ABSTRACT
O uso da biobalística na transformação genética de plantas requer a otimização de diversos parâmetros, entre eles, o desenvolvimento de protocolos para regeneração de plantas a partir de células transformadas. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de regeneração de plantas de milho a partir de calos embriogênicos e de explantes sementes divididas, submetidos à transformação por biobalística, utilizando o gene bar como marcador de seleção. Foram submetidos 2000 agrupamentos de calos embriogênicos de milho e 2000 explantes sementes divididas à transformação por biobalística. A seleção dos eventos de transformação foi realizada em meios de cultivo suplementados com glifosinato de amônio. As plântulas selecionadas foram aclimatadas e transplantadas para vasos em casa de vegetação. Com a utilização de embriogênese somática, a eficiência de regeneração foi de 0,2%, enquanto que, com a utilização de sementes divididas, a eficiência de regeneração foi de 1,3%. Embora ambos os protocolos possibilitem a regeneração de plantas de milho submetidas à transformação por biobalística, há a necessidade de aumentar sua eficiência.
The use of biolistic on genetic transformation of plants requires an optimization of several parameters, including the protocol development for plant regeneration from transformed cells. The objective of this research was to evaluate the regeneration efficiency of maize plants from embryogenic callus and explants from split seeds submitted to transformation by biolistic using the gene bar as a selectable marker. It was submitted 2000 clusters of embryogenic callus and 2000 divided maize seeds to transformation by biolistic. The selection of transformation events was in culture medium supplemented with ammonium glifosinate. Selected seedlings were acclimatized and transplanted to pots in a greenhouse. Using somatic embryogenesis, the regeneration efficiency was 0.2%, while using split seeds explants the regeneration efficiency was 1.3%. Although both protocols allow the maize plant regeneration after transformation by biolistic, there is a need to increase its efficiency.
ABSTRACT
O uso da biobalística na transformação genética de plantas requer a otimização de diversos parâmetros, entre eles, o desenvolvimento de protocolos para regeneração de plantas a partir de células transformadas. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de regeneração de plantas de milho a partir de calos embriogênicos e de explantes sementes divididas, submetidos à transformação por biobalística, utilizando o gene bar como marcador de seleção. Foram submetidos 2000 agrupamentos de calos embriogênicos de milho e 2000 explantes sementes divididas à transformação por biobalística. A seleção dos eventos de transformação foi realizada em meios de cultivo suplementados com glifosinato de amônio. As plântulas selecionadas foram aclimatadas e transplantadas para vasos em casa de vegetação. Com a utilização de embriogênese somática, a eficiência de regeneração foi de 0,2%, enquanto que, com a utilização de sementes divididas, a eficiência de regeneração foi de 1,3%. Embora ambos os protocolos possibilitem a regeneração de plantas de milho submetidas à transformação por biobalística, há a necessidade de aumentar sua eficiência.(AU)
The use of biolistic on genetic transformation of plants requires an optimization of several parameters, including the protocol development for plant regeneration from transformed cells. The objective of this research was to evaluate the regeneration efficiency of maize plants from embryogenic callus and explants from split seeds submitted to transformation by biolistic using the gene bar as a selectable marker. It was submitted 2000 clusters of embryogenic callus and 2000 divided maize seeds to transformation by biolistic. The selection of transformation events was in culture medium supplemented with ammonium glifosinate. Selected seedlings were acclimatized and transplanted to pots in a greenhouse. Using somatic embryogenesis, the regeneration efficiency was 0.2%, while using split seeds explants the regeneration efficiency was 1.3%. Although both protocols allow the maize plant regeneration after transformation by biolistic, there is a need to increase its efficiency.(AU)
Subject(s)
Regeneration , Zea mays/genetics , Transformation, Genetic , Plant Somatic Embryogenesis TechniquesABSTRACT
O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do pré-cultivo de explantes foliares e do meio de cultura na ressuspensão de Agrobacterium tumefaciens para infecção dos explantes. Os meios MS/2 (50% da concentração de sais) e MS N/2 (50% da concentração de NH4NO3 e KNO3) + PGR (1,0µM de TDZ (thidiazuron) + 0,1 µM de ANA (ácido naftalenoacético)) foram testados na ressuspensão da bactéria para infecção dos explantes. O pré-cultivo consistiu da manutenção dos explantes em meio de cultura para formação de calos (MS N/2 + PGR) durante um dia, sendo o tratamento sem pré-cultivo consistituído dos explantes após a excissão dos mesmos. Os explantes foram mantidos no escuro a 25 ± 2ºC mediante a utilização de plástico preto. O delineamento usado foi o inteiramente casualisado com 20 explantes. Os experimentos foram repetidos duas vezes. O meio MS/2 promoveu resultados superiores (22,4%) comparado ao meio MS N/2 + PGR (14,5%) para a percentagem de área com expressão do gene uidA. Aos 7 dias de cultivo em meio seletivo, a percentagem de área expressando o gene uidA foi 1,6 no MS/2 e 0% para o MS N/2 + PGR. O pré-cultivo produziu resultados superiores aos encontrados sem pré-cultivo, atingindo 31,4% de expressão transiente e no tratamento sem pré-cultivo 2,1%. Após 7 dias de cultivo em meio seletivo, a percentagem de área de expressão dos explantes do tratamento com pré-cultivo permaneceu 4,8% e 0% para o tratamento sem pré-cultivo. Os resultados indicam que o précultivo e ressuspensão da bactéria em meio MS/2 aumentaram a eficiência da expressão transiente do gene uidA em explantes foliares de E. saligna.
The aim of this research was to evaluate the effect of the pre-culture of leaf explants and the effect of the culture medium for the Agrobacterium tumefaciens resuspension to the explant infection. The media, MS/2 (half strength) and MS N/2 (10.3 mM NH4NO3 and 9.4 mM KNO3) + PGR (1.0 µM TDZ (thidiazuron) and 0.1 µM NAA (1-Naphthaleneacetic acid)) were tested for the bacteria resuspension. The pre-culture consisted of the maintenance of the explants on culture medium for callus formation (MS N/2+PGR) during one day and the treatment without pre-culture consisted of the use of the explants after the excision of the same ones. At the end of the co-culture, the MS/2 promoted results superiors to the MS N/2+PGR, and the area percentage that presented expression of the gene uidA was of 22.4% compared at 14.5%. To the 7 days of culture on a medium with kanamycin, the area percentage expressing the gene uidA was 1.6 in MS/2 and 0% for the MS N/2+PGR. At the end of the co-culture, the pre-culture produced results superiors to the found in the treatment without pre-culture, reaching 31.4% of expression and in the treatment without pre-culture 2.1%. After 7 days of culture on a medium with kanamycin, the area percentage of explant expression of the treatment with pre-culture stayed 4.8% and 0% for the treatment without pre-culture. The results indicate that the pre-culture and the bacteria resuspension in MS/2 increase the efficiency of the transient expression of the gene uidA in leaf explants of E. saligna.
Subject(s)
Transformation, Genetic , Agrobacterium tumefaciens , Eucalyptus , Genes , GlucuronidaseABSTRACT
As espécies florestais possuem grande importância econômica, pois oferecem diversos produtos fundamentais para a sociedade. Técnicas de melhoramento podem aumentar a produtividade das florestas plantadas, oferecer características desejadas à indústria e reduzir impactos ambientais. No entanto, a baixa variabilidade existente em espécies florestais de crescimento rápido, o longo período para os ciclos reprodutivos e as dificuldades encontradas para a realização de cruzamentos controlados podem inviabilizar tais procedimentos. O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão sobre a contribuição do Melhoramento Genético em espécies perenes, relatando técnicas convencionais e dando especial ênfase à biotecnologia. A cultura de tecidos, a utilização de marcadores moleculares e a transformação genética oferecem soluções únicas para o melhoramento florestal. As principais características que vêm sendo melhoradas estão ligadas à produção de biomassa, alteração na composição de lignina, resistência a pragas, tolerância a herbicidas, macho-esterilidade e fitorremediação. Contribuições significativas para a indústria e o ambiente têm sido alcançadas por meio dessas técnicas.
Forest species have great economic importance due to the wide range of important products offered to society. Techniques improvement can increase the productivity of planted forests, providing the desired characteristics to industry, as well as, reducing environmental impacts. However, the low variability existing in fast-growing species, the long reproductive cycles period and the difficulties encountered when conducting controlled crossings may prevent such procedures. The aim of this research was to carry out a review on the contribution of genetic improvement in perennial species. Conventional techniques with special emphasis on biotechnology were reported. The tissue culture, the use of molecular markers and genetic transformation offer unique solutions to forestry improvement. The major features that have been improved are linked to production of biomass, changes in the composition of lignin, resistance to pests, tolerance to herbicides, male-sterility and phytoremediation. Significant contributions to industry and environment have been achieved through these techniques.
ABSTRACT
Forest species have great economic importance due to the wide range of important products offered to society. Techniques improvement can increase the productivity of planted forests, providing the desired characteristics to industry, as well as, reducing environmental impacts. However, the low variability existing in fast-growing species, the long reproductive cycles period and the difficulties encountered when conducting controlled crossings may prevent such procedures. The aim of this research was to carry out a review on the contribution of genetic improvement in perennial species. Conventional techniques with special emphasis on biotechnology were reported. The tissue culture, the use of molecular markers and genetic transformation offer unique solutions to forestry improvement. The major features that have been improved are linked to production of biomass, changes in the composition of lignin, resistance to pests, tolerance to herbicides, male-sterility and phytoremediation. Significant contributions to industry and environment have been achieved through these techniques.
As espécies florestais possuem grande importância econômica, pois oferecem diversos produtos fundamentais para a sociedade. Técnicas de melhoramento podem aumentar a produtividade das florestas plantadas, oferecer características desejadas à indústria e reduzir impactos ambientais. No entanto, a baixa variabilidade existente em espécies florestais de crescimento rápido, o longo período para os ciclos reprodutivos e as dificuldades encontradas para a realização de cruzamentos controlados podem inviabilizar tais procedimentos. O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão sobre a contribuição do Melhoramento Genético em espécies perenes, relatando técnicas convencionais e dando especial ênfase à biotecnologia. A cultura de tecidos, a utilização de marcadores moleculares e a transformação genética oferecem soluções únicas para o melhoramento florestal. As principais características que vêm sendo melhoradas estão ligadas à produção de biomassa, alteração na composição de lignina, resistência a pragas, tolerância a herbicidas, macho-esterilidade e fitorremediação. Contribuições significativas para a indústria e o ambiente têm sido alcançadas por meio dessas técnicas.
ABSTRACT
Forest species have great economic importance due to the wide range of important products offered to society. Techniques improvement can increase the productivity of planted forests, providing the desired characteristics to industry, as well as, reducing environmental impacts. However, the low variability existing in fast-growing species, the long reproductive cycles period and the difficulties encountered when conducting controlled crossings may prevent such procedures. The aim of this research was to carry out a review on the contribution of genetic improvement in perennial species. Conventional techniques with special emphasis on biotechnology were reported. The tissue culture, the use of molecular markers and genetic transformation offer unique solutions to forestry improvement. The major features that have been improved are linked to production of biomass, changes in the composition of lignin, resistance to pests, tolerance to herbicides, male-sterility and phytoremediation. Significant contributions to industry and environment have been achieved through these techniques.
As espécies florestais possuem grande importância econômica, pois oferecem diversos produtos fundamentais para a sociedade. Técnicas de melhoramento podem aumentar a produtividade das florestas plantadas, oferecer características desejadas à indústria e reduzir impactos ambientais. No entanto, a baixa variabilidade existente em espécies florestais de crescimento rápido, o longo período para os ciclos reprodutivos e as dificuldades encontradas para a realização de cruzamentos controlados podem inviabilizar tais procedimentos. O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão sobre a contribuição do Melhoramento Genético em espécies perenes, relatando técnicas convencionais e dando especial ênfase à biotecnologia. A cultura de tecidos, a utilização de marcadores moleculares e a transformação genética oferecem soluções únicas para o melhoramento florestal. As principais características que vêm sendo melhoradas estão ligadas à produção de biomassa, alteração na composição de lignina, resistência a pragas, tolerância a herbicidas, macho-esterilidade e fitorremediação. Contribuições significativas para a indústria e o ambiente têm sido alcançadas por meio dessas técnicas.
ABSTRACT
RNA interference, transcriptional gene silencing, virus induced gene silencing, and micro RNAs comprise a series of mechanisms capable of suppressing gene expression in plants. These mechanisms reveal similar biochemical pathways and appear to be related in several levels. The ability to manipulate gene silencing has produced transgenic plants able to switch off endogenous genes and invading nucleic acids. This powerful biotechnological tool has provided plant breeders and researchers with great opportunity to accelerate breeding programs and developmental studies in woody plants. This research work reports on gene silencing in woody plants, and discuss applications and future perspectives.
RNA de interferência, silenciamento gênico transcricional, silenciamento gênico induzido por vírus e micro RNAs compõem uma série de mecanismos capazes de suprimir a expressão gênica em plantas. Estes mecanismos revelaram rotas metabólicas parecidas e interagem em vários níveis. A capacidade de manipular técnicas de silenciamento gênico tem produzido plantas transgênicas capazes de suprimir a expressão de genes endógenos e ácidos nucléicos invasores. Esta poderosa ferramenta biotecnológica tem ofertado a possibilidade de acelerar programas de melhoramento e pesquisas em desenvolvimento de plantas lenhosas. Este trabalho visa revisar pesquisas de silenciamento gênico em plantas lenhosas e discutir aplicações e rumos futuros.
ABSTRACT
RNA interference, transcriptional gene silencing, virus induced gene silencing, and micro RNAs comprise a series of mechanisms capable of suppressing gene expression in plants. These mechanisms reveal similar biochemical pathways and appear to be related in several levels. The ability to manipulate gene silencing has produced transgenic plants able to switch off endogenous genes and invading nucleic acids. This powerful biotechnological tool has provided plant breeders and researchers with great opportunity to accelerate breeding programs and developmental studies in woody plants. This research work reports on gene silencing in woody plants, and discuss applications and future perspectives.
RNA de interferência, silenciamento gênico transcricional, silenciamento gênico induzido por vírus e micro RNAs compõem uma série de mecanismos capazes de suprimir a expressão gênica em plantas. Estes mecanismos revelaram rotas metabólicas parecidas e interagem em vários níveis. A capacidade de manipular técnicas de silenciamento gênico tem produzido plantas transgênicas capazes de suprimir a expressão de genes endógenos e ácidos nucléicos invasores. Esta poderosa ferramenta biotecnológica tem ofertado a possibilidade de acelerar programas de melhoramento e pesquisas em desenvolvimento de plantas lenhosas. Este trabalho visa revisar pesquisas de silenciamento gênico em plantas lenhosas e discutir aplicações e rumos futuros.
ABSTRACT
Genetic transformation allows the release of improved cultivars with desirable characteristics in a shorter period of time and therefore may be useful in citrus breeding programs. The objective of this research was to establish a protocol for genetic transformation of Valencia and Natal sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck). Epicotyl segments of germinated in vitro plantlets (three weeks in darkness and two weeks in a 16-h photoperiod) were used as explants. These were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA-105 and different experiments were done to evaluate the transformation efficiency: explants were co-cultivated with Agrobacterium for one, three or five days; explants were incubated with Agrobacterium suspension for 5, 10, 20 or 40 minutes; co-cultivation medium was supplemented with acetosyringone at 0, 100 or 200 µmol L-1; Explants ends had a longitudinal terminal incision (2-3 mm); co-cultivation temperatures of 19, 23 or 27°C were imposed. The experimental design was completely randomized in all experiments with five replications, each consisted of a Petri dish (100 x 15 mm) with 30 explants and resulted in a total of 150 explants per treatment. Longitudinal terminal incision in the explant ends did not improve shoot regeneration. However, transgenic plants of all three cultivars were confirmed from explants that had been subjected to inoculation time of 20 minutes, co-culture of three days at 23-27°C, in the absence of acetosyringone.
A transformação genética permite produzir cultivares com características específicas e pode, dessa forma ser associada a programas de melhoramento de citros. O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos de transformação genética para as laranjas doce 'Valência' e 'Natal' (Citrus sinensis L. Osbeck), bem como para o limão 'Cravo'(Citrus limonia L. Osbeck). Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro (três semanas no escuro e duas semanas sob fotoperíodo de 16h) foram utilizados como explantes. Estes foram co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105), realizando-se vários experimentos para avaliar a eficiência do processo de transformação genética: explantes co-cultivados por um, três e cinco dias; tempo de inoculação com a bactéria de 5, 10, 20 e 40 minutos; co-cultivo em meio de cultura contendo 0, 100 e 200 mimol L-1 de acetoseringona; Incisão longitudinal (2-3 mm) nas extremidades do explante; temperatura de co-cultivo 19, 23 e 27°C. Todos os experimentos consistiram de cinco repetições por tratamento, sendo cada repetição representada por uma placa de Petri contendo 30 explantes, perfazendo um total de 150 explantes por tratamento. Plântulas transgênicas dos três cultivares foram obtidas utilizando-se tempo de inoculação de 20 minutos, co-cultivo com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105) por três dias, na ausência de acetoseringona no meio de cultura de co-cultivo e temperatura de co-cultivo de 23-27°C. A incisão longitudinal na extremidade do explante favoreceu à organogênese in vitro, mas quando co-cultivado com Agrobacterium não houve regeneração de brotações.
ABSTRACT
Genetic transformation allows the release of improved cultivars with desirable characteristics in a shorter period of time and therefore may be useful in citrus breeding programs. The objective of this research was to establish a protocol for genetic transformation of Valencia and Natal sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck). Epicotyl segments of germinated in vitro plantlets (three weeks in darkness and two weeks in a 16-h photoperiod) were used as explants. These were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens strain EHA-105 and different experiments were done to evaluate the transformation efficiency: explants were co-cultivated with Agrobacterium for one, three or five days; explants were incubated with Agrobacterium suspension for 5, 10, 20 or 40 minutes; co-cultivation medium was supplemented with acetosyringone at 0, 100 or 200 µmol L-1; Explants ends had a longitudinal terminal incision (2-3 mm); co-cultivation temperatures of 19, 23 or 27°C were imposed. The experimental design was completely randomized in all experiments with five replications, each consisted of a Petri dish (100 x 15 mm) with 30 explants and resulted in a total of 150 explants per treatment. Longitudinal terminal incision in the explant ends did not improve shoot regeneration. However, transgenic plants of all three cultivars were confirmed from explants that had been subjected to inoculation time of 20 minutes, co-culture of three days at 23-27°C, in the absence of acetosyringone.
A transformação genética permite produzir cultivares com características específicas e pode, dessa forma ser associada a programas de melhoramento de citros. O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos de transformação genética para as laranjas doce 'Valência' e 'Natal' (Citrus sinensis L. Osbeck), bem como para o limão 'Cravo'(Citrus limonia L. Osbeck). Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro (três semanas no escuro e duas semanas sob fotoperíodo de 16h) foram utilizados como explantes. Estes foram co-cultivados com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105), realizando-se vários experimentos para avaliar a eficiência do processo de transformação genética: explantes co-cultivados por um, três e cinco dias; tempo de inoculação com a bactéria de 5, 10, 20 e 40 minutos; co-cultivo em meio de cultura contendo 0, 100 e 200 mimol L-1 de acetoseringona; Incisão longitudinal (2-3 mm) nas extremidades do explante; temperatura de co-cultivo 19, 23 e 27°C. Todos os experimentos consistiram de cinco repetições por tratamento, sendo cada repetição representada por uma placa de Petri contendo 30 explantes, perfazendo um total de 150 explantes por tratamento. Plântulas transgênicas dos três cultivares foram obtidas utilizando-se tempo de inoculação de 20 minutos, co-cultivo com Agrobacterium tumefaciens (EHA-105) por três dias, na ausência de acetoseringona no meio de cultura de co-cultivo e temperatura de co-cultivo de 23-27°C. A incisão longitudinal na extremidade do explante favoreceu à organogênese in vitro, mas quando co-cultivado com Agrobacterium não houve regeneração de brotações.
ABSTRACT
Exogenous genes can be introduced in plants by genetic transformation techniques. However, an efficient tissue culture system with high rates of plant recovery is necessary for gene introduction. This work aimed to define organogenesis and plant regeneration protocols for sweet orange varieties Natal, Valencia and Hamlin (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck) which can be used in plant transformation experiments. Seeds of which teguments were removed, were germinated in vitro and maintained in the dark for three weeks, followed by one week at 16-h photoperiod (40 µmol m-2 s-1) and 27 ± 2°C. Organogenesis induction was done by introducing epicotyl segments in MT medium with 25 g L-1 sucrose and different BAP concentrations. After adventitious bud growth, the shoots were transferred to MT medium with either NAA or IBA (1 mg L-1), or absence of auxin, for rooting. The best results were obtained with 1 mg L-1 BAP for bud induction and 1 mg L-1 IBA for rooting for all three sweet orange cultivars. The use of 0.5-2.5 mg L-1 BAP, followed by 1 mg L-1 IBA were the best growth regulator combinations for bud induction and rooting, respectively, for 'Rangpur' lime. The protocols presented in this work are suitable for associations with genetic transformation experiments for these cultivars.
Com o desenvolvimento de novas técnicas biotecnológicas, é possível a introdução no genoma vegetal de genes de outras plantas ou outros organismos pela transformação genética. Entretanto, um dos principais requisitos para o sucesso desta técnica é a existência de uma metodologia eficiente de regeneração de plantas in vitro. O objetivo deste trabalho foi definir protocolos de regeneração de plantas, via organogênese, para laranjas 'Natal', 'Valência' e 'Hamlin' (Citrus sinensis L. Osbeck), e limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck), para obtenção de plantas transgênicas nestas variedades. Sementes sem tegumentos foram germinadas in vitro durante três semanas no escuro e uma semana sob fotoperíodo de 16 h (40 µmol m-2 s-1), a 27 ± 2°C. Para indução das brotações, segmentos de epicótilo foram cultivados no meio de cultura MT (25 g L-1 de sacarose) suplementado com diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP). Para enraizamento, utilizou-se meio MT, com ou sem a adição de NAA ou IBA (1,0 mg L-1). A combinação 1,0 mg L-1 BAP, utilizada na fase de indução de brotações e 1,0 mg L-1 IBA, utilizada na fase de enraizamento, permitiu regeneração de plantas com bom índice de enraizamento nas três variedades de laranjas. A utilização de 0,5-2,5 mg L-1 BAP na fase de indução de brotações, com 1,0 mg L-1 IBA na fase de enraizamento, assegurou regeneração de plantas com alto índice de enraizamento para o limão 'Cravo'. Os protocolos de organogênese desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados em experimentos de transformação genética envolvendo essas variedades.
ABSTRACT
Exogenous genes can be introduced in plants by genetic transformation techniques. However, an efficient tissue culture system with high rates of plant recovery is necessary for gene introduction. This work aimed to define organogenesis and plant regeneration protocols for sweet orange varieties Natal, Valencia and Hamlin (Citrus sinensis L. Osbeck) and Rangpur lime (Citrus limonia L. Osbeck) which can be used in plant transformation experiments. Seeds of which teguments were removed, were germinated in vitro and maintained in the dark for three weeks, followed by one week at 16-h photoperiod (40 µmol m-2 s-1) and 27 ± 2°C. Organogenesis induction was done by introducing epicotyl segments in MT medium with 25 g L-1 sucrose and different BAP concentrations. After adventitious bud growth, the shoots were transferred to MT medium with either NAA or IBA (1 mg L-1), or absence of auxin, for rooting. The best results were obtained with 1 mg L-1 BAP for bud induction and 1 mg L-1 IBA for rooting for all three sweet orange cultivars. The use of 0.5-2.5 mg L-1 BAP, followed by 1 mg L-1 IBA were the best growth regulator combinations for bud induction and rooting, respectively, for 'Rangpur' lime. The protocols presented in this work are suitable for associations with genetic transformation experiments for these cultivars.
Com o desenvolvimento de novas técnicas biotecnológicas, é possível a introdução no genoma vegetal de genes de outras plantas ou outros organismos pela transformação genética. Entretanto, um dos principais requisitos para o sucesso desta técnica é a existência de uma metodologia eficiente de regeneração de plantas in vitro. O objetivo deste trabalho foi definir protocolos de regeneração de plantas, via organogênese, para laranjas 'Natal', 'Valência' e 'Hamlin' (Citrus sinensis L. Osbeck), e limão 'Cravo' (Citrus limonia L. Osbeck), para obtenção de plantas transgênicas nestas variedades. Sementes sem tegumentos foram germinadas in vitro durante três semanas no escuro e uma semana sob fotoperíodo de 16 h (40 µmol m-2 s-1), a 27 ± 2°C. Para indução das brotações, segmentos de epicótilo foram cultivados no meio de cultura MT (25 g L-1 de sacarose) suplementado com diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP). Para enraizamento, utilizou-se meio MT, com ou sem a adição de NAA ou IBA (1,0 mg L-1). A combinação 1,0 mg L-1 BAP, utilizada na fase de indução de brotações e 1,0 mg L-1 IBA, utilizada na fase de enraizamento, permitiu regeneração de plantas com bom índice de enraizamento nas três variedades de laranjas. A utilização de 0,5-2,5 mg L-1 BAP na fase de indução de brotações, com 1,0 mg L-1 IBA na fase de enraizamento, assegurou regeneração de plantas com alto índice de enraizamento para o limão 'Cravo'. Os protocolos de organogênese desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados em experimentos de transformação genética envolvendo essas variedades.
ABSTRACT
Morphological and proteic modifications in Nicotiana tabacum L. transformed by Agrobacterium rhizogenes were evaluated by the comparison of normal and transformant plants regenerated from hairy-roots formed by the strains A4 or IB-642 of A. rhizogenes. Changes in apical dominance were observed in IB-642 transformants, which exhibited an abnormal development of axiliary buds. The electrophoretic analysis indicated an increase in peroxidase activity and the induction of several isozymes of this complex in the transformants. The SDS-PAGE patterns comparison allows to identify several changes, specially, the increase in 31-33 and 54 kD polypeptides in the transformants.. Biochemical analysis suggests the induction of a pathogen or stress like response of the transformants due to the high auxin concentration codified by A. rhizogenes T-DNA incorporated to the plant genome.
Modificações morfológicas e proteicas em transformantes de Nicotiana tabacum L. com Agrobacterium rhizogenes foram avaliadas através da comparação de plantas normais e transformantes regeneradas a partir de raízes pilosas formadas pelas linhagens A4 ou IB-642. Mudanças na dominância apical foram observadas em transformantes com IB-642, os quais exibiram um desenvolvimento anormal dos brotos axilares. As análises eletroforéticas mostraram um aumento na atividade de peroxidase e indução de várias isoenzimas deste complexo nos transformantes. A comparação dos perfis de SDS-PAGE permitiu identificar várias modificações, especialmente, o aumento dos polipeptídios de 31-33 e de 54 kD nos transformantes. As análises bioquímicas sugerem a indução de uma resposta do tipo patógeno ou estresse devida a alta concentração de auxina codificada pelo T-DNA de A. rhizogenes incorporado ao genoma.
ABSTRACT
Morphological and proteic modifications in Nicotiana tabacum L. transformed by Agrobacterium rhizogenes were evaluated by the comparison of normal and transformant plants regenerated from hairy-roots formed by the strains A4 or IB-642 of A. rhizogenes. Changes in apical dominance were observed in IB-642 transformants, which exhibited an abnormal development of axiliary buds. The electrophoretic analysis indicated an increase in peroxidase activity and the induction of several isozymes of this complex in the transformants. The SDS-PAGE patterns comparison allows to identify several changes, specially, the increase in 31-33 and 54 kD polypeptides in the transformants.. Biochemical analysis suggests the induction of a pathogen or stress like response of the transformants due to the high auxin concentration codified by A. rhizogenes T-DNA incorporated to the plant genome.
Modificações morfológicas e proteicas em transformantes de Nicotiana tabacum L. com Agrobacterium rhizogenes foram avaliadas através da comparação de plantas normais e transformantes regeneradas a partir de raízes pilosas formadas pelas linhagens A4 ou IB-642. Mudanças na dominância apical foram observadas em transformantes com IB-642, os quais exibiram um desenvolvimento anormal dos brotos axilares. As análises eletroforéticas mostraram um aumento na atividade de peroxidase e indução de várias isoenzimas deste complexo nos transformantes. A comparação dos perfis de SDS-PAGE permitiu identificar várias modificações, especialmente, o aumento dos polipeptídios de 31-33 e de 54 kD nos transformantes. As análises bioquímicas sugerem a indução de uma resposta do tipo patógeno ou estresse devida a alta concentração de auxina codificada pelo T-DNA de A. rhizogenes incorporado ao genoma.
ABSTRACT
Morphological and proteic modifications in Nicotiana tabacum L. transformed by Agrobacterium rhizogenes were evaluated by the comparison of normal and transformant plants regenerated from hairy-roots formed by the strains A4 or IB-642 of A. rhizogenes. Changes in apical dominance were observed in IB-642 transformants, which exhibited an abnormal development of axiliary buds. The electrophoretic analysis indicated an increase in peroxidase activity and the induction of several isozymes of this complex in the transformants. The SDS-PAGE patterns comparison allows to identify several changes, specially, the increase in 31-33 and 54 kD polypeptides in the transformants.. Biochemical analysis suggests the induction of a pathogen or stress like response of the transformants due to the high auxin concentration codified by A. rhizogenes T-DNA incorporated to the plant genome.
Modificações morfológicas e proteicas em transformantes de Nicotiana tabacum L. com Agrobacterium rhizogenes foram avaliadas através da comparação de plantas normais e transformantes regeneradas a partir de raízes pilosas formadas pelas linhagens A4 ou IB-642. Mudanças na dominância apical foram observadas em transformantes com IB-642, os quais exibiram um desenvolvimento anormal dos brotos axilares. As análises eletroforéticas mostraram um aumento na atividade de peroxidase e indução de várias isoenzimas deste complexo nos transformantes. A comparação dos perfis de SDS-PAGE permitiu identificar várias modificações, especialmente, o aumento dos polipeptídios de 31-33 e de 54 kD nos transformantes. As análises bioquímicas sugerem a indução de uma resposta do tipo patógeno ou estresse devida a alta concentração de auxina codificada pelo T-DNA de A. rhizogenes incorporado ao genoma.