Desenvolvimento de formulações probióticas de isolados clínicos de Lactobacillus spp. para controle de Candida albicans / Development of probiotic formulations of clinical isolates of Lactobacillus spp. for the control of Candida albicans

O uso de probióticos tem sido considerado uma alternativa para o controle das candidoses bucais, como a estomatite protética. Recentemente, nosso grupo de pesquisa isolou cepas clínicas bucais de Lactobacillus rhamnosus (5.2) e Lactobacillus fermentum (20.4) com atividade antifúngica contra Candida albicans. Entretanto, é necessário o desenvolvimento de formulações para uso clínico dessas cepas probióticas na cavidade bucal. Assim, o objetivo desse projeto foi desenvolver formulações probióticas em hidrogel gellan gum com atividade antifúngica que possam ser usadas no controle da estomatite protética. Para o preparo das formulações probióticas, as cepas L. rhamnosus 5.2 ou L. fermentum 20.4 foram incorporadas em formulações com diferentes concentrações de gellan gum (0,6 a 1%). A viabilidade das células de Lactobacillus nas formulações e o sistema de liberação foram testados em diferentes condições de armazenamento, incluindo tempo e temperaturas de estocagem. A seguir, os efeitos das formulações probióticas foram avaliados sobre C. albicans pelo método de difusão em ágar e sobre biofilmes microcosmos por contagem de células viáveis e análise de microscopia eletrônica de varredura. Os resultados demonstraram que todas as concentrações do gellan foram capazes de manter a viabilidade das células de L. rhamnosus e L. fermentum em torno de 5 a 7 log, durante 14 semanas, independentemente da temperatura de armazenamento (4°C ou temperatura ambiente). No teste de difusão em ágar, verificou-se que as formulações probióticas levaram à inibição de cepas padrão e clínicas de C. albicans, demonstrando que as cepas de Lactobacillus incorporadas no gellan mantiveram sua atividade antifúngica. As formulações probióticas também conseguiram inibir os biofilmes microcosmos provenientes de pacientes com estomatite protética, reduzindo o número de células viáveis de Candida e desestruturando a arquitetura dos biofilmes. Concluiu-se que o gellan gum mostrou ser um biomaterial promissor como carreador das cepas probióticas de L. rhamnosus 5.2 e L. fermentum 20.4. Além disso, as formulações probióticas desenvolvidas apresentaram ação antifúngica sobre células de C. albicans e biofilmes de estomatite protética, podendo desta forma atuar na prevenção da candidose bucal. (AU)

The use of probiotics has been considered an alternative for the control of oral candidiasis such as denture stomatitis. Recently, our research group isolated oral clinical strains of Lactobacillus rhamnosus (5.2) and Lactobacillus fermentum (20.4) with antifungal activity against Candida albicans. However, it is necessary to develop formulations for clinical use of these probiotic strains in the oral cavity. Thus, the purpose of this project was to develop probiotic formulations in gellan gum hydrogel with antifungal activity that could be used in the control of denture stomatitis. For the preparation of probiotic formulations, the strains L. rhamnosus 5.2 or L. fermentum 20.4 were incorporated into formulations with different concentrations of gellan gum (0.6 to 1%). The viability of Lactobacillus cells in the formulations and the delivery system were tested under different storage conditions, including storage time and temperatures. Next, the effects of the probiotic formulations were evaluated on C. albicans by the agar diffusion method and on microcosm biofilms by viable cell count and scanning electron microscopy analysis. The results showed that all concentrations of gellan were able to maintain the viability of L. rhamnosus and L. fermentum cells around 5 to 7 log for 14 weeks, regardless of storage temperature (4°C or room temperature). In the agar diffusion test, it was found that the probiotic formulations led to the inhibition of standard and clinical strains of C. albicans, demonstrating that the Lactobacillus strains incorporated into gellan maintained their antifungal activity. Probiotic formulations were also able to inhibit microcosm biofilms from patients with denture stomatitis, reducing the number of viable Candida cells and disrupting the architecture of biofilms. As a conclusion, the gellan gum proved to be a promising biomaterial as a carrier of the probiotic strains of L. rhamnosus 5.2 and L. fermentum 20.4. In addition, the probiotic formulations developed showed antifungal action on C. albicans cells and denture stomatitis biofilms, thus being able to act in the prevention of oral candidiasis. (AU)

Effect of Myracrodruon urundeuva and Qualea grandiflora extracts on viability and activity of microcosm biofilm and prevention of enamel demineralization in vitro / Efeito de extratos de Myracrodruon urundeuva All. e Qualea grandiflora Mart. sobre a viabilidade e atividade de biofilme microcosmo e na prevenção da desmineralização do esmalte in vitro

The objective of this study was to evaluate the antimicrobial and anti-caries effects of two plant extracts. The first chapter dealt with a review of the literature whose objective was to discuss the antimicrobial potential of Brazilian natural agents on the biofilm related to dental caries and gingivitis/periodontal disease. The research of the articles was carried out using PubMed. We found a total of 23 papers. Most of the studies were performed using planktonic microorganisms or under clinical trials. Nineteen articles were focused on cariogenic bacteria. From these nineteen articles, eleven were also about periodontopathogenic bacteria. Four studies addressed only periodontopathogenic bacteria. The most tested Brazilian natural agents were green propolis, essential oils of Lippia sidoides and Copaifera sp. Most of the tested agents showed similar results when compared to positive control (essential oils and extracts) or better effect than negative control (green propolis). More studies involving protocols closer to the clinical condition and the use of response variables that allows understanding the mechanism of action of natural agents are necessary before the incorporation of these natural agents into dental products. The second chapter aimed to test the effect of the hydroalcoholic extracts of Myracrodruon urundeuva All. and Qualea grandiflora Mart. leaves on the viability of the microcosm biofilm and on the prevention of enamel demineralization. The microcosm biofilm was produced on bovine enamel, using human saliva pool mixed with McBain saliva (0.2% sucrose) for 14 days. The biofilm was treated daily with the extracts for 1 min. M. urundeuva at 100, 10 and 0.1 µg/ml and Q. grandiflora at 100 and 0.1 µg/ml reduced cell viability similarly to the positive control and significantly more than negative control. M. urundeuva at 1000, 100 and 0.1 µg/ml were able to reduce the counting formation unit-CFU counting of lactobacilli sp. and Streptococcus mutans, while Q. grandiflora at 1000 and 1.0 µg/ml significantly reduced the S. mutans CFU counting. On the other hand, the natural extracts did not reduce the production of extracellular polyssacharides, lactic acid and the development of enamel caries lesions. The third chapter aimed to evaluate the effect of hydroalcoholic extracts of M. urundeuva and Q. grandiflora (alone or combined) on the viability of S. mutans biofilm and the prevention of enamel demineralization. S. mutans strain (ATCC 21175) was reactivated in BHI broth. Minimum inhibitory concentration, minimum bactericidal concentration, minimum biofilm inhibitory concentration and minimum biofilm eradication concentration were determined to choose the concentrations to be tested under the biofilm model. S. mutans biofilm (5x105 CFU/ml) was produced on bovine enamel using McBain saliva with 0.2% sucrose for 3 days. The biofilm was treated daily with the extracts for 1 min. M. urundeuva (isolated or combined) at concentrations equal or higher than 0.625 mg/ml was able to reduce the bacteria viability, whereas Q. grandiflora extract alone showed antimicrobial effect at 5 mg/ml only (p<0.05). On the other hand, none of the extracts was able to reduce the development of enamel caries lesions. Despite the tested natural extracts have antimicrobial effect; they are unable to prevent caries in enamel.(AU)

O objetivo foi avaliar os efeitos antimicrobiano e anti-cárie de dois extratos de plantas. O primeiro capítulo se referiu a uma revisão da literatura cujo objetivo foi discutir o potencial antimicrobiano dos agentes naturais brasileiros sobre o biofilme relacionado à cárie dentária e à gengivite/doença periodontal. A pesquisa dos artigos foi realizada usando o PubMed. Foram encontrados 23 trabalhos. A maioria dos estudos foi realizada utilizando microorganismos na fase planctônica ou ensaios clínicos. Dezenove artigos foram focados em bactérias cariogênicas. Dos dezenove artigos, onze também eram sobre bactérias periodontopatogênicas. Quatro estudos abordaram apenas bactérias periodontopatogênicas. Os agentes naturais brasileiros mais testados foram própolis verde, óleos essenciais de Lippia sidoides e Copaifera sp. Os agentes testados apresentaram resultados similares quando comparados ao controle positivo (óleos essenciais e extratos) ou melhor efeito que o controle negativo (própolis verde). Mais estudos próximos da condição clínica e o uso de variáveis de resposta que permitam entender o mecanismo de ação são necessários, para permitir a incorporação desses agentes naturais em produtos odontológicos. O segundo capítulo teve como objetivo testar o efeito dos extratos hidroalcoólicos de Myracrodruon urundeuva All. e Qualea grandiflora Mart. sobre a viabilidade do biofilme microcosmo e na prevenção da desmineralização do esmalte. O biofilme microcosmo foi produzido em esmalte bovino, utilizando pool de saliva humana misturada à saliva de McBain (0,2% de sacarose) durante 14 dias. O biofilme foi tratado diariamente com os extratos durante 1 min. M. urundeuva a 100, 10 e 0,1 µg/ml e Q. grandiflora a 100 e 0,1 µg/ml reduziram a viabilidade dos microrganismos de forma semelhante ao controle positivo e significativamente maior do que o controle negativo. M. urundeuva a 1000, 100 e 0,1 µg/ml foi capaz de reduzir a contagem de Unidade formadora de colônia-UFC para Lactobacilos totais e Streptococcus mutans, enquanto a Q. grandiflora a 1000 e 1,0 µg/ml reduziu significativamente a contagem de UFC para S. mutans. Os extratos naturais não conseguiram reduzir a produção de polissacarídeos extracelulares-PEC, ácido lático e o desenvolvimento da lesão cariosa em esmalte. O terceiro capítulo teve como objetivo avaliar o efeito dos extratos hidroalcoólicos de M. urundeuva. e Q. grandiflora (sozinhos ou combinados) sobre a viabilidade do biofilme de S. mutans e na prevenção da desmineralização do esmalte. Cepa de S. mutans (ATCC 21175) foi reativada em caldo BHI. Concentração inibitória mínima, concentração bactericida mínima, concentração inibitória mínima de biofilme e concentração de erradicação mínima de biofilme foram determinadas para escolher as concentrações a serem testadas sob o modelo de biofilme. O biofilme de S. mutans (5x105 CFU/ml) foi produzido em esmalte bovino, utilizando saliva de McBain com 0,2% de sacarose durante 3 dias. O biofilme foi tratado diariamente com os extratos durante 1 min. M. urundeuva (isolada ou combinada) nas concentrações iguais ou superiores a 0,625 mg/ml foi capaz de reduzir a viabilidade das bactérias, enquanto que o extrato da Q. grandflora apresentou efeito antimicrobiano somente a 5 mg/ml (p<0,05). Nenhum dos extratos reduziu o desenvolvimento da lesão da cárie. Apesar dos extratos naturais terem efeito antimicrobiano, são incapazes de prevenir o desenvolvimento da lesão cariosa em esmalte.(AU)

Evaluation of the effect of different commercial mouthrinses on the viability and activity of microcosm biofilm and on enamel demineralization / Avaliação do efeito de diferentes enxaguatórios bucais comerciais sobre a viabilidade e atividade de biofilme microcosmo e a desmineralização do esmalte

The aim of this study was to evaluate the antimicrobial and anticaries effects of different commercial mouthrinses. The first chapter is about a review of literature whose the aim was to discuss the antimicrobial potential of different mouthrinses in respect to the control of dental caries and periodontal disease. The search of papers was conducted using PubMed and the keywords: "antimicrobial agent" or "antiplaque agent," "dental biofilm" and "dental caries" or "periodontal disease" or "gingivitis". We found a total of 22 papers (2011-2015). The main active agents tested were: CHXChlorhexidine, CPC-cetylpyridinium chloride and EO-Essential oils (alcohol/or alcohol-free). CHX was compared to EO in 6 studies, showing superiority in 3 studies, similarity in 1 study and inferiority in 2 studies. CPC has shown lower effect in plaque reduction compared to CHX and EO. More clinical studies are needed for better understanding the mechanism of action and the differences in performance among the antiplaque agents. The second chapter has as aim to compare the antimicrobial and anticaries effects of six commercial mouthrinses (PerioGard®, Noplak® Max, Oral-B® Complete, Listerine® Zero, Malvatricin® Plus and Cepacol® Plus Advanced) under a microcosm biofilm model formed on enamel. A microcosm biofilm was produced on bovine enamel, using inoculum from pooled human saliva mixture with McBain saliva (with 0.2% sucrose), for 14 days. The biofilm was treated with the mouthrinses daily (1 min). The bacterial viability (% death), lactic acid production (mmol/l), the colony-forming unit (CFU) counting for total microorganisms, lactobacilli, total streptococci and mutans streptococci (log10 CFU/mL) and the extracellular polysaccharides production (EPS, mg/g) were quantified in the biofilm. The degree of enamel demineralization was analyzed using transverse microradiography-TMR (%min vol. µm). Oral-B® Complete, Listerine® Zero and Malvatricin® Plus had the greatest effect on the reduction of biofilm viability (69-75% dead cells vs. 13% in the control, p<0.0001). On the other hand, the lactic acid production was significantly reduced by PerioGard®, Noplak® Max and Listerine® Zero compared to control (69% reduction, p<0.0001). There were no significant differences among the mouthrinses in respect to the CFU counting and EPS production. The enamel demineralization was significantly reduced by PerioGard®, Noplak® Max and Malvatricin® Plus compared to control (74% reduction, p<0.0001). Therefore, the commercial mouthrinses have different antimicrobial and anticaries effects. The mouthrinses containing chlorexidine or Malva sylvestris (with F, triclosan and xylitol) had the best anticaries effect under this model.(AU)

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos antimicrobiano e anticárie de diferentes enxaguatórios bucais comerciais. O primeiro capítulo se refere a uma revisão da literatura cujo objetivo foi discutir o potencial antimicrobiano de diferentes enxaguatórios em relação ao controle de cárie dentária e doença periodontal. A pesquisa dos artigos foi realizada usando o PubMed e as palavras-chave: "agente antimicrobiano" ou "agente antiplaca", "biofilme dental" e "cárie dentária" ou "doença periodontal" ou "gengivite". Encontramos um total de 22 artigos (2011-2015). Os principais agentes ativos testados foram: Clorexidina-CHX, cloreto de cetilpiridínio- CPC e óleos essenciais OE (álcool / ou sem álcool). A CHX foi comparada ao OE em 6 estudos, mostrando superioridade em 3 estudos, similaridade em 1 estudo e inferioridade em 2 estudos. CPC mostrou menor efeito na redução da placa em comparação com CHX e OE. Mais estudos clínicos são necessários para uma melhor compreensão do mecanismo de ação e as diferenças no desempenho entre os agentes antiplaca. O segundo capítulo teve como objetivo avaliar os efeitos antimicrobiano e anticárie de seis enxaguatórios comerciais (PerioGard®, Noplak® Max, Oral-B® Complete, Listerine® Zero, Malvatricin® Plus e Cepacol® Plus Advanced) sobre um modelo de biofilme de microcosmo formado no esmalte. O biofilme de microcosmo foi produzido em esmalte bovino, utilizando o inóculo da mistura de saliva humana com saliva de McBain (com 0,2% de sacarose), durante 14 dias. O biofilme foi tratado com enxaguatórios diariamente (1 min). A viabilidade bacteriana (% de morte), a produção de ácido láctico (mmol/l), as unidades formadoras de colônias (UFC) foram contadas para microrganismos totais, lactobacilos, estreptococos totais e Streptococcus mutans (log10 UFC/mL) e a produção de polissacarídeos extracelulares (PEC, mg/g) foram quantificados no biofilme. O grau de desmineralização do esmalte foi analisado utilizando a microrradiografia transversal-TMR (%min vol. µm). Oral-B® Complete, Listerine® Zero e Malvatricin® Plus tiveram o maior efeito na redução da viabilidade do biofilme (69-75% de morte celular vs 13% no controle, p<0,0001). Por outro lado, a produção de ácido lático foi significativamente reduzida por PerioGard®, Noplak® Max e Listerine® Zero comparado ao controle (redução de 69%, p<0,0001). Não houve diferenças significativas entre os enxaguatórios em relação à contagem de UFC e à produção de PEC. A desmineralização do esmalte foi significativamente reduzida pelo PerioGard®, Noplak® Max e Malvatricin® Plus em comparação ao controle (redução de 74%, p<0,0001). Portanto, os enxaguatórios bucais comerciais têm diferentes efeitos antimicrobiano e anticárie. Os enxaguatórios contendo clorexidina ou Malva sylvestris (com F, triclosan e xilitol) tiveram o melhor efeito anticárie neste modelo.(AU)