Proteomic analysis of human keratinocytes under UVA-induced stress / Análise proteômica de queratinócitos humanos sob estresse induzido por luz UVA

The solar ultraviolet (UV) radiation that reaches the Earth is composed of 95% of UVA (320 to 400 nm) and 5% of UVB (280 to 320 nm) radiation. UVB is carcinogenic, generating potentially mutagenic DNA lesions. The solar UVA radiation also causes DNA damage, but this fact does not fully account for its biological impact. UVA is absorbed by non-DNA cellular chromophores, generating reactive oxygen species such as singlet oxygen. Knowing the proteome mediates stress responses in cells, here we investigated the cellular effects of a non-cytotoxic dose of UVA radiation, equivalent to about 20 minutes of midday sun exposure, on the proteome of human keratinocytes. Using a combination of mass spectrometry-based proteomics, bioinformatics, and conventional biochemical assays, we analyzed two aspects of UVA-induced stress: spatial remodeling of the proteome in subcellular compartments 30 minutes after stress and long-term changes in protein levels and secretion (24 hours and 7 days postirradiation). In the first part of this thesis, we quantified and assigned subcellular localization for over 3000 proteins, of which about 600 potentially redistribute upon UVA exposure. Protein redistributions were accompanied by redox modulations, mitochondrial fragmentation and DNA damage. In the second part of the work, our results showed that primary human keratinocytes enter senescence upon exposure to a single dose of UVA, mounting antioxidant and inflammatory responses. Cells under UVA-induced senescence further elicit paracrine responses in neighboring premalignant HaCaT epithelial cells via inflammatory mediators. Altogether, these results reiterate the role of UVA radiation as a potent metabolic stressor in the skin

A radiação ultravioleta (UV) solar que atinge a superfície terrestre é composta por 95% de radiação UVA (320 a 400 nm) e 5% de radiação UVB (280 a 320 nm). A radiação UVB é carcinogênica e gera lesões potencialmente mutagênicas no DNA. A radiação UVA solar também gera danos no DNA, mas a genotoxicidade dessa radiação não explica inteiramente o seu impacto biológico. Atualmente, sabe-se que a radiação UVA é absorvida por cromóforos celulares, gerando espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singlete. Sabendo que o proteoma é um mediador de respostas ao estresse celular, nós investigamos os efeitos celulares de uma dose não-citotóxica de radiação UVA, equivalente a cerca de 20 minutos de exposição ao sol, no proteoma de queratinócitos humanos. Utilizando espectrometria de massas, bioinformática e ensaios bioquímicos convencionais, nós analisamos dois aspectos do estresse induzido por radiação UVA: o remodelamento espacial do proteoma 30 minutos depois do estresse e alterações nos níveis e na secreção de proteínas no longo prazo (24 horas e 7 dias depois da irradiação). Na primeira parte desta tese, nós quantificamos e atribuímos classificações de localização subcelular a mais de 3000 proteínas. Dentre essas proteínas, 600 tem potencialmente a sua distribuição subcelular alterada em resposta à radiação. As redistribuições subcelulares são acompanhadas de modulações redox, fragmentação mitocondrial e danos no DNA. Na segunda parte da tese, os nossos resultados mostraram que queratinócitos humanos primários entram em senescência sob exposição a uma única dose de radiação UVA, montando respostas antioxidantes e pró-inflamatórias. Células sob senescência induzida por UVA, por sua vez, desencadeiam respostas parácrinas em queratinócitos pré-tumorais (células HaCaT) por meio de mediadores inflamatórios. Em conjunto, esses resultados reiteram o papel da radiação UVA como um potente estressor metabólico em células da pele

Evaluación genotóxica de las moléculas con efectos tripanocida y leishmanicida cantin-6-ona y 5-metoxicantin-6-ona en células de médula ósea de ratones / Genotoxic evaluation of the molecules with trypanocidal and leishmanicidal effects, canthin-6-one and 5-methoxycanthin-6-one in mouse bone marrow cells

La tripanosomiasis americana y la leishmaniasis son problemas de salud pública relevantes en Iberoamérica. Las drogas utilizadas actualmente para el tratamiento de estas enfermedades poseen efectos colaterales tóxicos severos. Varios grupos de investigación están abocados a la búsqueda de productos naturales y sintéticos para encontrar nuevos agentes terapéuticos efectivos que no presenten reacciones colaterales adversas. En la evaluación de compuestos de la especie vegetal Zanthoxylum chiloperone (Rutaceae), se demostró que compuestos aislados del extracto presentaban actividad leishmanicida, tripanocida y antifúngica in vivo. Teniendo como antecedentes estos resultados, en el presente estudio se evaluaron los efectos genotóxico y citotóxico del cantín-6-ona y del 5-metoxicantin-6-ona, moléculas aisladas de la planta, en células de médula ósea de animales tratados. El estudio de los efectos genotóxicos se hizo a través del ensayo de modificaciones en la frecuencia de micronúcleos y el efecto citotóxico por modificaciones en la relación entre eritrocitos policromáticos y eritrocitos normocromáticos. Se realizaron 2 ensayos independientes y en cada ensayo los animales fueron divididos en tres grupos de tratamiento: GRUPO I: control negativo que recibió 200 uL de agua y 2.1% de DMSO, vía oral, GRUPO II: compuesto a ser evaluado (canthin-6-ona o 5-methoxicantin-6-ona) con 2.1% de DMSO, y GRUPO III: control positivo que recibió ciclofosfamida 50mg/kg/peso del animal, vía intraperitoneal. El análisis estadístico mostró que ambos compuestos no presentaron efectos genotóxicos ni citotóxicos. Estos resultados permiten proponer a estas moléculas como candidatas a ser sometidas a estudios más detallados como potenciales fármacos contra estas dos enfermedades

American trypanosomiasis and leishmaniasis are relevant public health problems in Latin America. The drugs currently used to treat these diseases have severe toxic side effects. Several research groups are dedicated to the search of natural and synthetic products to find new effective therapeutic agents that do not present adverse collateral reactions. In the evaluation of compounds of the plant species Zanthoxylum chiloperone (Rutaceae), it was shown that isolated compounds of the extract had leishmanicidal, trypanocidal and antifungal in vivo activities. Based on these results, the genotoxic and cytotoxic effects of canthin-6-one and 5-methoxycanthin-6-one, molecules isolated from the plant, on bone marrow cells of treated mice were evaluated in the present study. The study of genotoxic effects was made through the test of modifications in the frequency of micronuclei and the cytotoxic effects by modifications in the relationship between polychromatic erythrocytes and normochromic erythrocytes. Two independent assays were performed and in each assay the animals were divided into three treatment groups: GROUP I: negative control that received 200 µL of water and 2.1% of DMSO, orally, GROUP II: compound to be evaluated (canthin-6 -one or 5-methoxycanthin-6-one) with 2.1% DMSO, and GROUP III: positive control that received cyclophosphamide 50mg /kg animal weight, intraperitoneal. Statistical analysis showed that both compounds had neither genotoxic nor cytotoxic effects. These results allow these molecules to be proposed as candidates to be subjected to more detailed studies as potential drugs against these two diseases

Avaliação da biocompatibilidade e atividade antimicrobiana in vitro da matriz de Hidrogel associada ao extrato glicólico do Punica granatum L. (romã) / Evaluation of biocompatibility and antimicrobial action in vitro of a hydrogel scaffolds Hydromatrix associated to glycolic extract of Punica granatum (pomegranate)

A matriz de hidrogel é um biomaterial de nanofibra peptídica tridimensional que induz o crescimento, migração e proliferação celular, assim favorecendo a regeneração tecidual. O objetivo deste trabalho foi avaliar a biocompatibilidade e a atividade antimicrobiana da matriz de hidrogel associado ao extrato romã e ao antimicrobiano ciprofloxacino. Para isso, foram realizadas análises microbiológicas sobre Enterococcus faecalis (ATCC 4083) em cultura planctônica, por meio d ensaio de microdiluição em caldo e em biofilme pelo teste de MTT. Para os ensaios da biocompatibilidade, foi utilizada cultura de macrófagos (RAW 264.7). A citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio de MTT e a genotoxicidade foi realizado pelo teste de micronúcleo. A análise estatística foi realizada pelos testes ANOVA e Tukey, adotando o nível de significância 5%. Os resultados demonstraram que a matriz de hidrogel associado ao extrato de romã não apresentou atividade antimicrobiana para a cultura planctônica como para o biofilme de E. faecalis. Porém, não foi citotóxico e genotóxico para RAW 264.7. Por outro lado, o antimicrobiano ciprofloxacino apresentou atividade antimicrobiana sobre E. faecalis,além de ter apresentado efeitos citotóxico e genotóxico para os macrófagos. Com isso, foi possível concluir que o extrato de romã associado ou não a matriz de hidrogel apresenta ausência de citotóxico, genotóxico e efeito antimicrobiano

The hydrogel matrix is a three-dimensional peptide nanofiber biomaterial that induces cell growth, migration and proliferation, thus favoring tissue regeneration. The objective of this work was to evaluate the biocompatibility and antimicrobial activity of the hydrogel matrix associated with the pomegranate extract and the antimicrobial ciprofloxacin. For this, microbiological analyzes on Enterococcus faecalis (ATCC 4083) were carried out in planktonic culture, by means of the microdilution test in broth and in biofilm by the MTT test. For the biocompatibility assays, macrophage culture (RAW 264.7) was used. Cytotoxicity was assessed by the MTT assay and genotoxicity was performed by the micronucleus test. Statistical analysis was performed by the ANOVA and Tukey tests, adopting the significance level 5%. The results showed that the hydrogel matrix associated with the pomegranate extract did not show antimicrobial activity for the planktonic culture as for the E. faecalis biofilm. However, it was not cytotoxic and genotoxic for RAW 264.7. On the other hand, the antimicrobial ciprofloxacin showed antimicrobial activity on E. faecalis, besides having cytotoxic and genotoxic effects for the macrophages. With this, it was possible to conclude that the pomegranate extract associated or not with the hydrogel matrix shows absence of cytotoxic, genotoxic and antimicrobial effect

Avaliação de genotoxicidade e estresse oxidativo em profissionais recém-expostos aos resíduos de gases anestésicos / Evaluation of genotoxicity and oxidative stress in professionals newly exposed to waste anesthetic gases

Profissionais expostos ocupacionalmente a longos períodos de exposição aos resíduos de gases anestésicos apresentam alterações no genoma. Os dados existentes na literatura em relação ao estresse oxidativo desses profissionais são escassos. O objetivo da presente pesquisa foi avaliar a genotoxicidade e o estresse oxidativo em profissionais recém-expostos aos resíduos de gases anestésicos. O estudo foi realizado em 15 médicos residentes da Anestesiologia e Cirurgia, de ambos os sexos, os quais estiveram sob exposição aos resíduos de gases anestésicos isoflurano, sevoflurano e óxido nitroso (N2O). Como grupo controle, 15 voluntários que não frequentavam o ambiente hospitalar foram avaliados. Coletas de sangue foram realizadas após oito, 16 e 22 meses de exposição no grupo exposto e uma vez no grupo controle. Para avaliação da genotoxicidade, utilizou-se o teste do cometa para detecção de quebras de fitas no DNA. Para avaliação de estresse oxidativo foram determinados o conteúdo total de tióis e as proteínas carboniladas, além das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-Px). A exposição ocupacional aos resíduos de gases anestésicos mostrou-se genotóxica nos três períodos de exposição avaliados em relação ao grupo controle. Quanto às proteínas carboniladas, houve diminuição significativa de seus valores no grupo de residentes após 16 meses de exposição em relação ao grupo controle. O conteúdo total de tióis foi significativamente maior no grupo exposto após 22 meses de exposição, quando comparado ao grupo controle. Em relação ao sistema de defesa antioxidante, não foram detectadas diferenças significativas de SOD e CAT entre os grupos...

Professionals occupationally exposed for several years to waste anesthetic gases present damages in the genome. Literature data regarding oxidative stress in operating room personnel are scarce. The aim of this study was to evaluate the genotoxicity and oxidative stress in professionals newly exposed to waste anesthetic gases. The study was conducted in 15 residents of Anesthesiology and Surgery, of both sexes, who were exposed to the following waste anesthetic gases: isoflurane, sevoflurane and nitrous oxide (N2O). As a control group, 15 volunteers who did not attend to the hospital were evaluated. Blood samples were collected after eight, 16 and 22 months of exposure in the medical residents and at once in the control group. For genotoxicity, the comet assay was utilized to detect DNA breaks. For oxidative stress, carbonyl protein and total thiols, besides antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were evaluated. Occupational exposure to waste anesthetic gases shown to be genotoxic in all exposure times compared to the control. A significant decrease of carbonyl proteins after 16 months of exposure was detected in the group of residents, when compared to the control group. The thiols were significantly higher in the exposed group after 22 months of exposure, when compared to the control group. Regarding the antioxidant defense system, no significant differences were found in SOD and CAT between groups. GSH Px increased in the exposed group after 16 and 22 months compared to the control group...

Citotoxicidad y genotoxicidad del compuesto de minerales trióxido (MTA): una revisión bibliográfica / Cytotoxicity and genotoxicity of mineral trioxide aggregate (MTA): a review

Históricamente, el hidróxido de calcio ha sido sugerido en endodoncia como el material de elección para la inducción de procesos reparativos por medio de la aposición de tejido calcificado. Recientemente, el uso de compuesto de minerales trióxidos (MTA) ha sido altamente recomendado como una alternativa para el tratamiento de reabsorciones radiculares, perforaciones, apicoformación y apexificación, obturaciones retrógradas y protección pulpar directa. Como resultado, el material ha demostrado que posee condiciones fisicoquímicas y biológicas muy superiores como para cumplir holgadamente con estos objetivos. Sin embargo, su acción citotóxica y/o genotóxica, dos aspectos directamente relacionados con sus propiedades biológicas, no ha sido aún claramente establecida. En este trabajo se analiza la bibliografía específica relacionada con la citotoxicidad y genotoxicidad de diferentes presentaciones comerciales de MTA comúnmente disponibles en el mercado.

Efecto genotóxico de la glibenclamida, metformina y terapia combinada en la línea celular de ovario de hámster chino Cricetulus griseus CHO-K-1 / Genotoxic effect of glibenclamide, metformin and combinated therapy on chinese hamster's ovary cell line cricetulus griseus cho

INTRODUCCIÓN: Actualmente, el efecto genotóxico de los antidiabéticos orales es desconocido, motivo por el cual es necesario investigar el tema. MATERIAL Y MÉTODOS: Modelo experimental, para evaluar el efecto genotóxico de los antidiabéticos orales mediante el Test de Intercambio de Cromátides Hermanas (ICH) y el Test de Micronúcleos (MN). Se empleó como material células de la línea celular de ovario de hámster chino (CHO-Kl) Cricetulus griseus y tabletas de glibenclamida y metformina. Las células de la línea celular fueron cultivadas en Ham's F10 suplementado con 2 % estreptomicina-penicilina, 0,5 % L-glutamina y 10% suero bovino fetal (PBS) 20. Las células fueron agrupadas y tratadas con Glibenclamida 5 mg, Metformina 850 mg, Glibenclamida + Metformina 5/850 mg y el grupo control. Los resultados se valoraron en base al Test de Evaluación Genotóxica. RESULTADOS: Se observó un incremento significativo de ICH (p< 0.05) en el grupo de la terapia combinada (8.03 ± 0.17) con respecto al grupo control y a la metformina (6.91 ± 0.19; 6.94 ± 0.45) respectivamente; además se observó un incremento significativo de MN en el grupo de la terapia combinada de glibenclamida con metformina (14.44 ± 0.93), glibenclamida sola (10.18 ± 0.93) Ymetformina sola (7.10 ± 1.04) con respecto al grupo control (3.93 ± 0.46). CONCLUSIÓN: La glibenclamida más metformina produce efecto genotóxico evidenciado por medio de las pruebas ICH y el Test de MN.

INTRODUCTION: Actually, the genotoxic effect of the oral anti-diabetics is unknown, so its important to investigate about it. MATERIAL AND METHODS: We used the experimental design, in order to evaluate the existence of genotoxic effect of the oral antidiabetics by using Sister Chromatid Exchanges (SCE) and Micronucleus assays (MN) techniques. The material was chinese hamster's ovaryan cell line Cricetulus griseus and pills of glibenclamide and metformin. The chinese hamster's ovaryan cellline was grown in Ham's F10 supplemented with streptomycin penicillin 2%, L glutamina 0.5 % and bovine fetal serum 10 % (PBS) 20. Cells were grouped and treated with Glibenclamide 5 mg, Metformin 850 mg, Glibenclamide + Metformine 5/850 mg and the group control. The results were evaluated with the test of Genotoxic assessment. RESULTS: We observed a significant in crease (8,03 ± 0,17) in the treatment with the combined therapy regarding the group control and to the metformin respectively (6.91 ± 0.19; 6.94 ± 0.45), also there were a significant increase of micronucleas in the therapy combined of glibenclamide with metformin (14.44 ± 0.93), glibenclamide alone (10.18 ± 0.93) and metformin alone (7.10 ± 1.04) regarding to the group control (3.93 ± 0.46). CONCLUSION: There is genotoxic effect in the group of combinated therapy (Glibenclamide + Metformine) demonstrated using the of Sister Chromatid Exchanges (SCE) and Micronucleus assays (MN) techniques.

Genotoxicidad en niños que viven en una zona metalúrgica del estado de San Luis Potosí, México / Genotoxicity in children living in a smelter area in San Luis Potosí, Mexico

Al poniente de la Ciudad de San Luis Potosí, México, se encuentra ubicadauna metalúrgica alrededor de la cual se ha encontrado contaminación por arsénico y plomo tanto en aire como en suelo/polvo. Varios estudios han mostrado que los niños que habitan cerca de este lugar están expuestos a dichos metales. Considerando lo anterior y tomando en cuenta reportes de genotoxicidad asociada al arsénico y al plomo, en este trabajo se evaluó el daño al ADN en los niños expuestos empleando el ensayo cometa. Los resultados indican que casi la mitad de los niños que viven en este lugar presentan valores por encima de los límites de acción que marca CDC para arsénico (50 ug/g de creatinina) y paraplomo (10 ug/dL de sangre). En cuanto al daño al ADN el 35% de los niños sobrepasa el máximo valor de daño encontrado en la población control.

A smelter area where arsenic and lead have been found in air and soil/dust is located in San Luis Potosi, México. Some studies have reported that children living in this area are exposed to those metals. Therefore, DNA damage usingthe comet assay was assessed in the exposed children. Our results showed that almost 50% of the studied children had urinary arsenic and blood lead levels higher than the CDC´s guidelines (50 ug/g creatinin for urinary arsenic and 10 ug/dL for lead in blood). With regard to DNA damage 35% of the children had damage values above the control population.

Evaluación clínica y biomarcadores de genotoxicidad en una población de niños y adultos expuestos a múltiples plaguicidas / Clinical assessment and genotoxicity biomarkers in a population of children and adults exposed to multiple pesticides

Se estudia la exposición infantil a plaguicidas de acuerdo a los procesos de trabajo agrícola que se realizan con la familia y aquellas actividades productivas que se desarrollan en su entorno. El objetivo del presente trabajo ha sido investigar la prevalencia de enfermedades y en 60 individuos (26 niños) de un total de 297 pertenecientes a una población que vive y trabaja en un entorno de cultivos hortifrutícola, caña de azúcar y arroz. La evaluación consistió en la realización de una historia clínica ambiental completa, la dosificación del nivel de colinesterasasplasmáticas así como la aplicación del test de aberraciones cromosómicas, ensayo cometa y porcentaje de células apoptóticas. Los plaguicidas más comúnmente utilizados fueron: 2-4D, Carbofuran, Clorpirifos, Cipermetrina, Glifosato y Endosulfan. Se observó una elevada prevalencia de enfermedades respiratorias y cutáneas en niños. Se obtuvo una mayor tendencia al dañogenético en niños y en mujeres, lo que estaría en concordancia con el concepto de mayor vulnerabilidad infantil. Sería necesario obtener nuevas evidencias experimentales para valorar adecuadamente el significado de estos resultados.

Children exposure to pesticides was studied according the working process of their families and the process performed in the surrounding areas. The aim of the present work was to investigate the prevalence of diseases of 60 people (26 children) from a population of 297 inhabitants. who lives and works around orchards, greenhouses, sugar cane and rice crops. The assessment was done by means of the environmental history and clinical examination, plasmatic cholinesterases, chromosomal aberration test, comet assay and apoptosis percentage. Pesticides more frequently sprayed were: 2-4D, Carbofuran, Chlorpyrifos, Cypermetrine, Glyphosate and Endosulfan. The investigation shows a very high frequency of respiratory and skin diseases in children. The biomarkers of genetic damage trend to be higher in children and women, these results support the concept of particular vulnerability of these populations but new experimental evidence in needed to properly evaluate the significanceof these data.

Daño al ADN asociado al contenido de arsénico urinario en una población de jóvenes expuesta al arsénico por el agua de bebida / DNA damage associated to urinary arsenic content in a children population exposed to arsenic by drinking water

El arsénico es un contaminante ampliamente distribuido en el mundo. En Argentina se estima que cerca de un millón y medio de personas están expuestas a sus efectos deletéreos por ingesta de agua con altos tenores de este metaloide. El presente trabajotuvo como objetivo establecer si existe correlación entre la exposición a arsénico inorgánico (AsI) a través del consumo de aguas y el nivel de daño al ADN. Muestras de orina y sangre fueron recolectadas de una población de la provincia de Santiago del Estero. Sobre éstas se evaluó el contenido de arsénico urinario (Asu) como marcador de exposición reciente y el daño producidoal ADN mediante el ensayo de electroforesis de células únicas (test del cometa) en sangre como índice de genotoxicidad. De la población total estudiada (n=65), el 41,54% fueron niños. El 57% de la población infantil presentó valores de Asu superiores al valor máximo referencial (hasta 40μgAs/g creatinina) en un rango comprendido entre 41,78 y 3918,10 μgAs/g creatinina. La evaluación genotóxica en sangre reveló que los niños expuestos a elevados niveles de arsénico presentaron un porcentajede células con alto daño al ADN significativamente mayor al compararlo con aquellos con Asu menor al valor de referencia (32,79% ± 3,32 vs 9,77% ± 6,59; p<0,001). A pesar del bajo número de muestras analizadas en este estudio preliminar, existe una buena correlación entre el contenido de arsénico urinario en la población general y el daño al ADN (r=0,6509; p=0,0117). Los resultados obtenidos muestran que la población estudiada expuesta a altos niveles de arsénico, representa un grupo de riesgo para el desarrollo de patologías relacionadas con este tóxico.

Arsenic is an environmental pollutantwidely distributed in the world. In Argentine about a million and a half of inhabitants are exposed to its deleterious effect by drinking water with high levels of this metalloid. In this work the correlation between the exposure to inorganic arsenic and thelevel of DNA damage in blood cells was assessed. Urine and blood samples were taken from a population of Santiago del Estero province. Urinary total arsenic (Asu) content (a recent exposure biomarker) and single cell gel electrophoresis (Comet assay) wereperformed. Children represented the 41.54% of the sampled population (n=65) and 57% of them had Asu levels between 41.78 and 3918.10 μgAs/g creatinine (reference value: less than 40μgAs/g creatinine). Comet assay showed that children with high levelof Asu presented a percentage of cells with high DNA damage increased respect to those with Asu below the reference value (32.79% ± 3.32 vs 9.77% ± 6.59, p< 0.001). Despite the small number of samples analyzed in this preliminary study, there is a clear tendency of correlation between total arsenic content in urine and DNA damage (r=0.6509, p=0.0117). The data obtained showed that the children population exposed to high levels of arsenic represent a group of risk for developing pathologies related with this toxic.