Repetición de la biopsia ante una falla en la amplificación / Repeat biopsy in case of amplification failure

Resumen OBJETIVO: Analizar los posibles factores asociados con las fallas en la amplificación, los desenlaces de la euploidia y clínicos entre los embriones con repetición de la biopsia y los de una sola (grupo control). MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio retrospectivo y multicéntrico de análisis de biopsias de blastocistos practicadas en 22 centros de reproducción asistida (noviembre 2017 a febrero 2022). Se analizaron 4,106 blastocistos procedentes de 1,007 ciclos de ICSI con prueba genética para aneuplidias previa a la implantación. En los blastocistos reportados con falla en la amplificación se analizó el Centro donde se practicó la biopsia, el día en que ésta se tomó, la calidad embrionaria y la incidencia de complicaciones durante el procedimiento. Los resultados se compararon con la prueba genética para aneuploidias previa a la implantación y los desenlaces clínicos entre los embriones con repetición de la biopsia y el grupo control. RESULTADOS: En el 96.0% (3,942) de los embriones se obtuvo resultado y en el 4.0% (n = 164) se reportó falla en la amplificación. La biopsia se repitió en las 99 fallas en la amplificación y se obtuvo resultado en el 83.8% de los casos. Las tasas de euploidia fueron similares entre embriones con repetición de la biopsia y los controles (34.9 en comparación con 39.7%; p > 0.05). El Centro fue el único factor que mostró diferencias en las tasas de falla en la amplificación (p < 0.05). No se observaron diferencias en el día de la biopsia o la calidad embrionaria. Las tasas de embarazo (51.0 en comparación con 58.3%), implantación (63.9 en comparación con 61.5%) y aborto (16.9 en comparación con 28.6%) fueron similares entre embriones con una sola biopsia o repetición de ésta, respectivamente. CONCLUSIONES: El Centro fue el principal factor que influyó en las fallas en la amplificación. Las tasas de euploidia y los desenlaces clínicos no difirieron entre el grupo control y los embriones con repetición de la biopsia; por consiguiente, se recomienda repetir la biopsia en los embriones con falla en la amplificación.

Abstract OBJECTIVE: To analyze possible factors associated with amplification failures, euploidy and clinical outcomes between repeat and single biopsy embryos (control group). MATERIALS AND METHODS: Retrospective multicenter study involving 4,106 blastocysts from 1,007 ICSI cycles with preimplantation genetic testing for aneuploidy performed by next generation sequencing. In case of DNA amplification failure, the IVF center where biopsies were performed, the day of biopsy, the embryo quality and the incidence of complications during biopsy were analyzed. Preimplantation genetic testing for aneuploidy results and clinical outcomes were compared between re-biopsied embryos and the control group. RESULTS: Of the 4,106 blastocysts included in this study, 96.0% (3,942) obtained a result while 4.0% (164) had an amplification failure. Ninety-nine embryos with amplification failure were re-biopsied and 83.8% resulted in an informative diagnosis. Euploidy rates were equivalent between re-biopsied and control blastocysts (34.9% vs 39.7%, P>0.05). The only factor significantly affecting the amplification failure rates was the IVF center. No differences were observed between biopsy days or embryo quality. Pregnancy (51.0% vs 58.3%), implantation (63.9% vs 61.5%) and miscarriage rates (16.9% vs 28.6%) were similar between single and repeat biopsied embryos, respectively. CONCLUSIONS: The centre was the main factor influencing amplification failures. Euploidy rates and clinical outcomes did not differ between the control group and repeat biopsied embryos; therefore, repeat biopsy is recommended for embryos with amplification failure.

Adopción embrionaria: estado de la cuestión ético-jurídica en el Perú

La técnica de reproducción asistida trae consigo un número de embriones sobrantes. Se propone una revisión del estado de la cuestión de estos embriones en el Perú. Se revisa desde las perspectivas biológica, ética y jurídica. Se profundiza en el ordenamiento jurídico peruano, sobre el estado de desprotección de estos embriones y se contrasta con una posible solución: la adopción embrionaria. Se constata el estado de incertidumbre de la situación de estos embriones y se concluye como ilegítima la práctica de la adopción embrionaria, por vulnerar la dignidad y condición de sujeto de derecho del embrión sobrante.

The assisted reproduction technique brings with it several surplus embryos. A review of the situation of these embryos in Peru is proposed from biological, ethical, and legal perspectives. We delve into the Peruvian legal system regarding the lack of protection of these embryos and contrast it with a possible solution: embryonic adoption. The uncertainty of the situation of these embryos is verified, concluding that the practice of embryonic adoption is illegitimate, for it constitutes a violation of the dignity and rights-holder condition of the remaining embryos.

A técnica de reprodução assistida traz consigo uma série de embriões excedentes. Propõe-se uma revisão da situação desses embriões no Peru. É feita uma revisão a partir de perspectivas biológicas, éticas e legais. Aprofunda-se no ordenamento jurídico peruano sobre o estado de desproteção desses embriões e contrasta-se com uma possível solução: a adoção embrionária. Verifica-se o estado de incerteza da situação desses embriões e conclui-se como ilegítima a prática da adoção de embriões, por violar a dignidade e condição de sujeito de direito do embrião remanescente.

Derechos del concebido

La fecundación consiste en la fusión de los gametos masculino y femenino en el tercio externo de la trompa uterina para constituir el cigoto, que inicia su división celular, viaja al útero, se implanta como blastocito en el endometrio a los siete días y comienzan los procesos de embriogénesis y morfogénesis. Concepción es la acción o efecto de quedar embarazada una mujer. En el tema de los derechos establecidos al concebido, el inicio de la vida humana plantea amplia discusión entre las definiciones que plantea la ciencia frente a las de grupos de la sociedad civil. No siendo el cigoto una persona humana, de acuerdo con la Corte Interamericana de Derechos Humanos (CIDH) y otros no sería sujeto de los derechos establecidos para la persona, los cuales estarían íntimamente relacionados a los derechos de la mujer embarazada. La concepción ocurriría cuando el embrión se implanta en el útero y no aplicaría el artículo 4 de la CIDH. La doctrina, la legislación y la jurisprudencia peruana establecen amplia tutela jurídica a favor del concebido e instauran el inicio de la vida a partir de la fecundación. La Sentencia de la CIDH para el caso Artavia Murillo contra Costa Rica introduce la figura española del preembrión, al cual no se le otorga tutela jurídica hasta los 14 días, momento en que la ciencia médica establece la implantación del embrión en el endometrio materno. Para consideraciones éticas actuales, el embarazo humano empieza con la implantación del blastocisto en el endometrio y no existe sustento para aceptar el derecho del concebido desde el momento de la fecundación como si fuera una persona. Empero se señala que la vida humana posee una continuidad ininterrumpida desde su concepción hasta su fin natural, la muerte. El cigoto es vida que se inicia con dotación genética propia diferente a la de sus progenitores. El embrión preimplantatorio solo podrá originar un ser humano que se gesta y desarrolla dentro del cuerpo de otra persona, con propia dinámica vital.

Fertilization consists of the fusion of the male and female gametes in the outer third of the uterine tube to form the zygote, which begins its cell division, travels to the uterus, implants as a blastocyst in the endometrium after seven days and begins the processes of embryogenesis and morphogenesis. Conception is the action or effect of a woman becoming pregnant. About the rights established for the conceived, the beginning of human life raises a wide discussion between the definitions proposed by science and those of civil society groups. Not being the zygote a human person, according to the Inter-American Court of Human Rights (IACHR) and others, it would not be subject to the rights established for the person, which would be closely related to the rights of the pregnant woman. Conception would occur when the embryo implants in the uterus and Article 4 of the IACHR would not apply. Peruvian doctrine, legislation and jurisprudence establish broad legal protection in favor of the conceived and indicate the beginning of life from the moment of fertilization. The Judgment of the IACHR in the case of Artavia Murillo v. Costa Rica introduces the Spanish figure of the pre-embryo, which is not granted legal protection until 14 days, when medical science establishes the implantation of the embryo in the maternal endometrium. For current ethical considerations, human pregnancy begins with the implantation of the blastocyst in the endometrium and there is no basis for accepting the right of the conceived from the moment of fertilization as if it were a person. However, it is pointed out that human life has an uninterrupted continuity from conception to its natural end, death. The zygote is life that begins with its own genetic endowment different from that of its progenitors. The preimplantation embryo can only give rise to a human being that is gestated and develops within the body of another person, with its own vital dynamics.

Manual collapse of blastocoels in not effective in increasing the viability of vitrified equine embryos / Colabamento manual da blastocele não foi efetivo para aumentar a viabilidade de embriões equinos vitrificados

Embryo cryopreservation methods have been used for commercialization and formation of genetic banks. Cryopreservation of equine embryos <300 µm in diameter, collected at days 6-6.5 after ovulation, allows satisfactory pregnancy rates. However, higher embryo collection rates in mares are obtained when uterine flush is performed between days 7 and 8 after ovulation when embryos are >300 µm in diameter, needing blastocoel collapse for satisfactory resistance to cryopreservation by vitrification. To evaluate the viability of simplified blastocoel collapse by embryo puncture with low technology and low-cost equipment, 22 embryos, collected at day 8 post-ovulation (D8), were allocated to the following groups: (1) micropuncture with a 30 G needle, assisted by a mechanical micromanipulator, before vitrification (n=4); (2) manual blade microsection before vitrification (n=6); (3) no manipulation prior to vitrification (n=8); and (4) freshly inovulated embryos (n=4). Despite the high re-expansion rates observed after vitrification, embryos manipulated prior to vitrification (groups MP and MS) did not result in pregnancy 25 days after transfer. On the other hand, embryos from groups NM (non-micromanipulated) and FR (freshly inovulated) resulted in pregnancies at 25 days. Under the conditions of the present study, manual blastocoel collapse was not efficient in increasing cryotolerance to vitrification among large embryos, requiring improvements to obtain pregnancies.(AU)

Métodos de criopreservação de embriões têm sido utilizados com diversos objetivos. Maiores taxas de coleta embrio-nária em éguas com lavagem uterina realizada 7 a 8 dias pós ovulação. A criopreservação de embriões equinos com diâmetro <300 µm (6-6,5 dias após a ovulação) permite a obtenção de taxas de prenhez satisfatórias. Embriões com diâmetro >300 µm (7º dia pós-ovulação) somente são adequadamente criopreservados quando submetidos a colabamento da blastocele. Objetivando avaliar a viabilidade da punção da blastocele com equipamento de baixa sofisticação e custo, 22 embriões coletados no 8º. dia pós-ovulação (D8) foram alocados aos seguintes grupos: (1) micropunção com uma agulha 30 G assistida por micromanipula-dor antes da vitrificação (n=4); (2) microssecção manual por lâmina antes da vitrificação (n=6); (3) sem manipulação anterior à vitrificação (n=8); e (4) transferidos a fresco (n=4). Apesar de altas taxas de reexpansão após a criopreservação, os embriões manipulados previamente a vitrificação não resultaram em prenhez aos 25 dias. Tanto os embriões não micromanipulados, quanto os transferidos a fresco resultaram em prenhezes aos 25 dias. A microssecção manual não se mostrou eficiente como método para aumento da criotolerância de embriões grandes, necessitando um aprimoramento visando a obtenção de prenhezes.(AU)

In vitro toxicity of Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa on bovine embryos / Toxicidade in vitro da Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa em embriões bovinos

Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, a vine plant found in Brazil, has been correlated to outbreaks of poisoning in cattle and buffaloes, generating economic losses related to the death due to heart failure, miscarriage, abortion, stillbirth, and neonatal mortality. The aim of this study was to examine the embryotoxic potential of the aqueous plant extract on in vitro bovine embryos. In vitro study was performed in five replicates of bovine embryo culture assigned in two groups: control, in vitro embryo culture medium without the aqueous plant extract; treated group, with addition of 2.7mg/mL of aqueous plant extract (10%) to the embryo culture on the sixth day of culture. Cleavage rate was evaluated at day 2 of the cell culture. Viability, hatchability and underdevelopment of blastocysts on the seventh, eighth, and ninth days (D7, D8, and D9, respectively) of culture were assessed under stereoscopic microscope. On day 7, blastocysts were submitted to TUNEL assay to determine apoptotic index. In vitro exposure of bovine embryos to of N. multiglandulosa resulted in reduced embryo development and survival, evaluated by dark cytoplasm indicating poor morphology and poor quality with marked reduction of hatchability. We observed a significant reduction of blastocyst production/number of cleaved embryos (60.6% vs 41.5%); reduction of blastocysts production/total number of matured bovine oocytes (35.1% vs 21.3%); and embryonic hatching rates (38.0% vs 10.0%). However, no effects were observed on the apoptotic rate. In conclusion, aqueous extract of N. multiglandulosa leaves reduces bovine embryo viability in vitro, suggesting possible detrimental effects on embryo development.(AU)

Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, uma videira encontrada no Brasil, tem sido correlacionada a surtos de intoxicações em bovinos e búfalos, gerando perdas econômicas relacionadas à morte por insuficiência cardíaca, aborto, natimorto e mortalidade neonatal. O objetivo deste estudo foi examinar o potencial embriotóxico do extrato vegetal aquoso em embriões bovinos in vitro. O estudo in vitro foi realizado em cinco repetições de cultura de embriões bovinos distribuídos em dois grupos: controle, meio de cultura de embriões in vitro sem o extrato aquoso da planta; grupo tratado, com adição de 2,7mg / mL de extrato vegetal aquoso (10%) à cultura do embrião no sexto dia de cultivo. A taxa de clivagem foi avaliada no dia 2 da cultura de células. Viabilidade, eclodibilidade e subdesenvolvimento de blastocistos no sétimo, oitavo e nono dia (D7, D8 e D9, respectivamente) de cultura foram avaliados em microscópio estereoscópico. No dia 7, os blastocistos foram submetidos ao ensaio TUNEL para determinar o índice apoptótico. Observamos redução significativa da produção de blastocisto / número de embriões clivados (60,6% vs 41,5%); redução da produção de blastocistos / número total de oócitos bovinos maturados (35,1% vs 21,3%); e taxas de eclosão embrionária (38,0% vs 10,0%). No entanto, nenhum efeito foi observado na taxa de apoptose. Em conclusão, o extrato aquoso das folhas de N. multiglandulosa reduz a viabilidade do embrião bovino in vitro, sugerindo possíveis efeitos prejudiciais no desenvolvimento embrionário.(AU)

First Baby Born in Brazil after Simultaneous Diagnosis through Non-Invasive and Conventional PGT-A / Primeiro bebê nascido no Brasil após diagnóstico simultâneo por PGT-A não-invasivo e convencional

Abstract Non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies (niPGT-A) aiming to assess cell-free embryonic DNA in spent culturemedia is promising, especially because it might overcome the diminished rates of implantation caused by the inadequate performance of trophectoderm (TE) biopsy. Our center is part of the largest study to date assessing the concordance between conventional PGT-A and niPGT-A, and we report here the delivery of the first baby born in Brazil using niPGT-A. The parents of the baby were admitted to our center in 2018. They did not present history of infertility, and they were interested in using in vitro fertilization (IVF) and PGT-A in order to avoid congenital anomalies in the offspring. A total of 11 (3 day-5 and 8 day-6) expanded blastocysts were biopsied, and the spent culture media (culture from day-4 to day-6) from 8 day-6 blastocysts were collected for niPGT-A. Overall, 7 embryos yielded informative results for trophectoderm (TE) and media samples. Among the embryos with informative results, 5 presented concordant diagnosis between conventional PGTA and niPGT-A, and 2 presented discordant diagnosis (1 false-positive and one falsenegative). The Blastocyst 4, diagnosed as 46, XY by both niPGT-A and conventional PGTA, was warmed up and transferred, resulting in the birth of a healthy 3.8 kg boy in February 2020. Based on our results and the recent literature, we believe that the safest current application of niPGT-A would be as a method of embryo selection for patients without an indication for conventional PGT-A. The approximate 80% of reliability of niPGT-A in the diagnosis of ploidy is superior to predictions provided by other noninvasive approaches like morphology and morphokinetics selection.

Resumo Abordagens para o teste genético pré-implantacional não-invasivo para aneuploidias (non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies, niPGT-A, em inglês) com o objetivo de avaliar o DNA embrionário livre são promissoras, especialmente porque estas podem reverter as menores taxas de implantação causadas por inadequada biópsia de trofectoderma (TE). Nesse contexto, nosso centro é parte do maior estudo atual que avalia as taxas de concordância entre PGT-A convencional e niPGT-A, e relatamos aqui o nascimento do primeiro bebê brasileiro após niPGT-A. Os pais do bebê foram admitidos no nosso centro em 2018. Eles não apresentavam histórico de infertilidade, e estavam interessados em utilizar os tratamentos de fertilização in vitro (FIV) e PGT-A para evitar anomalias congênitas na progênie.Umtotal de 11 blastocistos expandidos (3 do dia-5 e 8 do dia-6) foram submetidos a biópsia, e os meios de cultivo condicionados (cultivo do dia-4 ao dia-6) de 8 blastocistos do dia-6 foram coletados para niPGT-A. No total, resultados informativos para as amostras de TE e dos meios foram obtidos para sete embriões. Entre os embriões com resultado informativo, 5 apresentaram diagnóstico concordante entre PGT-A convencional e niPGT-A, e 2 apresentaram diagnóstico discordante (1 falso positivo e 1 falso negativo). O Blastocisto 4, diagnosticado como 46, XY por ambos niPGT-A e PGT-A convencional, foi desvitrificado e transferido, o que resultou no nascimento de ummenino saudável, que pesava 3,8 kg, em fevereiro de 2020. Com base em nossos resultados e literatura contemporânea, acreditamos que a aplicação atualmais segura do niPGT-A seria como método de seleção embrionária para pacientes sem indicação ao PGT-A convencional. A confiabilidade aproximada de 80% do niPGT-A para determinação da ploidia ainda é superior àquela obtida com abordagens não invasivas, como seleção morfológica ou morfocinética.

Impact of Plasmatic Progesterone on the Day of Frozen Embryo Transfer in Hormone-induced Cycles / Impacto da progesterona plasmática no dia da transferência de embriões congelados em ciclos induzidos por hormônios

Abstract Objective To establish a relationship between serum progesterone values on the day of frozen blastocyst transfer in hormone-replaced cycles with the probability of pregnancy, miscarriage or delivery. Methods This was an ambispective observational study including all frozen-thawed embryo transfer cycles performed at our department following in vitro fecundation from May 2018 to June 2019. The outcomes evaluated were β human chorionic gonadotropin (β-hCG)-positive pregnancy and delivery. Groups were compared according to the level of serum progesterone on the day of embryo transfer: the 1st quartile of progesterone was compared against the other quartiles and then the 2nd and 3rd quartiles against the 4th quartile. Results A total of 140 transfers were included in the analysis: 87 with β-HCG>10 IU/L (62%), of which 50 (36%) delivered and 37 had a miscarriage (42%).Women with lower progesterone levels (< 10.7ng/mL) had a trend toward higher β-HCG-positive (72 versus 59%; p>0.05), lower delivery (26 versus 39%; p>0.05) and higher miscarriage rates (64 versus 33%; p<0.01). Comparing the middle quartiles (P25-50) with those above percentiles 75, the rate of pregnancy was similar (60 versus 57%; p>0.05), although there was a trend toward a higher number of deliveries (43 versus 31%; p>0.05) and a lower number of miscarriages (28 versus 45%; p>0.05). These differences were not statistically significant. Conclusion There were no differences in pregnancy and delivery rates related with the progesterone level when measured in the transfer day. The miscarriage rate was higher in the 1st quartile group.

Resumo Objetivo Avaliar se existe alguma relação entre os valores plasmáticos de progesterona no dia da transferência de um blastocisto desvitrificado em ciclos hormonalmente substituídos e a taxa de gravidez, aborto ou nascido vivo. Métodos Estudo observacional, ambispectivo, incluindo todos os ciclos de transferência de blastocistos congelados no nosso departamento, entre maio de 2018 e junho de 2019. Avaliou-se a taxa de gravidez e de nascidos vivos após 24 semanas de gestação. Os grupos foram comparados de acordo com os valores de progesterona plasmáticos dosados no dia da transferência do blastocisto: comparou-se o 1° quartil com os outros e depois os 2° e 3° quartis com o 4°. Resultados Avaliaram-se 140 transferências: 87 com β gonadotrofina coriônica humana (β-HCG)>10 IU/L (62%), 50 das quais terminaram em nascido vivo (36% do total), enquanto 37 tiveram um aborto (42% das gravidezes). Verificou-se uma tendência para menor número de recém-nascidos nas transferências com níveis de progesterona no 1° quartil (<10.7ng/mL) (26 versus 39%; p>0.05) e ummaior número de abortos (64 versus 33%; p<0.01). Comparando o 2° e 3° quartis com o 4°, verificouse que nos casos em que a progesterona estava acima do percentil 75, apesar de uma taxa de gravidez semelhante (60 versus 57%; p>0.05), houve uma tendência para uma maior taxa de nascidos vivos (43 versus 31%; p>0.05) emenor número de abortos (28 versus 45%; p>0.05) abaixo do percentil 75. Estas diferenças não foram estatisticamente significativas. Conclusão Não se verificaram diferenças estatisticamente significativas para taxa de gravidez e de nascido vivo. A taxa de aborto foi maior no primeiro quartil.

In vitro performance of Zebu (Bos indicus) and Taurus (Bos taurus) donor cow embryos / Desempenho de vacas doadoras zebuínas (Bos indicus) e taurinas (Bos taurus) na produção de embrião in vitro

In this study, the in vitro production of bovine embryos from zebu and taurine donors was compared. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were obtained from 167 Bos taurus and 161 Bos indicus donors by ovum pick-up. COCs were classified based on their morphological quality, matured in incubators for 22 to 24 h in maturation medium, and then fertilized for 18 to 22 h. The zygotes were transferred to the culture medium for seven days. The embryos were classified as morula (OM), initial blastocyst (BI), blastocyst (BL), and expanded blastocyst (BX), before being transferred to synchronized recipient cows. Pregnancy was diagnosed 30-45 days post-transfer. The Bos indicus donors had a higher oocyte yield (n = 2556) than Bos taurus donors (n = 1903) (P = 0.008). The COCs from zebu donors had a better morphological quality than those from taurine donors (n = 689 vs. 444 for grade 1 COC, P < 0.0001; n = 681 vs. 509 for grade 2 COC, P = 0.010, for zebu and taurine donors, respectively). There were differences in embryo production percentages obtained from OM (0.44% from zebu and 6.42% from taurine, P = 0.017), BL (14.18% from zebu and 3.74% from taurine, P < 0.0001), and BX (81.43% from zebu and 75.13% from taurine, P < 0.0001). No significant difference was observed for embryo production from BI and pregnancy rate (P > 0.05). The Bos indicus cows showed greater oocyte recovery, number of viable oocytes, and production of viable embryos than the Bos taurus cows.(AU)

O objetivo foi avaliar a produção in vitro de embriões bovinos a partir de doadoras zebuína e taurina. Os complexos cumulus oócitos (COCs) foram obtidos de 167 doadoras Bos taurus e 161 Bos indicus, por meio de Ovum pick-up. Os COCs foram classificados quanto à qualidade morfológica, maturados em incubadora por 22 a 24h em meio de maturação, e encaminhados à fertilização entre 18 e 22h. Os zigotos foram transferidos para meio de cultivo, onde permaneceram durante sete dias. Os embriões foram classificados em mórula (MO), blastocisto inicial (BI), blastocisto (BL) e blastocisto expandido (BX), envasados em palhetas contendo meio de cultivo, e inovulados em receptoras sincronizadas. Após 30 e 45 dias da inovulação, realizou-se o diagnóstico de gestação. Os animais Bos indicus apresentaram maior produção oocitária (n = 2556) em comparação aos Bos taurus (n = 1903) (P = 0,008). Os COCs das doadoras zebu apresentaram melhor qualidade morfológica do que das doadoras taurina (n = 689 vs. 444 para COCs grau I, P < 0,0001; n = 681 vs. 509 para COCs grau II, P = 0,010, para doadoras zebu e taurina, respectivamente). Quanto à produção de embriões, houve diferença nas porcentagens obtidas de MO (0,44% zebuínas e 6,42% taurinas, P = 0,017), BL (14,18% zebuínas e 3,74% taurinas, P < 0,0001) e BX (81,43% zebuínas e 75,13% taurinas, P < 0,0001). Não foi observado diferença para BI e taxa de prenhez (P > 0,05). Os animais Bos indicus apresentaram maior recuperação oocitária e maior número de oócitos viáveis em comparação às vacas Bos taurus, como também, maior produção de embriões viáveis.(AU)

In vitro performance of Zebu (Bos indicus) and Taurus (Bos taurus) donor cow embryos / Desempenho de vacas doadoras zebuínas (Bos indicus) e taurinas (Bos taurus) na produção de embrião in vitro

In this study, the in vitro production of bovine embryos from zebu and taurine donors was compared. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were obtained from 167 Bos taurus and 161 Bos indicus donors by ovum pick-up. COCs were classified based on their morphological quality, matured in incubators for 22 to 24 h in maturation medium, and then fertilized for 18 to 22 h. The zygotes were transferred to the culture medium for seven days. The embryos were classified as morula (OM), initial blastocyst (BI), blastocyst (BL), and expanded blastocyst (BX), before being transferred to synchronized recipient cows. Pregnancy was diagnosed 30-45 days post-transfer. The Bos indicus donors had a higher oocyte yield (n = 2556) than Bos taurus donors (n = 1903) (P = 0.008). The COCs from zebu donors had a better morphological quality than those from taurine donors (n = 689 vs. 444 for grade 1 COC, P 0.05). The Bos indicus cows showed greater oocyte recovery, number of viable oocytes, and production of viable embryos than the Bos taurus cows.

O objetivo foi avaliar a produção in vitro de embriões bovinos a partir de doadoras zebuína e taurina. Os complexos cumulus oócitos (COC’s) foram obtidos de 167 doadoras Bos taurus e 161 Bos indicus, por meio de Ovum pick-up. Os COC’s foram classificados quanto à qualidade morfológica, maturados em incubadora por 22 a 24h em meio de maturação, e encaminhados à fertilização entre 18 e 22h. Os zigotos foram transferidos para meio de cultivo, onde permaneceram durante sete dias. Os embriões foram classificados em mórula (MO), blastocisto inicial (BI), blastocisto (BL) e blastocisto expandido (BX), envasados em palhetas contendo meio de cultivo, e inovulados em receptoras sincronizadas. Após 30 e 45 dias da inovulação, realizou-se o diagnóstico de gestação. Os animais Bos indicus apresentaram maior produção oocitária (n = 2556) em comparação aos Bos taurus (n = 1903) (P = 0,008). Os COCs das doadoras zebu apresentaram melhor qualidade morfológica do que das doadoras taurina (n = 689 vs. 444 para COCs grau I, P 0,05). Os animais Bos indicus apresentaram maior recuperação oocitária e maior número de oócitos viáveis em comparação às vacas Bos taurus, como também, maior produção de embriões viáveis.

Correlation between insemination dose and bovine sperm traits on the in vitro embryo production outcomes / Correlação da dose inseminante e características do sêmen bovino no sucesso da produção in vitro de embriões

In the present study we aimed to test the best insemination dose for in vitro embryo production (IVEP) and to correlate sperm traits in bovine. In vitro matured oocytes were inseminated with three different sperm concentrations of the same bull: G1 (1*106 ), G2 (2*106 ) and G3 (4*106 ) sperm/mL. At 18 h post-insemination (hpi), presumptive zygotes [G1 (n=114), G2 (n=139) and G3 (n=136)] were stained to evaluate the pronuclei numbers, or continued to in vitro culture [G1 (n=102), G2 (n=111) and G3 (n=106)]. Sperm kinetics were analyzed using Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). Sperm plasma membrane, acrosome integrity and mitochondrial activity were analyzed using fluorescent probes. In vitro fertilization (IVF) and IVEP data were compared using chisquare (P0.05) among the groups. In G3, the polyspermy rate was the highest (7.4%; P0.05) between G1 (0%) and G2 (0%). In G1, the early blastocyst rate was the highest (7.8%; P0.05) between G2 (1.8%) and G3 (0.9%). The IVF efficiency and total blastocyst rates were positively correlated with curvilinear velocity (VCL) (r≃+1; P<0,05). We concluded that the reduction of insemination dose may negatively affect embryo development and VCL may be used as a parameter to improve the IVEP outcomes.

O objetivo deste estudo foi testar a melhor dose inseminante para a produção de embriões in vitro (IVEP) e sua correlação com as características espermáticas na espécie bovina. Oócitos maturados in vitro foram inseminados com três concentrações diferentes de espermatozoides de único touro: G1 (1*106 ), G2 (2*106 ) e G3 (4*106 ) espermatozoides/mL. Às 18 h pós-inseminação (hpi), os presumíveis zigotos [G1 (114), G2 (139) e G3 (136)] foram corados para avaliar o número de pronúcleos, ou continuaram para o cultivo in vitro [G1 (102), G2 (111) e G3 (106)]. Os parâmetros da cinética espermática foram analisados usando o ComputerAssisted Semen Analysis (CASA). A integridade de membrana plasmática espermática, acrossomal e a atividade mitocondrial foram analisadas usando sondas fluorescentes. Os dados da fertilização in vitro (FIV) e IVEP foram comparadas com qui-quadrado (P=0,05) e correlacionados com dados de CASA e Fluorescência usando Correlação de Pearson (r=±1; P0,05) entre os grupos. Em G3, a taxa de polispermia foi a maior (7,4%; P0,05) entre G1 (0%) e G2 (0%). Em G1, a taxa de blastocisto inicial foi a maior (7,8%; P0,05) com G2 (1,8%) e G3 (0,9%). A eficiência de FIV e a taxa de blastocisto total foram positivamente correlacionadas com velocidade curvilinear (VCL) (P<0,05). Concluímos que a dose inseminante reduzida pode negativamente afetar o desenvolvimento embrionário e VCL pode ser usada como parâmetro para melhorar os resultados da PEIV.

Correlation between insemination dose and bovine sperm traits on the in vitro embryo production outcomes / Correlação da dose inseminante e características do sêmen bovino no sucesso da produção in vitro de embriões

In the present study we aimed to test the best insemination dose for in vitro embryo production (IVEP) and to correlate sperm traits in bovine. In vitro matured oocytes were inseminated with three different sperm concentrations of the same bull: G1 (1*106), G2 (2*106) and G3 (4*106) sperm/mL. At 18 h post-insemination (hpi), presumptive zygotes [G1 (n=114), G2 (n=139) and G3 (n=136)] were stained to evaluate the pronuclei numbers, or continued to in vitro culture [G1 (n=102), G2 (n=111) and G3 (n=106)]. Sperm kinetics were analyzed using Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). Sperm plasma membrane, acrosome integrity and mitochondrial activity were analyzed using fluorescent probes. In vitro fertilization (IVF) and IVEP data were compared using chi-square (P<0.05) and correlated with CASA and fluorescence data using Person Correlation (P<0.05). The IVF efficiency, cleavage and total blastocyst rates did not show any significant difference (P>0.05) among the groups. In G3, the polyspermy rate was the highest (7.4%; P<0.05) without difference (P>0.05) between G1 (0%) and G2 (0%). In G1, the early blastocyst rate was the highest (7.8%; P<0.05), without significant difference (P>0.05) between G2 (1.8%) and G3 (0.9%). The IVF efficiency and total blastocyst rates were positively correlated with curvilinear velocity (VCL) (r≃+1; P<0.05). We concluded that the reduction of insemination dose may negatively affect embryo development and VCL may be used as a parameter to improve the IVEP outcomes.

O objetivo deste estudo foi testar a melhor dose inseminante para a produção de embriões in vitro (IVEP) e sua correlação com as características espermáticas na espécie bovina. Oócitos maturados in vitro foram inseminados com três concentrações diferentes de espermatozoides de único touro: G1 (1*106), G2 (2*106) e G3 (4*106) espermatozoides/mL. Às 18h pós-inseminação (hpi), os presumíveis zigotos [G1 (114), G2 (139) e G3 (136)] foram corados para avaliar o número de pronúcleos, ou continuaram para o cultivo in vitro [G1 (102), G2 (111) e G3 (106)]. Os parâmetros da cinética espermática foram analisados usando o Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). A integridade de membrana plasmática espermática, acrossomal e a atividade mitocondrial foram analisadas usando sondas fluorescentes. Os dados da fertilização in vitro (FIV) e IVEP foram comparadas com qui-quadrado (P=0,05) e correlacionados com dados de CASA e Fluorescência usando Correlação de Pearson (r=±1; P<0,05). A eficiência da FIV, taxas de clivagem e blastocisto total não mostraram diferença significativa (P>0,05) entre os grupos. Em G3, a taxa de polispermia foi a maior (7,4%; P<0,05), sem diferença (P>0,05) entre G1 (0%) e G2 (0%). Em G1, a taxa de blastocisto inicial foi a maior (7,8%; P<0,05), sem apresentar diferença significativa (P>0,05) com G2 (1,8%) e G3 (0,9%). A eficiência de FIV e a taxa de blastocisto total foram positivamente correlacionadas com velocidade curvilinear (VCL) (P<0,05). Concluímos que a dose inseminante reduzida pode negativamente afetar o desenvolvimento embrionário e VCL pode ser usada como parâmetro para melhorar os resultados da PEIV.

Correlation between insemination dose and bovine sperm traits on the in vitro embryo production outcomes / Correlação da dose inseminante e características do sêmen bovino no sucesso da produção in vitro de embriões

In the present study we aimed to test the best insemination dose for in vitro embryo production (IVEP) and to correlate sperm traits in bovine. In vitro matured oocytes were inseminated with three different sperm concentrations of the same bull: G1 (1*106 ), G2 (2*106 ) and G3 (4*106 ) sperm/mL. At 18 h post-insemination (hpi), presumptive zygotes [G1 (n=114), G2 (n=139) and G3 (n=136)] were stained to evaluate the pronuclei numbers, or continued to in vitro culture [G1 (n=102), G2 (n=111) and G3 (n=106)]. Sperm kinetics were analyzed using Computer-Assisted Semen Analysis (CASA). Sperm plasma membrane, acrosome integrity and mitochondrial activity were analyzed using fluorescent probes. In vitro fertilization (IVF) and IVEP data were compared using chisquare (P0.05) among the groups. In G3, the polyspermy rate was the highest (7.4%; P0.05) between G1 (0%) and G2 (0%). In G1, the early blastocyst rate was the highest (7.8%; P0.05) between G2 (1.8%) and G3 (0.9%). The IVF efficiency and total blastocyst rates were positively correlated with curvilinear velocity (VCL) (r≃+1; P<0,05). We concluded that the reduction of insemination dose may negatively affect embryo development and VCL may be used as a parameter to improve the IVEP outcomes.(AU)

O objetivo deste estudo foi testar a melhor dose inseminante para a produção de embriões in vitro (IVEP) e sua correlação com as características espermáticas na espécie bovina. Oócitos maturados in vitro foram inseminados com três concentrações diferentes de espermatozoides de único touro: G1 (1*106 ), G2 (2*106 ) e G3 (4*106 ) espermatozoides/mL. Às 18 h pós-inseminação (hpi), os presumíveis zigotos [G1 (114), G2 (139) e G3 (136)] foram corados para avaliar o número de pronúcleos, ou continuaram para o cultivo in vitro [G1 (102), G2 (111) e G3 (106)]. Os parâmetros da cinética espermática foram analisados usando o ComputerAssisted Semen Analysis (CASA). A integridade de membrana plasmática espermática, acrossomal e a atividade mitocondrial foram analisadas usando sondas fluorescentes. Os dados da fertilização in vitro (FIV) e IVEP foram comparadas com qui-quadrado (P=0,05) e correlacionados com dados de CASA e Fluorescência usando Correlação de Pearson (r=±1; P0,05) entre os grupos. Em G3, a taxa de polispermia foi a maior (7,4%; P0,05) entre G1 (0%) e G2 (0%). Em G1, a taxa de blastocisto inicial foi a maior (7,8%; P0,05) com G2 (1,8%) e G3 (0,9%). A eficiência de FIV e a taxa de blastocisto total foram positivamente correlacionadas com velocidade curvilinear (VCL) (P<0,05). Concluímos que a dose inseminante reduzida pode negativamente afetar o desenvolvimento embrionário e VCL pode ser usada como parâmetro para melhorar os resultados da PEIV.(AU)

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.(AU)

Evaluación de la tasa de blastocistos euploides en fase folicular y lútea (DuoStim) en mujeres con pobre respuesta ovárica: estudio preliminar en México / Euploid blastocyst rate in follicular vs luteal phase (DuoStim) in women with poor ovarian response: Preliminary study in Mexico

Resumen: OBJETIVO: Comparar la tasa de blastocistos euploides obtenida después de la estimulación ovárica en fase folicular con la fase lútea en un mismo ciclo menstrual en pacientes con deficiente respuesta ovárica. MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio clínico, prospectivo y comparativo llevado a cabo en el Centro de Reproducción Arcos, Nascere, entre los meses de enero a julio de 2019. Se incluyeron pacientes con pobre respuesta ovárica según los criterios de Bologna y con indicación de PGT-A. Las estimulaciones en fase folicular y lútea se efectuaron con antagonista de la GnRH y FSHr/LHr (2:1) a partir del día 3 del ciclo y 5 días después de la primera recuperación de los ovocitos. Para completar el proceso de maduración ovocitaria se utilizaron análogos de GnRH, se tomó una biopsia de trofoectodermo en día 5-7. RESULTADOS: Se estudiaron 20 pacientes. Al comparar la fase folicular con la lútea la tasa de fertilización fue de 79% (IC95%: 29-46) vs 55% (IC95%: 34-53), la tasa de blastocistos 42% (IC95%: 19-44) vs 45% (IC95%: 24-55) y la tasa de blastocistos euploides 100% (IC95%: 44-53) vs 70% (IC95%: 38-46), respectivamente. Solo la tasa de recuperación de ovocitos en metafase II mostró diferencias significativas entre ambas fases 40% (IC95%: 18-37) vs 59% (IC95%: 31-59), p = 0.0333 en la fase folicular y lútea, respectivamente. CONCLUSIONES: La estimulación ovárica bifásica (folicular-lútea), en el mismo ciclo menstrual (DuoStim), resultó en mayor tasa de recuperación de ovocitos en metafase II durante la fase lútea. Sin embargo, las tasas de desarrollo embrionario a día 5-6 (blastocistos) y de embriones euploides fueron similares entre ambas fases.

Abstract: OBJECTIVE: Euploid blastocyst rate comparison between ovarian stimulation in follicular vs luteal phase performed in the same menstrual cycle in patients with poor ovarian response. MATERIALS AND METHODS: Clinical, prospective and comparative study conducted at Centro de Reproducción Arcos S.C., "Nascere", during january-july, 2019. Patients with PGT-A indication and poor ovarian response according to Bologna criteria were included. Under a short GnRH-antagonist protocol, stimulations, both in follicular and luteal phase were performed using rFSH/rLH (2:1) from day 3 of the cycle and 5 days after the first oocyte retrieval. In addition, ovulation trigger with an GnRH agonist was used, finally, on day 5-6 of embryo development, trophoctoctoderm biopsy was performed. RESULTS: In this study, 20 patients were included; when comparing follicular phase vs luteal phase, we found that fertilization rate was 79% (95%CI 29-46) vs 55% (95%CI 34-53), blastocysts rate was 42% (95%CI 19-44) vs 45% (95%CI 24-55) and euploid embryo rate was 100% (95%CI 44-53) vs 70% (95%CI 38-46). Only the oocyte recovery rate in metaphase II showed significant differences between both phases 40% (IC 95% 18-37) vs 59% (IC 95% 31-59), p=0.0333. CONCLUSION: Biphasic ovarian stimulation (follicular/ luteal) in the same menstrual cycle (DuoStim) resulted in a higher metaphase II ooctye recovery rate during the luteal phase in comparison with the follicular phase. However, the rates of blastocysts and euploid blastocysts were similar between both phases.

Diagnóstico genético preimplantacional no invasivo; datos preliminares en México / Non-invasive preimplantation genetic diagnosis; preliminary data in Mexico

Resumen: OBJETIVO: Analizar las tasas de concordancia, falsos positivos y negativos entre el ADN embrionario circulante en medio de cultivo y su relación con los reportes de la biopsia de trofoectodermo. MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio observacional, prospectivo y comparativo, llevado a cabo en el Centro de Reproducción Arcos Nascere en noviembre 2018. Criterios: de inclusión: parejas en esquema de fertilización in vitro, con diagnóstico genético preimplantacional de aneuploidias. Criterios de exclusión: pacientes con anomalías estructurales o enfermedades monogénicas. Criterio de eliminación: blastocistos con eclosión asistida. Variables de respuesta: tasa de concordancia, falsos positivos y negativos entre las biopsias de trofoectodermo y los medios de cultivo. El análisis estadístico se realizó con SPSS 25.0, con pruebas t de Student y χ2 con valor de p < 0.05 significativa. RESULTADOS: Se analizaron 20 blastocistos de 5 parejas y se obtuvieron resultados informativos de 17 (amplificación global exitosa); 70% en día 5 y 100% en día 6. La tasa general de concordancia entre las biopsias de trofoectodermo y los medios de cultivo fue de 68.7% (42.8% en día 5 y 88.8% en día 6). En cuanto a las discrepancias, solo se observaron 2 falsos negativos en los medios de cultivo vs la biopsia de trofoectodermo (14.2% en día 5 y 11.11% en día 6); hubo 3 casos de falsos positivos (la mitad en día 5 y ninguno en día 6-7). CONCLUSIONES: Con la prueba genética no invasiva de aneuploidias se alcanzaron altas tasas de concordancia, sobre todo en embriones en día 6.

Abstract: OBJECTIVE: Analyze the concordance, false positive and false negative rates between circulating free DNA of the culture media compared to the results of the trophectoderm biopsy. MATERIALS AND METHODS: Observational, prospective and comparative study, conducted at Arcos Reproduction Center S.C. Nascere in november 2018. Couples with indication of preimplantation genetic diagnosis of aneuploidies undergoing In vitro Fertilization were included; carriers of structural anomalies or monogenic diseases were excluded and blastocysts with assisted hatching were eliminated. The response variables were the concordance, false positives and false negatives rates between trophoctoctoderm biopsies and culture media. Statistical analysis was performed with SPSS 25.0, using t-Student and chi-square tests with a value of p <0.05 significant. RESULTS: Informative results were obtained in 17 of the 20 culture media (85% successful global amplification); 70% on day 5 and 100% on day 6. The general concordance rate between trophectoderm biopsies and culture media was 68.7% (42.8% on day 5 and 88.8% on day 6). Regarding discrepancies, only 2 false negatives were observed in the culture media compared to the trophectoderm biopsy (14.2% on day 5 and 11.1% on day 6). There were 3 cases false positives (42.8% on day 5 and 0% on day 6). CONCLUSIONS: High rates of concordance were reached with the non-invasive genetic aneuploidy test, mainly in embryos on day 6.

Estrategia combinada en fertilización in vitro: mínima estimulación y transferencia de embrión único con diagnóstico genético. Experiencia de 3 años en dos centros de reproducción en México / A combined in-vitro fertilization strategy: minimal stimulation IVF, PGT-A and SET. Results from 3 years' experience at two IVF centers in Mexico

Resumen OBJETIVO: Evaluar los desenlaces de una estrategia combinada para fertilización in vitro: mínima estimulación ovárica, diagnóstico genético preimplantación para aneuploidias y transferencia de un solo embrión. MATERIALES Y MÉTODOS: Estudio de cohorte, retrospectivo, efectuado en dos centros de reproducción de México, en un periodo de tres años. Se incluyeron pacientes entre 25 y 45 años, en protocolo de fertilización in vitro, con mínima estimulación, diagnóstico genético preimplantación para aneuploidias (PGT-A) y transferencia de embrión único. El diagnóstico genético preimplantación se estableció mediante microarreglos y secuenciación de nueva generación (NGS). Para el análisis estadístico se integraron 5 grupos, según la edad de las pacientes: menores de 35 años; 35 a 37 años; 38 a 40 años; 41 a 42 años; y mayores de 42 años. Mediante estadística descriptiva se analizaron las variables numéricas y categóricas. RESULTADOS: Se analizaron 175 ciclos, en 125 pacientes (edad promedio: 39 años ± 5). Se obtuvieron, en promedio, 5 óvulos por ciclo. La tasa de fertilización fue de 86.5% y la de blastocisto por óvulo fertilizado de 50.7%. Se tomó biopsia para diagnóstico genético preimplantación para aneuploidias a 404 embriones. La tasa general de euploidia fue de 33%. Se efectuaron 69 transferencias de embrión único, con una tasa de embarazo por transferencia de 71%. La tasa de nacimiento por transferencia fue de 60.8% (42 nacimientos). CONCLUSIONES: La combinación de mínima estimulación, diagnóstico genético preimplantación para aneuploidias y transferencia de embrión único, es un procedimiento adecuado para alcanzar una tasa de nacimiento alta.

Abstract OBJECTIVE: To evaluate results of a combined approach in IVF, using minimal stimulation, preimplantation genetic testing for aneuploidy, and single blastocyst transfer. MATERIALS AND METHODS: Retrospective cohort study over a three years' period in two fertility centers in Mexico. A total of 125 patients were included, between 25 and 45 years old, with minimal stimulation IVF, preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) and single euploid embryo transfer. PGT was performed using microarrays and next generation sequencing (NGS). RESULTS: A total of 175 cycles (mean age: 39 years old) were analyzed in 125 patients. On average, five eggs were collected per cycle; fertilization rate was 86.57%; blastocyst rate was 50.7% per fertilized egg. Only 33% of embryos were euploid. Pregnancy rate per transferred embryo was 71%. Live birth rate was 60.8% (42 births). CONCLUSIONS: A combination of minimal stimulation, PGT-A and single blastocyst embryo transfer can yield a high live birth rate.

In vitro embryos production of oocytes selected based on follicular size and by brilliant cresyl blue staining / Produção in vitro de embriões de oócitos selecionados baseados no tamanho folicular e por coloração com azul cresil brilhante

We evaluated the competence of bovine oocytes via morphological selection associated with follicular diameter and by brilliant cresyl blue (BCB) staining, in order to improve oocyte selection and the efficiency of in vitro embryo production. Follicles with small (20,05) BCB+ rates, but both differed (p0,05) in MII rate in the mixed (respectively 86.7 ± 3.4 and 75.8 ± 2.2), large (respectively 89.4 ± 2.6 and 79.7 ± 2.3) and small (respectively 76.7 ± 2.9 and 67.2 ± 2.5) diameter groups. Comparing BCB (+ and -) oocytes, we observed (p>0,05) no change in the percentage of embryos in the large group (respectively 67.3 ± 3.3 and 53.5 ± 5.8) and in the small group (respectively 43.8 ± 5.3 and 33.9 ± 2.2), but there was a difference (p<0.05) in the mixed group (respectively 57.8 ± 3.9 and 39.6 ± 7.5). Furthermore, when we compared between follicular groups, the BCB+/large-diameter group (61.1 ± 3.9%) had a significant higher percentage of embryos (p<0.05) than the small-diameter BCB+ (43.8 ± 5.3) groups. To conclude, selection procedures that use follicle size and/or BCB staining may be used as an additional tool to improve the in vitro production of embryos.

Avaliou-se a competência de oócitos bovinos através da seleção morfológica associada ao diâmetro folicular e pela coloração azul cresil brilhante (BCB), a fim de melhorar a seleção de oócitos e a eficiência da produção in vitro de embriões. Folículos com diâmetro pequeno (20,05), mas ambos diferiram (p0,05) na taxa de MII nos grupos mistos (respectivamente 86,7 ± 3,4 e 75,8 ± 2,2), grande (respectivamente 89,4 ± 2,6 e 79,7 ± 2,3) e pequeno (respectivamente 76,7 ± 2,9 e 67,2 ± 2,5). Comparando os oócitos BCB (+ e -), não observamos alteração (p>0,05) na porcentagem de embriões no grupo grande (respectivamente 67,3 ± 3,3 e 53,5 ± 5,8) e no grupo pequeno (respectivamente 43,8 ± 5,3 e 33,9 ± 2,2), mas há houve diferença (p<0,05) no grupo misto (respectivamente 57,8 ± 3,9 e 39,6 ± 7,5). Além disso, quando comparamos os grupos foliculares, o grupo BCB+/grande (61,1 ± 3,9%) apresentou uma porcentagem significativamente maior de embriões (p<0,05) do que o grupo BCB+/pequeno (43,8 ± 5,3). Para concluir, os procedimentos de seleção que usam tamanho do folículo e/ou coloração com BCB podem ser usados como uma ferramenta adicional para melhorar a produção in vitro de embriões.

In vitro embryos production of oocytes selected based on follicular size and by brilliant cresyl blue staining / Produção in vitro de embriões de oócitos selecionados baseados no tamanho folicular e por coloração com azul cresil brilhante

We evaluated the competence of bovine oocytes via morphological selection associated with follicular diameter and by brilliant cresyl blue (BCB) staining, in order to improve oocyte selection and the efficiency of in vitro embryo production. Follicles with small (2<4 mm), large (4–8 mm) or mixed (2–8 mm) diameters were aspirated from slaughterhouse ovaries. Next, the morphologically categorized oocytes were stained and evaluated with 26 μM of BCB (90 min), followed by an assessment of in vitro maturation (MII) and blastocyst production. Oocytes from the large (61.1 ± 3.9%) and mixed (52.9 ± 4.6%) follicular groups showed comparable (p>0,05) BCB+ rates, but both differed (p<0.05) as compared to the small-diameter group (41.0 ± 4.5%). Between the BCB+ and BCB oocytes, there was no difference (p>0,05) in MII rate in the mixed (respectively 86.7 ± 3.4 and 75.8 ± 2.2), large (respectively 89.4 ± 2.6 and 79.7 ± 2.3) and small (respectively 76.7 ± 2.9 and 67.2 ± 2.5) diameter groups. Comparing BCB (+ and -) oocytes, we observed (p>0,05) no change in the percentage of embryos in the large group (respectively 67.3 ± 3.3 and 53.5 ± 5.8) and in the small group (respectively 43.8 ± 5.3 and 33.9 ± 2.2), but there was a difference (p<0.05) in the mixed group (respectively 57.8 ± 3.9 and 39.6 ± 7.5). Furthermore, when we compared between follicular groups, the BCB+/large-diameter group (61.1 ± 3.9%) had a significant higher percentage of embryos (p<0.05) than the small-diameter BCB+ (43.8 ± 5.3) groups. To conclude, selection procedures that use follicle size and/or BCB staining may be used as an additional tool to improve the in vitro production of embryos.(AU)

Avaliou-se a competência de oócitos bovinos através da seleção morfológica associada ao diâmetro folicular e pela coloração azul cresil brilhante (BCB), a fim de melhorar a seleção de oócitos e a eficiência da produção in vitro de embriões. Folículos com diâmetro pequeno (2<4 mm), grande (4-8 mm) ou misto (2-8 mm) foram aspirados de ovários de matadouro. Em seguida, os oócitos classificados morfologicamente foram corados e avaliados com 26 μM de BCB (90 min), seguido de uma avaliação da maturação in vitro (MII) e produção de blastocisto. Os oócitos dos grupos folículo grande (61,1 ± 3,9%) e misto (52,9 ± 4,6%) apresentaram taxas de BCB+ comparáveis (p>0,05), mas ambos diferiram (p<0,05) em relação ao grupo folículo pequeno (41,0 ± 4,5%). Entre os oócitos BCB+ e BCB–, não houve diferença (p>0,05) na taxa de MII nos grupos mistos (respectivamente 86,7 ± 3,4 e 75,8 ± 2,2), grande (respectivamente 89,4 ± 2,6 e 79,7 ± 2,3) e pequeno (respectivamente 76,7 ± 2,9 e 67,2 ± 2,5). Comparando os oócitos BCB (+ e -), não observamos alteração (p>0,05) na porcentagem de embriões no grupo grande (respectivamente 67,3 ± 3,3 e 53,5 ± 5,8) e no grupo pequeno (respectivamente 43,8 ± 5,3 e 33,9 ± 2,2), mas há houve diferença (p<0,05) no grupo misto (respectivamente 57,8 ± 3,9 e 39,6 ± 7,5). Além disso, quando comparamos os grupos foliculares, o grupo BCB+/grande (61,1 ± 3,9%) apresentou uma porcentagem significativamente maior de embriões (p<0,05) do que o grupo BCB+/pequeno (43,8 ± 5,3). Para concluir, os procedimentos de seleção que usam tamanho do folículo e/ou coloração com BCB podem ser usados como uma ferramenta adicional para melhorar a produção in vitro de embriões.(AU)

Las contracciones en blastocistos humanos se correlacionan con aneuploidía, menor implantación y mayor tiempo de llegada a blastocisto: estudio retrospectivo con incubadora Time-Lapse

Objectives:To identify contraction (CT) patterns in human blastocysts using a Time-Lapse incubator and to correlate them with their ploidy status by PGT-A analysis, the time they took to reach blastocyst state, implantation rate and clinical pregnancy rate. Design: Retrospective cohort study. Interventions: From October 2016 through May 2018, 270 patients were evaluated, 912 embryos were cultivated in the Time-Lapse (Embryoscope™, Vitrolife) incubator; 778 of them were tested for aneuploidy using an NGS platform in a reference laboratory. Vitrification was performed according to the result of embryo development and awaiting the NGS result, followed by devitrification and transfer of a single embryo. Blastocyst contractions (CT) were determined using the EmbryoViewer (EmbryoViewer™ drawing tools) in order to obtain area, percentage of contraction and the various types of contractions, and these were compared with the NGS genetic study result. 182 transfers were performed to patients with an average age of 30.4 years, range 24 to 39 years. Finally, we obtained the correlation of implantation rate and clinical pregnancy of euploid embryos transferred in the program of assisted reproduction. Results: Embryos were separated into two groups according to contraction during their development: those that contracted (CT) and those that did not, named "only expanding" (OE). OE embryos were euploid in 58.3%, while 53.6% of CT embryos were aneuploid, with a statistically significant difference (p=0.029), meaning that OE embryos had higher chances of being euploid than CT embryos. Pregnancy rate was also higher in OE embryos (63.1% vs. 46.7% in CT embryos; p=0.012). CT embryos took longer to reach the blastocyst stage compared to OE embryos (p=0.004). Women's age had no correlation with embryo contraction. Conclusions: In this study, embryos who showed contractions had a higher chance of aneuploidy, a lower implantation rate, and required longer to reach the blastocyst stage. The simple fact of observing contractions in an embryo could be useful to decide to transfer another embryo without contractions. Further studies are necessary to prove these findings.

Objetivos. Estudiar los patrones de contracciones en blastocistos humanos mediante el uso de una incubadora time-lapse y correlacionarlos con su estado de ploidía por análisis PGT-A, el tiempo para alcanzar el estado blastocisto, la tasa de implantación y de embarazo clínico. Diseño. Estudio de cohortes retrospectivo. Intervenciones. Entre octubre 2016 y mayo 2018, se evaluó 270 pacientes; se hizo cultivo extendido de 5 a 6 días a 912 embriones en la incubadora time-lapse (Embryoscope, Vitrolife), y a 778 se les estudió para aneuploidía usando una plataforma NGS en un laboratorio de referencia. Hubo posterior vitrificación, según resultado del desarrollo embrionario y en espera del resultado del NGS, seguido de desvitrificación y transferencia de embrión único. Se determinó las contracciones del blastocisto (CTB) mediante la herramienta de dibujo del embrión EmbryoViewer (EmbryoViewer drawing tools), de manera de obtener el área, porcentaje de contracción y los diferentes tipos de contracciones, y se comparó los embriones con el resultado del estudio genético mediante NGS. Se transfirió 182 embriones en pacientes de 30,4 años promedio, rango entre 24 y 39 años. Finalmente, se correlacionó la tasa de implantación y embarazo clínico de los embriones euploides que fueron transferidos, en el programa de reproducción asistida. Resultados. Se separó los embriones en dos grupos de acuerdo a las contracciones durante su desarrollo, en aquellos que las tuvieron (CT) y aquellos que no, denominados 'solo expanding' (SE). Los embriones SE fueron euploides en 58,3%, mientras los embriones CT fueron aneuploides en 53,6%, con significancia estadística (p=0,012). Ello indica que la mayoría de los embriones euploides hacen 'solo expanding' durante su desarrollo, mientras que la mayoría de los embriones aneuploides (53,9%) hacen contracciones durante su desarrollo (p=0,029). Del mismo modo, la tasa de embarazo clínico de los embriones SE euploides fue 63,1% frente a 46,7% de los embriones CT, p=0.012. Finalmente, los embriones euploides CT tardaron más en convertirse en blastocistos tempranos que los embriones SE, p=0.004. La edad de la mujer no representó un factor para contracción embrionaria. Conclusiones. Los resultados obtenidos en este estudio muestran que los embriones que muestran contracciones, sin importar que tan intensas sean, están relacionados con mayor probabilidad de aneuploidías, menor tasa de implantación y ritmos de división lentos. El simple hecho de observar contracciones en un embrión podría ser útil para decidir transferir otro embrión que no las haya tenido. Se requiere más estudios para comprobar estos hallazgos.