Promising use of nanotechnology in Pythium insidiosum: a systematic review / Utilização promissora de nanotecnologia em Pythium insidiosum: uma revisão sistemática

ABSTRACT: The aquatic oomycete Pythium insidiosum is an emerging pathogen highly relevant in human and veterinary medicine and an etiologic agent of pythiosis, a disease of worldwide distribution mainly affecting horses, dogs, and humans, presenting cutaneous, subcutaneous, ocular, gastrointestinal, and systemic forms. The available therapeutic methods to treat this disease and its forms are not entirely effective, thus highlighting the need to investigate the forms of treatments with better efficacy, such as compounds from different pharmacological classes, compounds of natural origin, and new technological alternatives, including nanotechnology. Therefore, this study evaluated scientific publications regarding the use of nanotechnology in P. insidiosum treatment. For this, a systematic literature review, was carried out on articles published from 2010 to 2022 on the LILACS, MEDLINE, Google Scholar, PubMed, and SciELO databases using the descriptors 'Pythium insidiosum,' 'pythiosis,' 'nanotechnology,' 'nanoparticles,' 'nanoemulsion,' and 'treatment.' We reported 162 articles for the researched theme; although, only four studies were included because they met the criteria established herein. A meta-analysis was used for the statistical analysis of the data obtained in vitro studies, and we reported the use of nanotechnology can be a promising alternative in developing antimicrobial compounds with anti-P. insidiosum activity. Nevertheless, additional research is needed to verify the potential use of this technology in clinical therapy against P. insidiosum infections.

RESUMO: O oomiceto aquático Pythium insidiosum é um patógeno emergente de relevância em medicina humana e veterinária. É o agente etiológico da pitiose, uma enfermidade de distribuição mundial, que acomete principalmente em equinos, caninos e seres humanos, podendo apresentar-se nas formas cutâneas, subcutâneas, oculares, gastrointestinais e sistêmicas. Considerando que os métodos terapêuticos disponíveis para o tratamento da doença não são completamente efetivos, há uma necessidade de investigar formas de tratamentos com melhor eficácia, como os compostos de diferentes classes farmacológicas, compostos de origem natural, bem como, novas alternativas tecnológicas, incluindo a nanotecnologia. Deste modo, este trabalho objetivou avaliar publicações científicas referentes a utilização de nanotecnologia em P. insidiosum. Para isso, realizou-se uma revisão sistemática da literatura, buscando artigos no período de 2010 a 2022, nas bases de dados LILACS, MEDLINE, Google Scholar, PubMed e SciELO, utilizando-se os descritores Pythium insidiosum, pitiose, nanotecnologia, nanopartículas, nanoemulsão e tratamento. Encontrou-se 162 artigos com familiaridade a temática pesquisada; no entanto, apenas quatro estudos foram incluídos, pois atendiam os critérios estabelecidos na pesquisa. Para análise estatística dos dados obtidos nos estudos in vitro, utilizou-se meta-análise. Demonstrou-se o promissor uso de nanotecnologia como alternativa no desenvolvimento de compostos antimicrobianos com atividade anti-P. insidiosum. Entretanto, constata-se que estudos adicionais se fazem necessários para verificar o potencial uso desta tecnologia na terapêutica clínica contra infecções por P. insidiosum.

Biosíntesis inducida de fengicina y surfactina en una cepa de Bacillus amyloliquefaciens con actividad oomiceticida sobre zoosporas de Phytophthora capsica / Induced biosynthesis of fengycin and surfactin in a strain of Bacillus amyloliquefaciens with oomyceticidal activity on zoospores of Phytophthora capsici

Resumen La aplicación de metabolitos antimicrobianos biosintetizados por especies de Bacillus es una alternativa potencial para controlar Phytophthora capsici (P. capsici) en hortalizas y podría evitar el uso de productos químicos con acción oomiceticida. El objetivo de este estudio fue evaluar el impacto de la adición al medio de cultivo de distintos agentes (ácido glutámico, hierro, celulosa, quitina y células inactivas de Colletotrichum spp.) sobre la biosíntesis de lipopéptidos en Bacillus amyloliquefaciens KX953161.1 y examinar la capacidad oomiceticida de dichos compuestos in vitro sobre las zoosporas de P. capsici. Los lipopéptidos identificados y cuantificados por cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) en los extractos crudos fueron fengicina y surfactina. El cultivo bacteriano adicionado con células inactivas de Colletotrichum spp. demostró la mayor biosíntesis de lipopéptidos: 1.847,02 ±11,8 pg/mL de fengicina y 2.563,45 ± 18,4 pg/mL de surfactina. Los tratamientos con menor producción de estos lipopéptidos fueron aquellos a los que se añadió hierro (608,05 ± 22,6 pg/mL de fengicina y 903,74 ±22,1 pg/mL de surfactina) o celulosa (563,31 ±11,9 y 936,96 ±41,1 pg/mL, igual orden). El extracto con los lipopéptidos presentó una inhibición del 100% en la germinación de zoosporas de P. capsici, se observó enquistamiento, malformaciones en el tubo germinal y degradación celular. Se concluye que los lipopéptidos producidos por B. amyloliquefaciens KX953161.1 podrían contribuir al control de P. capsici, sin embargo, se requieren más estudios a fin de elucidar el modo de acción biológica de estos compuestos y optimizar el perfil de producción y el rendimiento.

Abstract A potential alternative to the use of chemical products with oomyceticidal action for the control of Phytophthora capsici in vegetables is the use of antimicrobial metabolites, biosynthesized in Bacillus species. The objective of this study was to induce the biosynthesis of lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens KX953161.1 by using glutamic acid, iron, cellulose, chitin, or inactive Colletotrichum spp. cells. The in vitro oomyceticidal effect of the bacterial lipopeptides on zoospores of Phytophthora capsici was evaluated. The lipopeptides identified and quantified in the crude extracts by high performance thin layer chromatography (HPTLC) were fengycin and surfactin. The bacterial culture with inactive fungal cells yielded the greatest biosynthesis of lipopeptides, at 1847.02± 11.8 and 2563.45± 18.4 pg/ml of fengycin and surfactin, respectively and the treatments that obtained lower production of these lipopepti-des, were those to which iron and cellulose were added with 608.05 ± 22.6 and 903.74± 22.1; 563.31± 11.9 and 936.96± 41.1 pg/ml for fengicin and surfactin, respectively. The lipopeptide extracted showed 100% germination inhibition on zoospores of P. capsici, revealing encystment, malformations in the germ tube and cellular degradation. Lipopeptides have the potential to control P. capsici; however, the biosynthesis of these lipopeptides requires further study to determine their biological mode of action and optimize lipopeptide performance and profile.

[Induced biosynthesis of fengycin and surfactin in a strain of Bacillus amyloliquefaciens with oomyceticidal activity on zoospores of Phytophthora capsici]. / Biosíntesis inducida de fengicina y surfactina en una cepa de Bacillus amyloliquefaciens con actividad oomiceticida sobre zoosporas de Phytophthora capsica.

A potential alternative to the use of chemical products with oomyceticidal action for the control of Phytophthora capsici in vegetables is the use of antimicrobial metabolites, biosynthesized in Bacillus species. The objective of this study was to induce the biosynthesis of lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens KX953161.1 by using glutamic acid, iron, cellulose, chitin, or inactive Colletotrichum spp. cells. The in vitro oomyceticidal effect of the bacterial lipopeptides on zoospores of Phytophthora capsici was evaluated. The lipopeptides identified and quantified in the crude extracts by high performance thin layer chromatography (HPTLC) were fengycin and surfactin. The bacterial culture with inactive fungal cells yielded the greatest biosynthesis of lipopeptides, at 1847.02± 11.8 and 2563.45± 18.4 µg/ml of fengycin and surfactin, respectively and the treatments that obtained lower production of these lipopeptides, were those to which iron and cellulose were added with 608.05 ± 22.6 and 903.74± 22.1; 563.31± 11.9 and 936.96± 41.1 µg/ml for fengicin and surfactin, respectively. The lipopeptide extracted showed 100% germination inhibition on zoospores of P. capsici, revealing encystment, malformations in the germ tube and cellular degradation. Lipopeptides have the potential to control P. capsici; however, the biosynthesis of these lipopeptides requires further study to determine their biological mode of action and optimize lipopeptide performance and profile.

Pythiosis in cattle in Northeastern Brazil / Pitiose em bovinos no Nordeste do Brasil

The epidemiological, clinical and pathological aspects of cutaneous pythiosis occurring in cattle from three farms in the Northeastern of Brazil are described. A biopsy of the lesions of one bovine from each farm was performed. In two cases, the affected cattle had contact with water accumulated in dams during the dry season in the semiarid region. Another case occurred in the coastal tropical region in cattle grazing around irrigation channels. Clinically, lesions were observed mainly on the skin of the thoracic and/or pelvic limbs, characterized by flat and irregular ulcerated areas or nodules of varying sizes, some with fistulous tracts penetrating deep into the subcutaneous tissue. In one case the regional lymph nodes were affected. Histologically, in all cases, pyogranulomatous dermatitis associated with negative hyphae images, in hematoxylin-eosin stained sections, were observed. In sections stained by Grocott methenamine silver, the hyphae measured 2-8μm and had irregular ramifications and rare septations. Immunohistochemistry technique demonstrated strong immunolabeling for Pythium insidiosum. Pythiosis should be included in the differential diagnosis of dermatopathies in cattle in the Northeastern of Brazil.(AU)

Descrevem-se os aspectos epidemiológicos, clínicos e patológicos da pitiose cutânea em bovinos de três propriedades do Nordeste do Brasil. Uma biópsia das lesões de um bovino de cada propriedade foi realizada. Em dois casos, os bovinos afetados tiveram acesso à água acumulada em açudes durante a estação seca da região semiárida. O outro bovino acometido estava a pastoreio próximo a canais de irrigação na região litorânea. Clinicamente, as lesões foram observadas principalmente na pele dos membros torácicos e/ou pélvicos e caracterizavam-se por áreas planas e irregulares de ulceração ou nódulos de tamanhos variados, alguns com trajetos fistulosos penetrando profundamente no tecido subcutâneo. Em um caso, os linfonodos regionais foram afetados. Histologicamente, em todos os casos, observou-se dermatite piogranulomatosa associada a imagens negativas de hifas, em secções corados por hematoxilina e eosina. Em seções coradas por metenamina de prata de Grocott, as hifas mediam 2-8μm e possuíam ramificações irregulares com raras septações. A imuno-histoquímica demonstrou forte imunomarcação para Pythium insidiosum. A pitiose deve ser incluída como diagnóstico diferencial de dermatopatias de bovinos no Nordeste do Brasil.(AU)

Pythiosis in cattle in Northeastern Brazil / Pitiose em bovinos no Nordeste do Brasil

The epidemiological, clinical and pathological aspects of cutaneous pythiosis occurring in cattle from three farms in the Northeastern of Brazil are described. A biopsy of the lesions of one bovine from each farm was performed. In two cases, the affected cattle had contact with water accumulated in dams during the dry season in the semiarid region. Another case occurred in the coastal tropical region in cattle grazing around irrigation channels. Clinically, lesions were observed mainly on the skin of the thoracic and/or pelvic limbs, characterized by flat and irregular ulcerated areas or nodules of varying sizes, some with fistulous tracts penetrating deep into the subcutaneous tissue. In one case the regional lymph nodes were affected. Histologically, in all cases, pyogranulomatous dermatitis associated with negative hyphae images, in hematoxylin-eosin stained sections, were observed. In sections stained by Grocott methenamine silver, the hyphae measured 2-8μm and had irregular ramifications and rare septations. Immunohistochemistry technique demonstrated strong immunolabeling for Pythium insidiosum. Pythiosis should be included in the differential diagnosis of dermatopathies in cattle in the Northeastern of Brazil.(AU)

Descrevem-se os aspectos epidemiológicos, clínicos e patológicos da pitiose cutânea em bovinos de três propriedades do Nordeste do Brasil. Uma biópsia das lesões de um bovino de cada propriedade foi realizada. Em dois casos, os bovinos afetados tiveram acesso à água acumulada em açudes durante a estação seca da região semiárida. O outro bovino acometido estava a pastoreio próximo a canais de irrigação na região litorânea. Clinicamente, as lesões foram observadas principalmente na pele dos membros torácicos e/ou pélvicos e caracterizavam-se por áreas planas e irregulares de ulceração ou nódulos de tamanhos variados, alguns com trajetos fistulosos penetrando profundamente no tecido subcutâneo. Em um caso, os linfonodos regionais foram afetados. Histologicamente, em todos os casos, observou-se dermatite piogranulomatosa associada a imagens negativas de hifas, em secções corados por hematoxilina e eosina. Em seções coradas por metenamina de prata de Grocott, as hifas mediam 2-8μm e possuíam ramificações irregulares com raras septações. A imuno-histoquímica demonstrou forte imunomarcação para Pythium insidiosum. A pitiose deve ser incluída como diagnóstico diferencial de dermatopatias de bovinos no Nordeste do Brasil.(AU)

Óleo de girassol ozonizado: atividade anti-Pythium insidiosum / Ozonated sunflower seed oil: anti-Pythium insidiosum activity / Aceite de girasol ozonizado: actividad anti-Pythium incidiosum

Pythium insidiosum é um oomiceto aquático e agente etiológico da pitiose, uma doença de prognóstico desfavorável que acomete mamíferos. Apesar dos avanços nas pesquisas em protocolos terapêuticos, a pitiose continua sendo uma enfermidade de difícil tratamento. Neste trabalho verificou-se a atividade antimicrobiana in vitro do óleo de girassol ozonizado (OGO) frente a P.insidiosum, bem como foi avaliada a inibição do crescimento do oomiceto a partir de kunkers submetidos ao tratamento com OGO. O inóculo utilizado no teste de suscetibilidade in vitro foi preparado a partir de cultura micelial de P.insidiosum (n=30) e os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo M38-A2 (CLSI). O OGO foi obtido comercialmente e as concentrações testadas variaram de 56.000 119/mL a 0,05119/mL. A leitura foi realizada em 48h de incubação e a presença ou ausência de hifas foi levada em consideração. Os resultados dos testes de suscetibilidade demonstraram que a CIM50 e CIM90 foram de 3500 119/mL e 28000 119/mL, respectivamente. Nos ensaios de inibição do crescimento de P. insidiosum a partir de kunkers observou-se que o OGO inibiu completamente o crescimento do oomiceto. Os resultados obtidos permitem inferir que o OGO apresenta relevante atividade anti-P. insidiosum podendo ser um potente aliado nos protocolos terapêuticos da pitiose.(AU)

Pythium insidiosum is an aquatic oomycete and etiologic agent of pythiosis. This disease has an unfavorable prognosis and affecting mammals. Despite advances in treatment, pythiosis remains a difficult disease to treat. In this work, the in vitro ozonated sunflower seed oil (OGO) antimicrobial activity was verified against P.insidiosum isolates. Additionally, we evaluated the oomycete growth inhibition from kunkers submitted to OGO treatment. The inoculum was prepared from P. insidiosum mycelial culture (n=30) and susceptibility tests were performed according to CLSIM38-A2 protocol. OGO was obtained commercially and the concentrations tested ranged from 56,000 119/mL to 0.05119/mL. The reading of results was done at 48h of incubation, and the visual presence or absence of hyphae was taken into consideration. The susceptibility test results showed that the MIC50 and MIC90were 3,500 119/mL and 28,000 119/mL, respectively. In the growth inhibition assays from kunkers it was observed that OGO completely inhibited the oomycete growth. The results allow us to infer that OGO has relevant anti-P. insidiosum activity and may be a potent assistant in the therapeutic protocols of pythiosis.(AU)

Pythium insidiosum es un oomiceto acuático y agente etiológico de la pitiosis, una enfermedad con un pronóstico desfavorable que afecta a los mamíferos. Apesar de los avances en la investigación en tratamientos, la pitiosis sigue una enfermedad difícil de tratar. En este trabajo, se verificó la actividad antimicrobiana in vitro del aceite de girasol ozonizado (OGO) contra P.insidiosum, y se evaluó la inhibición del crecimiento del oomiceto en kunkers sometidos al tratamiento con OGO. El inóculo utilizado en la prueba de susceptibilidad se preparó a partir del cultivo micelial de P.insidiosum (n=30) y los ensayos se realizaron de acuerdo con el protocolo M38-A2 (CLSI). El OGO se obtuvo comercialmente y las concentraciones variaron de 56.000 119/mL a 0,05119/mL. La lectura se realizó a las 48h de incubación y se tuvo en cuenta la presencia o ausencia de hifas. Los resultados de los ensayos de susceptibilidad mostraron que CIM50 y CIM90 fueron 3.500 119/mL y 28.000 119/mL, respectivamente. En los ensayos de inhibición del crecimiento de P. insidiosum de los kunkers se observó que OGO inhibía completamente el crecimiento del oomiceto. Los resultados nos permiten inferir que OGO tiene una relevante actividad anti-P. insidiosum y puede ser un poderoso aliado de los protocolos terapéuticos en la pitiosis.(AU)

Óleo de girassol ozonizado: atividade anti-Pythium insidiosum / Ozonated sunflower seed oil: anti-Pythium insidiosum activity / Aceite de girasol ozonizado: actividad anti-Pythium incidiosum

Pythium insidiosum é um oomiceto aquático e agente etiológico da pitiose, uma doença de prognóstico desfavorável que acomete mamíferos. Apesar dos avanços nas pesquisas em protocolos terapêuticos, a pitiose continua sendo uma enfermidade de difícil tratamento. Neste trabalho verificou-se a atividade antimicrobiana in vitro do óleo de girassol ozonizado (OGO) frente a P.insidiosum, bem como foi avaliada a inibição do crescimento do oomiceto a partir de kunkers submetidos ao tratamento com OGO. O inóculo utilizado no teste de suscetibilidade in vitro foi preparado a partir de cultura micelial de P.insidiosum (n=30) e os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo M38-A2 (CLSI). O OGO foi obtido comercialmente e as concentrações testadas variaram de 56.000 119/mL a 0,05119/mL. A leitura foi realizada em 48h de incubação e a presença ou ausência de hifas foi levada em consideração. Os resultados dos testes de suscetibilidade demonstraram que a CIM50 e CIM90 foram de 3500 119/mL e 28000 119/mL, respectivamente. Nos ensaios de inibição do crescimento de P. insidiosum a partir de kunkers observou-se que o OGO inibiu completamente o crescimento do oomiceto. Os resultados obtidos permitem inferir que o OGO apresenta relevante atividade anti-P. insidiosum podendo ser um potente aliado nos protocolos terapêuticos da pitiose.

Pythium insidiosum is an aquatic oomycete and etiologic agent of pythiosis. This disease has an unfavorable prognosis and affecting mammals. Despite advances in treatment, pythiosis remains a difficult disease to treat. In this work, the in vitro ozonated sunflower seed oil (OGO) antimicrobial activity was verified against P.insidiosum isolates. Additionally, we evaluated the oomycete growth inhibition from kunkers submitted to OGO treatment. The inoculum was prepared from P. insidiosum mycelial culture (n=30) and susceptibility tests were performed according to CLSIM38-A2 protocol. OGO was obtained commercially and the concentrations tested ranged from 56,000 119/mL to 0.05119/mL. The reading of results was done at 48h of incubation, and the visual presence or absence of hyphae was taken into consideration. The susceptibility test results showed that the MIC50 and MIC90were 3,500 119/mL and 28,000 119/mL, respectively. In the growth inhibition assays from kunkers it was observed that OGO completely inhibited the oomycete growth. The results allow us to infer that OGO has relevant anti-P. insidiosum activity and may be a potent assistant in the therapeutic protocols of pythiosis.

Pythium insidiosum es un oomiceto acuático y agente etiológico de la pitiosis, una enfermedad con un pronóstico desfavorable que afecta a los mamíferos. Apesar de los avances en la investigación en tratamientos, la pitiosis sigue una enfermedad difícil de tratar. En este trabajo, se verificó la actividad antimicrobiana in vitro del aceite de girasol ozonizado (OGO) contra P.insidiosum, y se evaluó la inhibición del crecimiento del oomiceto en kunkers sometidos al tratamiento con OGO. El inóculo utilizado en la prueba de susceptibilidad se preparó a partir del cultivo micelial de P.insidiosum (n=30) y los ensayos se realizaron de acuerdo con el protocolo M38-A2 (CLSI). El OGO se obtuvo comercialmente y las concentraciones variaron de 56.000 119/mL a 0,05119/mL. La lectura se realizó a las 48h de incubación y se tuvo en cuenta la presencia o ausencia de hifas. Los resultados de los ensayos de susceptibilidad mostraron que CIM50 y CIM90 fueron 3.500 119/mL y 28.000 119/mL, respectivamente. En los ensayos de inhibición del crecimiento de P. insidiosum de los kunkers se observó que OGO inhibía completamente el crecimiento del oomiceto. Los resultados nos permiten inferir que OGO tiene una relevante actividad anti-P. insidiosum y puede ser un poderoso aliado de los protocolos terapéuticos en la pitiosis.

Mastite por Pythium insidiosum em éguas / Mastitis by Pythium insidiosum in mares

Background: Pythiosis is a chronic inflammatory disease caused by the oomycete Pythium insidiosum. This disease hasbeen reported in several species, but most cases occur in horses. In this species, the cutaneous form is more prevalent,with occasional involvement of adjacent lymph nodes and bone tissue. The involvement of the mammary glands was notproperly characterized. Therefore, the aim of this study is to describe cases of pythiosis with the involvement of the mammary glands in mares.Case: A retrospective study of all biopsy samples and necropsy examinations of horses, performed at the Animal PathologyLaboratory of the Federal University of Campina Grande from January 2000 to December 2018, was carried out. During thestudy period, 142 cases of cutaneous pythiosis were identified. Of these, in three the lesions extended to the mammary glands.Mares with 3-, 7- and 12-year-old, mongrel, from the backlands of the Paraiba were affected. On physical examination, themares presented swollen mammary glands and multifocal wounds, which discharge serosanguinolent secretion. Clinicalevolution ranged from 15 to 30 days. The animals had been medicated, but the wounds did not heal and mastectomies wereperformed. Macroscopically, the mammary glands were enlarged and with multifocal areas of ulceration measuring 1 to 3.5cm in diameter. At the cut surface, they exhibited fistulous tracts containing kunkers. In the histopathological evaluation,was observed diffuse and marked inflammatory infiltrate of eosinophils extending through the deep dermis and interlobularmammary stroma; and multifocal areas, sometimes focally extensive, of eosinophilic necrosis with intralesional negativeimages of hyphae. In histological sections stained by periodic acid-Schiff, the walls of the hyphae were weakly stained inblue; but when impregnated by Grocott methenamine silver, they were strongly marked in black...(AU)

Culture medium and inoculation methodology for the study of soft root rot caused by Phytopythium sp / Meio de cultura e metodologia de inoculação para o estudo da podridão mole de raízes causada por Phytopythium sp

Cassava (Manihot esculenta Crantz) is an important crop in Brazil and Pará is the major producer of roots. High temperature and humidity of tropical regions favor the development of various diseases, among them the cassava root rot. The objective of this study was to evaluate the effect of luminosity and culture medium on the mycelial growth and sporulation of Phytopythium sp. associated with different methods of inoculation on cassava roots. In vitro tests for pathogen growth were established in a 2 x 6 factorial design (luminosity x culture medium) with five replicates and the means were compared by t test (P0.05). The culture medium containing sweet cassava root produced greater mycelial development and higher pathogen sporulation and it was the most suitable medium for pathogen culture. The culture under absence of light generated better mycelial growth than culture under 12 hour of light. Regarding the type of inoculation, the response was better when deeper injuries were induced.(AU)

A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma importante cultura para o Brasil, onde o Pará é o principal produtor de raízes. Regiões tropicais com alta umidade e temperatura favorecem o desenvolvimento de diversas doenças, como as podridões de raiz. O presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito da luminosidade e de meios de cultura no crescimento micelial e na esporulação de Phytopythium sp. e analisar métodos de inoculação do patógeno em raízes de mandioca destacadas. Os ensaios in vitro foram instalados em esquema fatorial 2x6 (luminosidade x meio de cultura), com cinco repetições e as médias comparadas pelo teste t (p0,05). O meio de cultura contendo raiz de mandioca mansa proporcionou maior desenvolvimento micelial e maior esporulação do patógeno e é o mais adequado para o cultivo do patógeno. O cultivo sob ausência de luz gerou melhor crescimento micelial do que o cultivo sob 12 horas de luz. Quanto ao tipo de inoculação, a resposta foi melhor nas raízes que obtiveram ferimentos mais profundos.(AU)

Mastite por Pythium insidiosum em éguas / Mastitis by Pythium insidiosum in mares

Background: Pythiosis is a chronic inflammatory disease caused by the oomycete Pythium insidiosum. This disease hasbeen reported in several species, but most cases occur in horses. In this species, the cutaneous form is more prevalent,with occasional involvement of adjacent lymph nodes and bone tissue. The involvement of the mammary glands was notproperly characterized. Therefore, the aim of this study is to describe cases of pythiosis with the involvement of the mammary glands in mares.Case: A retrospective study of all biopsy samples and necropsy examinations of horses, performed at the Animal PathologyLaboratory of the Federal University of Campina Grande from January 2000 to December 2018, was carried out. During thestudy period, 142 cases of cutaneous pythiosis were identified. Of these, in three the lesions extended to the mammary glands.Mares with 3-, 7- and 12-year-old, mongrel, from the backlands of the Paraiba were affected. On physical examination, themares presented swollen mammary glands and multifocal wounds, which discharge serosanguinolent secretion. Clinicalevolution ranged from 15 to 30 days. The animals had been medicated, but the wounds did not heal and mastectomies wereperformed. Macroscopically, the mammary glands were enlarged and with multifocal areas of ulceration measuring 1 to 3.5cm in diameter. At the cut surface, they exhibited fistulous tracts containing kunkers. In the histopathological evaluation,was observed diffuse and marked inflammatory infiltrate of eosinophils extending through the deep dermis and interlobularmammary stroma; and multifocal areas, sometimes focally extensive, of eosinophilic necrosis with intralesional negativeimages of hyphae. In histological sections stained by periodic acid-Schiff, the walls of the hyphae were weakly stained inblue; but when impregnated by Grocott methenamine silver, they were strongly marked in black...

Culture medium and inoculation methodology for the study of soft root rot caused by Phytopythium sp / Meio de cultura e metodologia de inoculação para o estudo da podridão mole de raízes causada por Phytopythium sp

ABSTRACT: Cassava (Manihot esculenta Crantz) is an important crop in Brazil and Pará is the major producer of roots. High temperature and humidity of tropical regions favor the development of various diseases, among them the cassava root rot. The objective of this study was to evaluate the effect of luminosity and culture medium on the mycelial growth and sporulation of Phytopythium sp. associated with different methods of inoculation on cassava roots. In vitro tests for pathogen growth were established in a 2 x 6 factorial design (luminosity x culture medium) with five replicates and the means were compared by t test (P≤0.05). The culture medium containing sweet cassava root produced greater mycelial development and higher pathogen sporulation and it was the most suitable medium for pathogen culture. The culture under absence of light generated better mycelial growth than culture under 12 hour of light. Regarding the type of inoculation, the response was better when deeper injuries were induced.

RESUMO: A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma importante cultura para o Brasil, onde o Pará é o principal produtor de raízes. Regiões tropicais com alta umidade e temperatura favorecem o desenvolvimento de diversas doenças, como as podridões de raiz. O presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito da luminosidade e de meios de cultura no crescimento micelial e na esporulação de Phytopythium sp. e analisar métodos de inoculação do patógeno em raízes de mandioca destacadas. Os ensaios in vitro foram instalados em esquema fatorial 2x6 (luminosidade x meio de cultura), com cinco repetições e as médias comparadas pelo teste t (p≤0,05). O meio de cultura contendo raiz de mandioca mansa proporcionou maior desenvolvimento micelial e maior esporulação do patógeno e é o mais adequado para o cultivo do patógeno. O cultivo sob ausência de luz gerou melhor crescimento micelial do que o cultivo sob 12 horas de luz. Quanto ao tipo de inoculação, a resposta foi melhor nas raízes que obtiveram ferimentos mais profundos.

Isolation of Saprolegnia aenigmatica oomycetes and protocol for experimental infection of pacu (Piaractus mesopotamicus) / Isolamento do oomiceto Saprolegnia aenigmatica e protocolo de infecção experimental em pacu (Piaractus mesopotamicus)

Successful disease treatment depends on molecular studies under indoor conditions with experimental infection protocols that facilitate understanding the disease and the drug`s efficacy. The internal transcribed spacer (ITS) region was sequenced from three isolates, which were identified as Saprolegnia aenigmatica. Subsequently, healthy fish were immunosuppressed with dexamethasone (1.2 mg kg-1) and descaled to the skin using a sharp scalpel. These individuals were isolated in individual aquariums maintained at 22°C. Individuals in one group were subcutaneously inoculated with 9,000 zoospores (DDZ treatment), a second group was exposed to oomycetes in water with three colonized baits (DDB), a third group was maintained in water without zoospores (DD), and a control group (C) consisted of healthy animals. After 48 and 96 hours, two animals from each group were euthanized for fungal reisolation. The fish from groups DD and C did not show clinical signs, and no oomycetes were isolated. The animals from the DDZ and DDB groups showed cotton-wool-like masses on the skin, and S. aenigmatica was re-isolated. Thus, for infection using zoospores or baits parasitized by S. aenigmatica, an immunosuppressor (dexamethasone) and a sharp scalpel can be used effectively to establish an experimental infection in P. mesopotamicus.

O sucesso do tratamento de uma enfermidade depende do estudo de moléculas em condições de laboratório por meio de protocolos de infecção experimental que viabilizam a compreensão da doença e da eficácia dos fármacos. Pela sequência ITS foram identificadas três cepas de Saprolegnia aenigmatica. Dessa forma, pacus sadios foram submetidos à imunossupressão com dexametasona (1,2 mg kg-1), esfoliados com auxílio de bisturi e distribuídos em aquários a 22ºC. Após este procedimento, um grupo de animais foi inoculado com 9.000 zoósporos/peixe subcutâneo (DEZ), a outro foram adicionadas três iscas colonizadas com o oomiceto na água (DEI), um terceiro grupo foi mantido sem contato com o oomiceto (DE) e um quarto grupo, de animais sadios, representaram o controle (C). Após 48 e 96h deste procedimento, foram eutanaziados animais de cada grupo para reisolamento. Os animais do grupo DE e C não apresentaram sinais clínicos e não foi reisolado o oomiceto. Porém, tanto os animais do grupo DEZ quanto como os animais do grupo DEI apresentaram micélio branco na pele e foi reisolado Saprolegnia aenigmatica. Assim, a infecção com zoósporos ou com iscas colonizadas por S. aenigmatica, com o uso de dexametasona e abrasivo epitelial são formas eficazes de infecção experimental em P. mesopotamicus.

Isolation of Saprolegnia aenigmatica oomycetes and protocol for experimental infection of pacu (Piaractus mesopotamicus) / Isolamento do oomiceto Saprolegnia aenigmatica e protocolo de infecção experimental em pacu (Piaractus mesopotamicus)

Successful disease treatment depends on molecular studies under indoor conditions with experimental infection protocols that facilitate understanding the disease and the drug`s efficacy. The internal transcribed spacer (ITS) region was sequenced from three isolates, which were identified as Saprolegnia aenigmatica. Subsequently, healthy fish were immunosuppressed with dexamethasone (1.2 mg kg-1) and descaled to the skin using a sharp scalpel. These individuals were isolated in individual aquariums maintained at 22°C. Individuals in one group were subcutaneously inoculated with 9,000 zoospores (DDZ treatment), a second group was exposed to oomycetes in water with three colonized baits (DDB), a third group was maintained in water without zoospores (DD), and a control group (C) consisted of healthy animals. After 48 and 96 hours, two animals from each group were euthanized for fungal reisolation. The fish from groups DD and C did not show clinical signs, and no oomycetes were isolated. The animals from the DDZ and DDB groups showed cotton-wool-like masses on the skin, and S. aenigmatica was re-isolated. Thus, for infection using zoospores or baits parasitized by S. aenigmatica, an immunosuppressor (dexamethasone) and a sharp scalpel can be used effectively to establish an experimental infection in P. mesopotamicus.(AU)

O sucesso do tratamento de uma enfermidade depende do estudo de moléculas em condições de laboratório por meio de protocolos de infecção experimental que viabilizam a compreensão da doença e da eficácia dos fármacos. Pela sequência ITS foram identificadas três cepas de Saprolegnia aenigmatica. Dessa forma, pacus sadios foram submetidos à imunossupressão com dexametasona (1,2 mg kg-1), esfoliados com auxílio de bisturi e distribuídos em aquários a 22ºC. Após este procedimento, um grupo de animais foi inoculado com 9.000 zoósporos/peixe subcutâneo (DEZ), a outro foram adicionadas três iscas colonizadas com o oomiceto na água (DEI), um terceiro grupo foi mantido sem contato com o oomiceto (DE) e um quarto grupo, de animais sadios, representaram o controle (C). Após 48 e 96h deste procedimento, foram eutanaziados animais de cada grupo para reisolamento. Os animais do grupo DE e C não apresentaram sinais clínicos e não foi reisolado o oomiceto. Porém, tanto os animais do grupo DEZ quanto como os animais do grupo DEI apresentaram micélio branco na pele e foi reisolado Saprolegnia aenigmatica. Assim, a infecção com zoósporos ou com iscas colonizadas por S. aenigmatica, com o uso de dexametasona e abrasivo epitelial são formas eficazes de infecção experimental em P. mesopotamicus.(AU)

Enzymatic variability among Brazilian Pythium insidiosum isolates.

BACKGROUND: Pythium insidiosum is an oomycete classified in the kingdom Stramenopila. P. insidiosum hyphae are not able to initiate infection without the secretion of hydrolytic enzymes, which are considered an important factor in microbial virulence. AIMS: To evaluate the extracellular enzymatic activity of 14 Brazilian P. insidiosum isolates and a standard strain (ATCC 58637) by the API-ZYM System screening method. METHODS: Zoospores were grown in RPMI 1640 broth, and 65 µL of the liquid phase were inoculated in each cupule of the API-ZYM strips. RESULTS: Differences in the enzymatic activities were observed among the isolates, although phosphohydrolases and ester hydrolases were conspicuous among all isolates. ß-glucosidase was also present in most of the isolates. Enzymatic activities of α-glucosidase and chymotrypsin were not observed, differing from a previous study involving Australian isolates and intracellular enzymes. CONCLUSIONS: The discrepancy in the enzymatic profile observed among Brazilian P. insidiosum isolates reflects the phenotypic variations found in susceptibility tests.

Pythium insidiosum: morphological and molecular identification of Brazilian isolates / Pythium insidiosum: identificação morfológica e molecular de isolados brasileiros

Pythium insidiosum is an oomycete belonging to the kingdom Stramenipila and it is the etiologic agent of pythiosis. Pythiosis is a life-threatening infectious disease characterized by the development of chronic lesions on cutaneous and subcutaneous, intestinal, and bone tissues in humans and many species of animals. The identification of P. insidiosum is important in order to implement a rapid and definitive diagnosis and an effective treatment. This study reports the identification of 54 isolates of P. insidiosum of horses, dogs and sheep that presented suspicious clinical lesions of pythiosis from different regions in Brazil, by using morphological and molecular assays. Throughout the PCR it was possible to confirm the identity of all Brazilian isolates as being P. insidiosum.(AU)

Pythium insidiosum é um oomiceto pertencente ao Reino Stramenopila e agente etiológico da pitiose, uma doença infecciosa com riscos de morte. A pitiose é caracterizada pelo desenvolvimento de lesões crônicas sobre os tecidos cutâneos, subcutâneas, intestinal e ósseo em humanos e muitas espécies de animais. A identificação de P. insidiosum é importante, a fim de se obter um diagnóstico rápido e definitivo, bem como um tratamento eficaz. Este estudo relata a identificação de 54 isolados de P. insidiosum de cavalos, cães e ovelhas que apresentavam lesões compatíveis e suspeita clínicas de pitiose, provenientes de diferentes regiões do Brasil, através de métodos morfológicos e moleculares. Através da PCR foi possível confirmar a identidade de todos os isolados brasileiros como sendo P. insidiosum.(AU)

Pythium insidiosum: morphological and molecular identification of Brazilian isolates / Pythium insidiosum: identificação morfológica e molecular de isolados brasileiros

Pythium insidiosum is an oomycete belonging to the kingdom Stramenipila and it is the etiologic agent of pythiosis. Pythiosis is a life-threatening infectious disease characterized by the development of chronic lesions on cutaneous and subcutaneous, intestinal, and bone tissues in humans and many species of animals. The identification of P. insidiosum is important in order to implement a rapid and definitive diagnosis and an effective treatment. This study reports the identification of 54 isolates of P. insidiosum of horses, dogs and sheep that presented suspicious clinical lesions of pythiosis from different regions in Brazil, by using morphological and molecular assays. Throughout the PCR it was possible to confirm the identity of all Brazilian isolates as being P. insidiosum.

Pythium insidiosum é um oomiceto pertencente ao Reino Stramenopila e agente etiológico da pitiose, uma doença infecciosa com riscos de morte. A pitiose é caracterizada pelo desenvolvimento de lesões crônicas sobre os tecidos cutâneos, subcutâneas, intestinal e ósseo em humanos e muitas espécies de animais. A identificação de P. insidiosum é importante, a fim de se obter um diagnóstico rápido e definitivo, bem como um tratamento eficaz. Este estudo relata a identificação de 54 isolados de P. insidiosum de cavalos, cães e ovelhas que apresentavam lesões compatíveis e suspeita clínicas de pitiose, provenientes de diferentes regiões do Brasil, através de métodos morfológicos e moleculares. Através da PCR foi possível confirmar a identidade de todos os isolados brasileiros como sendo P. insidiosum.

Equine cutaneous pythiosis in Sergipe State, Brazil / Pitiose equina no estado de Sergipe, Brasil

Pythiosis is an aquatic oomycete caused by the Pythium insidiosum. It occurs in some animal species, however the illness is more frequently observed in horses. Pythiosis is closely related to animal contact with contaminated water by the agent. The objective of this study was to evaluate a mare, from the city of Riachão Dantas, in the state of Sergipe. The animal presented in the region of the face, ulcerated granulomes with abundant serosanguineous secretion. It was characterized by its tumoral appearance with necrotic tissue in a yellowish-white coloration, firm consistence, and irregular form known as kunkers. Besides a clinical examination, complementary exams were carried out, such as: isolation of the agent, histopathological and findings of the autopsy, confirming a diagnosis of subcutaneous pythiosis. Surgical treatments, chemotherapy and immunotherapy, were made but there was no recovery of the animal and euthanasia was carried out. It was concluded that pythiosis is a disease that requires attention due to the difficulty in imposing an effective therapy and the risk it poses to the lives of animals affected.

A pitiose é causada pelo oomiceto aquático Pythium insidiosum. Acomete várias espécies animais, porém a doença é mais freqüentemente observada em eqüinos. Epidemiologicamente a doença está intimamente relacionada com o contato dos animais com águas contaminadas pelo agente. Avaliou-se, neste estudo, uma égua proveniente do município Riachão do Dantas, no nordeste do estado de Sergipe. Esse animal apresentava, na região da face, uma lesão ulcerativa e granulomatosa, com secreção serosanguinolenta, de aparência tumoral e com presença de materiais necróticos de coloração branco-amarelada, com consistência firme e de forma irregular conhecido como kunkers. Além do exame clínico, foram realizados exames complementares como: isolamento do agente; histopatológicos e achados de necropsia confirmando o quadro clínico da doença pitiose cutânea. Foram feitos tratamentos cirúrgico, quimioterápico e imunoterápico, porém não se obteve nenhuma recuperação do animal e, com isso, foi realizada a eutanásia. Conclui-se que a pitiose é uma doença que merece destaque pela dificuldade de se impor uma terapia eficiente e pelo risco que representa para a vida de animais, principalmente da espécie equina.

Equine cutaneous pythiosis in Sergipe State, Brazil / Pitiose equina no estado de Sergipe, Brasil

Pythiosis is an aquatic oomycete caused by the Pythium insidiosum. It occurs in some animal species, however the illness is more frequently observed in horses. Pythiosis is closely related to animal contact with contaminated water by the agent. The objective of this study was to evaluate a mare, from the city of Riachão Dantas, in the state of Sergipe. The animal presented in the region of the face, ulcerated granulomes with abundant serosanguineous secretion. It was characterized by its tumoral appearance with necrotic tissue in a yellowish-white coloration, firm consistence, and irregular form known as kunkers. Besides a clinical examination, complementary exams were carried out, such as: isolation of the agent, histopathological and findings of the autopsy, confirming a diagnosis of subcutaneous pythiosis. Surgical treatments, chemotherapy and immunotherapy, were made but there was no recovery of the animal and euthanasia was carried out. It was concluded that pythiosis is a disease that requires attention due to the difficulty in imposing an effective therapy and the risk it poses to the lives of animals affected.

A pitiose é causada pelo oomiceto aquático Pythium insidiosum. Acomete várias espécies animais, porém a doença é mais freqüentemente observada em eqüinos. Epidemiologicamente a doença está intimamente relacionada com o contato dos animais com águas contaminadas pelo agente. Avaliou-se, neste estudo, uma égua proveniente do município Riachão do Dantas, no nordeste do estado de Sergipe. Esse animal apresentava, na região da face, uma lesão ulcerativa e granulomatosa, com secreção serosanguinolenta, de aparência tumoral e com presença de materiais necróticos de coloração branco-amarelada, com consistência firme e de forma irregular conhecido como kunkers. Além do exame clínico, foram realizados exames complementares como: isolamento do agente; histopatológicos e achados de necropsia confirmando o quadro clínico da doença pitiose cutânea. Foram feitos tratamentos cirúrgico, quimioterápico e imunoterápico, porém não se obteve nenhuma recuperação do animal e, com isso, foi realizada a eutanásia. Conclui-se que a pitiose é uma doença que merece destaque pela dificuldade de se impor uma terapia eficiente e pelo risco que representa para a vida de animais, principalmente da espécie equina.

Zoosporogênese in vitro entre isolados do oomiceto Pythium insidiosum / In vitro zoosporogenesis among oomycetes Pythium insidiosum isolates

Pythium insidiosum é um oomiceto aquático, responsável pela etiologia da pitiose, uma enfermidade crônica, observada freqüentemente em eqüinos. A produção de zoósporos móveis por este microrganismo se constitui no fator determinante da ocorrência da enfermidade. Este estudo avaliou a zoosporogênese e quantificou a produção de zoósporos de 32 amostras de Pythium insidiosum isoladas de eqüinos naturalmente infectados. Pythium insidiosum foi cultivado em meio Corn Meal Agar acrescido de fragmentos de grama, durante 5 dias, a 37ºC. Posteriormente, os fragmentos de grama parasitados foram incubados em Meio de Indução a 37ºC, por 24 horas. Observou-se que 16 amostras (50 por cento) produziram 20.000 zoósporos mL-1, 12 isolados (37,5 por cento) produziram acima de 20.000 zoósporos mL-1, enquanto quatro amostras (12,5 por cento) produziram menos de 20.000 zoósporos mL-1. O período de maior produção de zoósporos foi entre 6 e 8 horas de incubação. O protocolo utilizado na indução da zoosporogênese mostrou-se eficiente e representa uma importante ferramenta, tanto para a identificação do Pythium insidiosum, como para a obtenção de zoósporos em quantidades suficientes para a inoculação em animais experimentais e aplicação no desenvolvimento de testes de suscetibilidade.(AU)

Pythium insidiosum is an aquatic oomycete and the etiology of a chronic disease called pythiosis, commonly found in the skin of horses. The production of mobile zoospores by this microorganism is the determinant factor of this disease. This study evaluated the zoosporogenesis and quantification of zoospores in 32 samples of Pythium insidiosum isolated from horses with pythiosis. The assay used culture of the Pythium insidiosum in Corn Meal Agar plus grass blades for 5 days at 37ºC. The grass blades were incubated in Induction Medium at 37ºC for 24 hours. The findings showed 16 samples (50 percent) yielded 20,000 zoospores mL-1, 12 (37.5 percent) samples yielded over 20,000 zoospores mL-1 and 4 samples (12.5 percent) yielded less than 20,000 zoospores mL-1. The zoospores production was higher between 6 and 8 hours of incubation. The protocol used in the zoosporogenesis induction was efficient and represents an important tool for Pythium insidiosum identification and the attainment of zoospores in adequate amounts for inoculation in experimental animals and application in the development of susceptibility tests.(AU)

Zoosporogênese in vitro entre isolados do oomiceto Pythium insidiosum / In vitro zoosporogenesis among oomycetes Pythium insidiosum isolates

Pythium insidiosum é um oomiceto aquático, responsável pela etiologia da pitiose, uma enfermidade crônica, observada freqüentemente em eqüinos. A produção de zoósporos móveis por este microrganismo se constitui no fator determinante da ocorrência da enfermidade. Este estudo avaliou a zoosporogênese e quantificou a produção de zoósporos de 32 amostras de Pythium insidiosum isoladas de eqüinos naturalmente infectados. Pythium insidiosum foi cultivado em meio Corn Meal Agar acrescido de fragmentos de grama, durante 5 dias, a 37ºC. Posteriormente, os fragmentos de grama parasitados foram incubados em Meio de Indução a 37ºC, por 24 horas. Observou-se que 16 amostras (50 por cento) produziram 20.000 zoósporos mL-1, 12 isolados (37,5 por cento) produziram acima de 20.000 zoósporos mL-1, enquanto quatro amostras (12,5 por cento) produziram menos de 20.000 zoósporos mL-1. O período de maior produção de zoósporos foi entre 6 e 8 horas de incubação. O protocolo utilizado na indução da zoosporogênese mostrou-se eficiente e representa uma importante ferramenta, tanto para a identificação do Pythium insidiosum, como para a obtenção de zoósporos em quantidades suficientes para a inoculação em animais experimentais e aplicação no desenvolvimento de testes de suscetibilidade.

Pythium insidiosum is an aquatic oomycete and the etiology of a chronic disease called pythiosis, commonly found in the skin of horses. The production of mobile zoospores by this microorganism is the determinant factor of this disease. This study evaluated the zoosporogenesis and quantification of zoospores in 32 samples of Pythium insidiosum isolated from horses with pythiosis. The assay used culture of the Pythium insidiosum in Corn Meal Agar plus grass blades for 5 days at 37ºC. The grass blades were incubated in Induction Medium at 37ºC for 24 hours. The findings showed 16 samples (50 percent) yielded 20,000 zoospores mL-1, 12 (37.5 percent) samples yielded over 20,000 zoospores mL-1 and 4 samples (12.5 percent) yielded less than 20,000 zoospores mL-1. The zoospores production was higher between 6 and 8 hours of incubation. The protocol used in the zoosporogenesis induction was efficient and represents an important tool for Pythium insidiosum identification and the attainment of zoospores in adequate amounts for inoculation in experimental animals and application in the development of susceptibility tests.