilação para o desenvolvimento de proteínas para fins terapêuticos e analíticos

Protein PEGylation is the covalent bonding of polyethylene glycol (PEG) polymers to amino acid residues of the protein and it is one of the most promising techniques for improving the therapeutic effect of biopharmaceuticals and long-term stability of protein-based biosensors. This chemical modification brings advantages to biopharmaceuticals, such as an increased half-life, enhanced stability, and reduced immunogenicity. Moreover, in the analytical field, PEGylation improves the multiple properties of protein-based biosensors including biocompatibility, thermal and long-term stability, and solubility in organic solvents. However, the use of PEGylated conjugates in the analytical and therapeutic fields has not been widely explored. The limited industrial application of PEGylated bioconjugates can be attributed to the fact that the reaction and separation steps are currently a challenge. The correct selection of the PEGylation reaction design and the purification process are important challenges in the field of bioconjugation. In this sense, the design and optimization of site-specific PEGylation reactions and application of aqueous biphasic systems (ABS) as purification platforms for PEGylated conjugates are the two main objectives of this thesis. Regarding the purification step, the efficient fractionation (i) of the PEGylated conjugates from the native protein and (ii) of the PEGylated conjugates based on their degree of PEGylation was studied. Centrifugal partition chromatography (CPC) was applied as a continuous regime platform based on ABS technology to efficiently purify the PEGylated proteins. The two proteins under study are L-asparaginase, an important biopharmaceutical applied in the treatment of acute lymphoblastic leukemia and cytochrome c, a promising biosensor. The current work developed in this thesis demonstrates the great potential of ABS in the fractionation of PEGylated proteins, under batch and continuous regime. In addition, in situ recovery of the PEGylated products through one-pot bioconjugation and ABS purification was successfully demonstrated for both enzymes studied. Although further research on scale-up is still required, the results presented show the relevance of ABS platforms for the development of separation processes of PEGylated proteins

A PEGuilação de proteínas é a ligação covalente de polímeros de polietilenoglicol (PEG) a resíduos de aminoácidos da proteína e é uma das técnicas mais promissoras para melhorar o efeito terapêutico dos biofármacos e a estabilidade a longo prazo de biossensores proteícos. Esta modificação química traz vantagens aos produtos biofarmacêuticos, como um aumento da meia-vida, maior estabilidade e imunogenicidade reduzida. Além disso, no campo analítico, a PEGuilação melhora as múltiplas propriedades dos biossensores baseados em proteínas, incluindo biocompatibilidade, estabilidade térmica e a longo prazo, e solubilidade em solventes orgânicos. No entanto, o uso de conjugados PEGuilados em campos analíticos e terapêuticos não tem sido amplamente explorado. A aplicação industrial limitada dos bioconjugados PEGuilados pode ser atribuída ao facto de as etapas de reacção e separação serem atualmente um desafio. A seleção correcta do design da reacção de PEGuilação e do processo de purificação são importantes desafios no campo da bioconjugação. Neste sentido, a concepção e otimização de reações de PEGuilação sítio-específicas e aplicação de sistemas aquosos bifásicos (ABS) como plataformas de purificação de conjugados PEGuilados são os dois principais objetivos desta tese. No que concerne à etapa de purificação foi estudado o eficiente fracionamento (i) dos conjugados PEGuilados, da proteína nativa e (ii) dos conjugados PEGuilados baseados no seu grau de PEGuilação. A cromatografia por partição centrífuga (CPC) foi aplicada como uma plataforma de regime contínuo baseada na tecnologia de ABS para purificar eficientemente as proteínas PEGuiladas. As duas proteínas em estudo são a L-asparaginase, importante biofármaco aplicado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda e o citocromo c, um potencial biossensor. A partir dos trabalhos desenvolvidos, é possível confirmar o grande potencial dos ABS no fracionamento de proteínas PEGuiladas, em regime contínuo e descontínuo. Além disso, a recuperação in situ dos produtos PEGuilados através da integração em uma única etapa de bioconjugação e purificação por ABS foi comprovada com sucesso para ambas as enzimas estudadas. Embora ainda sejam necessários estudos adicionais sobre a viabilidade destes sistemas em larga escala, os resultados aqui apresentados demonstram a relevância dos ABS para o desenvolvimento de processos de separação de proteínas PEGuiladas

Expressão da L-asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae recombinante extracelular com glicosilação humanizada em Pichia pastoris / Extracellular expression of Saccharomyces cerevisiae's L-asparaginase II in Pichia pastoris with humanized glycosylation

L-asparaginase é um inibidor eficiente do crescimento tumoral, usado em sessões de quimioterapia contra a Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), resultando na remissão completa da doença em 90% dos pacientes tratados. A L-asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae (ScASNaseII) tem alto potencial de superar os efeitos adversos da L-asparaginase de bactéria, porém sua produção endógena resulta em uma proteína hipermanosilada e, consequentemente, imunogênica. A cepa de Pichia pastoris Glycoswitch tem a maquinaria para expressar e secretar altas quantidades de enzima com glicosilação humanizada. Nesse trabalho, descrevemos o processo genético para expressar a ScASNaseII no meio extracelular pela P. pastoris Glycoswitch, e também os parâmetros bioquímicos, perfil cinético, citotoxicidade contra células leucêmicas e a interferência da glicosilação na atividade da enzima obtida. Nossos dados mostram que a cepa aplicada foi capaz de expressar ScASNaseII no meio extracelular passível de purificação de proteínas contaminantes com apenas um passo cromatográfico. A atividade específica para asparagina foi 218,2 UI/mg e a atividade glutaminásica representou 3,1% da atividade asparaginásica. Os parâmetros cinéticos foram KM = 120,5 µM e a eficiência catalítica de 3,8 x 105 M-1s-1. Análises por meio de gel nativo sugerem uma conformação tetramérica de aproximadamente 150 kDa. Essa é uma nova estratégia de produzir essa enzima de forma extracelular, com mais facilidade de purificação e com melhores propriedades biotecnológicas

L-asparaginase is an efficient inhibitor of tumor development, used in chemotherapy sessions against acute lymphoblastic leukemia (ALL) tumor cell; its use results in 90% complete remission of the disease in treated patients. Saccharomyces cerevisiae's L-asparaginase II (ScASNaseII) has a high potential to overcome the side effects of bacteria L-asparaginase, but the endogenous production of it results in hypermannosylated immunogenic enzyme. However, Pichia pastoris Glycoswitch strain has the machinery to express and secrete high quantity of the enzyme and with humanized glycosylation. Here we describe the genetic process to acquire the ScASNaseII in the extracellular medium expressed by P. pastoris Glycoswitch, and the biochemical properties of the resultant enzyme, kinetic profile, cytotoxicity against ALL cell line and the interference of glycosylation in its activity. Our data show that the strain employed is able to express extracellular asparaginase active and possible to be purified of contaminant proteins using a single chromatographic step. The specific activity using asparagine was 218.2 IU.mg-1 and the glutaminase activity represents 3.1% of its asparaginase activity. The kinetics parameters were KM=120.5 µM and a catalytic efficiency of 3.8x105 M-1s-1. The Native-PAGE suggested a tetrameric protein conformation, with approximately 150 kDa. This is a novel strategy to produce this enzyme extracellularly, easier to purify and with better biotechnological properties