From Extraction to Stabilization: Employing a 22 Experimental Design in Developing Nutraceutical-Grade Bixin from Bixa orellana L.

Bixin is the main carotenoid found in the outer portion of the seeds of Bixa orellana L., commercially known as annatto. This compound is industrially employed in pharmaceutical, cosmetic, and food formulations as a natural dye to replace chemical additives. This study aimed to extract bixin from annatto seeds and obtain encapsulated bixin in a powder form, using freeze-drying encapsulation and maltodextrin as encapsulating agent. Bixin was extracted from annatto seeds employing successive washing with organic solvents, specifically hexane and methanol (1:1 v/v), followed by ethyl acetate and dichloromethane for subsequent washes, to effectively remove impurities and enhance bixin purity, and subsequent purification by crystallization, reaching 1.5 ± 0.2% yield (or approximately 15 mg of bixin per gram of seeds). Bixin was analyzed spectrophotometrically in different organic solvents (ethanol, isopropyl alcohol, dimethylsulfoxide, chloroform, hexane), and the solvents chosen were chloroform (used to solubilize bixin during microencapsulation) and hexane (used for spectrophotometric determination of bixin). Bixin was encapsulated according to a 22 experimental design to investigate the influence of the concentration of maltodextrin (20 to 40%) and bixin-to-matrix ratio (1:20 to 1:40) on the encapsulation efficiency (EE%) and solubility of the encapsulated powder. Higher encapsulation efficiency was obtained at a maltodextrin concentration of 40% w/v and a bixin/maltodextrin ratio of 1:20, while higher solubility was observed at a maltodextrin concentration of 20% w/v for the same bixin/maltodextrin ratio. The encapsulation of this carotenoid by means of freeze-drying is thus recognized as an innovative and promising approach to improve its stability for further processing in pharmaceutical and food applications.

4-amino-2-phenyl-6-(p-fluorophenyl)-5-carbonitrile-pyrimidine-bis-substituted-loaded liposomes as promising system for cancer treatment.

The aim of the present study was to perform in vitro and in vivo assessments of the antineoplastic action of 4-amino-pyrimidine encapsulated in liposomes. Liposomes were prepared and characterized for particle size and drug encapsulation and submitted to long-term stability tests. Cytotoxicity assays were performed in HeLa cells. Antineoplastic activity was investigated using the experimental sarcoma 180 tumor in Swiss albino mice. Encapsulation efficiency was 82.93 ± 0.04% and no significant changes were found with respect to particle size or pH after centrifugation and mechanical agitation tests. The in vitro results at concentration of 20 µg/mL indicated a considerable reduction in cell viability after treatment with encapsulated pyrimidine (75.91%). The in vivo assays using the compounds in encapsulated and free forms and 5-fluorouracil achieved tumor inhibition rates of 66.47 ± 26.8%, 50.46 ± 16.24% and 14.47 ± 9.22%, respectively. Mitotic counts demonstrated a greater reduction in the number of mitoses in animals treated with liposomal pyrimidine (32.15%) compared to those treated with the pyrimidine free (87.69%) and 5-fluorouracil (71.39%). This study demonstrated that the development of liposome formulations containing 4-amino-pyrimidine is a promising alternative for overcoming limitations related to the toxicity of current cancer treatment, ensuring greater therapeutic efficacy.

Histological evaluation of the liver of mice with sarcoma-180 treated with salazinic acid.

Many of the drugs used to fight cancer cells induce various damage causing hepatotoxic effects which are characterized by tissue changes. The aim of the study is to know the possible effects of salazinic acid on livers of mice exposed to Sacoma-180. The tumor was grown in the animals in ascitic form and inoculated subcutaneously in the axillary region of the mouse developing the solid tumor. Treatment with salazinic acid (25 and 50 mg/kg) and 5-Fluorouracil (20 mg/kg) started 24-hours after inoculation and was performed for 7 days. To verify these effects, the qualitative method of histological criteria investigated in liver tissue was used. It was observed that all treated groups showed an increase of pyknotic nuclei in relation to the negative control. There was an increase in steatosis in all groups compared to the negative control but there was a decrease in the groups treated with salazinic acid in the 5-Fluorouracil. There was no necrosis in the salazinic acid treated groups. However, this effect was seen in 20% of the positive control group. Therefore, it can be concluded that salazinic acid did not show hepatoprotective action on mice but demonstrated a decrease in steatosis and absence of tissue necrosis.

Descrição e variação sazonal na histomorfometria epididimária de Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) em um fragmento de Mata Atlântica no Nordeste do Brasil / Description and seasonal variation in epididymal histomorphometry of Dermanuracinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in a fragment of the Atlantic Forest in the Northeastern Brazil

Description and seasonal variation in epididymal histomorphometry of Dermanuracinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in a fragment of the Atlantic Forest in the Northeastern Brazil. This study aimed to evaluate seasonal patterns in the histomorphometry of the epididymis of Dermanura cinerea (Gervais, 1856) in a fragment of the Atlantic Forest in the Northeastern Brazil. Eighteen adult male specimens captured by mist net were used. The field-work occurred monthly over 18 months, during two consecutive nights. Meteorological data (precipitation) were obtained from the National Institute of Meteorology. After euthanasia, specimens had the epididymis collected, which were fixed and processed. The histological slides produced were stained by Hematoxylin - Eosin and analyzed by optical microscopy. The morphometric parameters analyzed were the tubular, lumen and epithelium areas, of the regions of the initial segment, caput, corpus and cauda of the epididymis. The histomorphometric data were submitted to the Mann-Whitney U test analyzes. The results showed that D. cinerea presented spermatozoa in all regions of the epididymis, except in the initial segment. The highest averages of the tubular, lumen and epithelial areas in the four regions were observed during the dry months. Therefore, D cinerea presented greater sensibility in the region of the cauda of the epididymis, during the months with low rainfall indices. This indicates that environmental conditions have considerable influence on the epididymal morphophysiology of this species, especially in relation to the storage of sperm in the tail of this organ, in area of Atlantic forest in northeastern Brazil.

Esse estudo objetivou avaliar sazonalmente a histomorfometria do epidídimo de Dermanura cinerea (Gervais, 1856) em um fragmento de Mata Atlântica no nordeste do Brasil. Foram utilizados 18 espécimes machos adultos capturados por redes de neblina. As coletas ocorreram mensalmente ao longo de dezoito meses, durante duas noites consecutivas e os dados meteorológicos foram fornecidos pelo Instituto Nacional de Meteorologia. Depois de eutanasiados, os espécimes tiveram os epidídimos coletados e esses órgãos foram fixados e processados. As lâminas histológicas foram coradas por Hematoxilina - Eosina e analisadas em microscopia óptica. Os parâmetros morfométricos analisados foram as áreas do túbulo, do lúmen e do epitélio das regiões do segmento inicial, cabeça, corpo e cauda do epidídimo. Os dados histomorfométricos obtidos foram submetidos às análises no teste U de Mann-Whitney. Os resultados revelaram que D. cinerea apresentou espermatozoides em todas as regiões do epidídimo, exceto no segmento inicial. As maiores médias das áreas tubular, do lúmen e do epitélio nas quatro regiões, foram constatadas durante os meses secos. Portanto, D cinerea apresentou maior sensibilidade na região da cauda do epidídimo, ao longo dos meses com baixos índices pluviométricos. Isso indica que as condições ambientais apresentam considerável influência sobre a morfofisiologia epidídimária dessa espécie, sobretudo, em relação ao armazenamento de espermatozoides na cauda desse órgão, em área de Mata atlântica do nordeste brasileiro.

Descrição e variação sazonal na histomorfometria epididimária de Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) em um fragmento de Mata Atlântica no Nordeste do Brasil

ABSTRACT Description and seasonal variation in epididymal histomorphometry of Dermanuracinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in a fragment of the Atlantic Forest in the Northeastern Brazil. This study aimed to evaluate seasonal patterns in the histomorphometry of the epididymis of Dermanura cinerea (Gervais, 1856) in a fragment of the Atlantic Forest in the Northeastern Brazil. Eighteen adult male specimens captured by mist net were used. The field-work occurred monthly over 18 months, during two consecutive nights. Meteorological data (precipitation) were obtained from the National Institute of Meteorology. After euthanasia, specimens had the epididymis collected, which were fixed and processed. The histological slides produced were stained by Hematoxylin - Eosin and analyzed by optical microscopy. The morphometric parameters analyzed were the tubular, lumen and epithelium areas, of the regions of the initial segment, caput, corpus and cauda of the epididymis. The histomorphometric data were submitted to the Mann-Whitney U test analyzes. The results showed that D. cinerea presented spermatozoa in all regions of the epididymis, except in the initial segment. The highest averages of the tubular, lumen and epithelial areas in the four regions were observed during the dry months. Therefore, D cinerea presented greater sensibility in the region of the cauda of the epididymis, during the months with low rainfall indices. This indicates that environmental conditions have considerable influence on the epididymal morphophysiology of this species, especially in relation to the storage of sperm in the tail of this organ, in area of Atlantic forest in northeastern Brazil.

RESUMO Esse estudo objetivou avaliar sazonalmente a histomorfometria do epidídimo de Dermanura cinerea (Gervais, 1856) em um fragmento de Mata Atlântica no nordeste do Brasil. Foram utilizados 18 espécimes machos adultos capturados por redes de neblina. As coletas ocorreram mensalmente ao longo de dezoito meses, durante duas noites consecutivas e os dados meteorológicos foram fornecidos pelo Instituto Nacional de Meteorologia. Depois de eutanasiados, os espécimes tiveram os epidídimos coletados e esses órgãos foram fixados e processados. As lâminas histológicas foram coradas por Hematoxilina - Eosina e analisadas em microscopia óptica. Os parâmetros morfométricos analisados foram as áreas do túbulo, do lúmen e do epitélio das regiões do segmento inicial, cabeça, corpo e cauda do epidídimo. Os dados histomorfométricos obtidos foram submetidos às análises no teste U de Mann-Whitney. Os resultados revelaram que D. cinerea apresentou espermatozoides em todas as regiões do epidídimo, exceto no segmento inicial. As maiores médias das áreas tubular, do lúmen e do epitélio nas quatro regiões, foram constatadas durante os meses secos. Portanto, D cinerea apresentou maior sensibilidade na região da cauda do epidídimo, ao longo dos meses com baixos índices pluviométricos. Isso indica que as condições ambientais apresentam considerável influência sobre a morfofisiologia epidídimária dessa espécie, sobretudo, em relação ao armazenamento de espermatozoides na cauda desse órgão, em área de Mata atlântica do nordeste brasileiro.

Descrição e variação sazonal na histomorfometria epididimária de Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) em um fragmento de Mata Atlântica no Nordeste do Brasil / Description and seasonal variation in epididymal histomorphometry of Dermanuracinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in a fragment of the Atlantic Forest in the Northeastern Brazil

Description and seasonal variation in epididymal histomorphometry of Dermanuracinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in a fragment of the Atlantic Forest in the Northeastern Brazil. This study aimed to evaluate seasonal patterns in the histomorphometry of the epididymis of Dermanura cinerea (Gervais, 1856) in a fragment of the Atlantic Forest in the Northeastern Brazil. Eighteen adult male specimens captured by mist net were used. The field-work occurred monthly over 18 months, during two consecutive nights. Meteorological data (precipitation) were obtained from the National Institute of Meteorology. After euthanasia, specimens had the epididymis collected, which were fixed and processed. The histological slides produced were stained by Hematoxylin - Eosin and analyzed by optical microscopy. The morphometric parameters analyzed were the tubular, lumen and epithelium areas, of the regions of the initial segment, caput, corpus and cauda of the epididymis. The histomorphometric data were submitted to the Mann-Whitney U test analyzes. The results showed that D. cinerea presented spermatozoa in all regions of the epididymis, except in the initial segment. The highest averages of the tubular, lumen and epithelial areas in the four regions were observed during the dry months. Therefore, D cinerea presented greater sensibility in the region of the cauda of the epididymis, during the months with low rainfall indices. This indicates that environmental conditions have considerable influence on the epididymal morphophysiology of this species, especially in relation to the storage of sperm in the tail of this organ, in area of Atlantic forest in northeastern Brazil.(AU)

Esse estudo objetivou avaliar sazonalmente a histomorfometria do epidídimo de Dermanura cinerea (Gervais, 1856) em um fragmento de Mata Atlântica no nordeste do Brasil. Foram utilizados 18 espécimes machos adultos capturados por redes de neblina. As coletas ocorreram mensalmente ao longo de dezoito meses, durante duas noites consecutivas e os dados meteorológicos foram fornecidos pelo Instituto Nacional de Meteorologia. Depois de eutanasiados, os espécimes tiveram os epidídimos coletados e esses órgãos foram fixados e processados. As lâminas histológicas foram coradas por Hematoxilina - Eosina e analisadas em microscopia óptica. Os parâmetros morfométricos analisados foram as áreas do túbulo, do lúmen e do epitélio das regiões do segmento inicial, cabeça, corpo e cauda do epidídimo. Os dados histomorfométricos obtidos foram submetidos às análises no teste U de Mann-Whitney. Os resultados revelaram que D. cinerea apresentou espermatozoides em todas as regiões do epidídimo, exceto no segmento inicial. As maiores médias das áreas tubular, do lúmen e do epitélio nas quatro regiões, foram constatadas durante os meses secos. Portanto, D cinerea apresentou maior sensibilidade na região da cauda do epidídimo, ao longo dos meses com baixos índices pluviométricos. Isso indica que as condições ambientais apresentam considerável influência sobre a morfofisiologia epidídimária dessa espécie, sobretudo, em relação ao armazenamento de espermatozoides na cauda desse órgão, em área de Mata atlântica do nordeste brasileiro.(AU)

Comparative retinal histomorphometry and visual acuity of three bat species of the genus Artibeus (Phyllostomidae: Stenodermatinae) / Histomorfometria comparada da retina e acuidade visual de três espécies de morcegos do gênero Artibeus (Phyllostomidae: Stenodermatinae)

This study performed a histomorphometric analysis of the retina and estimated the visual acuity of three fruit-eating bats of the genus Artibeus, including Artibeus lituratus, Artibeus planirostris and Artibeus obscurus. In total, 13 animals were used for this study, in which the retinas were hemidisected, fixed, cut, and stained. The visual acuity was determined by the density of ganglion cells in the retina and the retinal layers were also measured from histological sections. The retinas of these bats are avascular, do not present tapetum lucidum in any quadrant, and have the 10 retinal layers common in mammals. Moreover, it was observed that the thickness of the retina in the central region was significantly higher in all measured parameters (p<0.001), except for the outer plexiform layer (OPL) which was significantly higher in the peripheral region (p<0.001). The retinas of the three species showed a horizontal visual streak with a higher concentration of retinal ganglion cells (RGCs) at the inferotemporal region. In addition, the species A. lituratus exhibited extras areas of high cell density in the retina. Thus, A. lituratus showed the highest visual acuity (1.92 cycles/degree), while A. planirostris showed a visual acuity of (1.77 cycles/degree) and A. obscurus exhibited the lowest visual acuity (1.50 cycles/degree). All these characteristics are related to the echolocation system and the eating habits of each species. Therefore, it can be concluded that bats of the genus Artibeus have a high visual acuity value compared to other echolocating bats and all these differences might be directly linked to the phylogeny of the genus.(AU)

Este estudo realizou uma análise histomorfométrica da retina e determinou os valores de acuidade visual de três espécies de morcegos do gênero Artibeus, incluindo Artibeus lituratus, Artibeus planirostris e Artibeus obscurus. Em total, 13 animais foram usados para esse estudo, no qual as retinas foram hemidissecadas, fixadas, cortadas e coradas. A acuidade visual foi determinada pela densidade de células ganglionares na retina e também foi realizado a mensuração das camadas retinianas a partir de cortes histológicos. As retinas dessas três espécies são avasculares, não apresentaram tapetum lucidum em nenhum quadrante e possuem as 10 camadas retinianas comum em mamíferos. Verificou-se também que a espessura da retina na região central foi significativamente maior em todos os parâmetros mensurados (p<0,001), com exceção da camada plexiforme externa (OPL) que foi significativamente maior na região periférica (p<0,001). As retinas das três espécies exibiram uma especialização retiniana em forma de faixa visual horizontal apresentando a maior concentração de células ganglionares na região inferotemporal. Além disso, a espécie A. lituratus exibiu áreas extras de alta densidade celular na retina. Assim, a espécie A. lituratus exibiu a maior acuidade visual (1,92 ciclos/grau), A. planirostris mostrou um valor intermediário entre essas duas espécies (1,77 ciclos/grau) e A. obscurus exibiu a menor acuidade visual (1,50 ciclos/grau). Todas estas características estão relacionadas aos padrões de ecolocalização e hábitos alimentares de cada espécie. Portanto, pode-se concluir que os morcegos do gênero Artibeus têm um alto valor de acuidade visual em comparação com outros morcegos ecolocalizadores e todas essas diferenças devem estar diretamente ligadas à filogenia do gênero.(AU)

Comparative retinal histomorphometry and visual acuity of three bat species of the genus Artibeus (Phyllostomidae: Stenodermatinae) / Histomorfometria comparada da retina e acuidade visual de três espécies de morcegos do gênero Artibeus (Phyllostomidae: Stenodermatinae)

This study performed a histomorphometric analysis of the retina and estimated the visual acuity of three fruit-eating bats of the genus Artibeus, including Artibeus lituratus, Artibeus planirostris and Artibeus obscurus. In total, 13 animals were used for this study, in which the retinas were hemidisected, fixed, cut, and stained. The visual acuity was determined by the density of ganglion cells in the retina and the retinal layers were also measured from histological sections. The retinas of these bats are avascular, do not present tapetum lucidum in any quadrant, and have the 10 retinal layers common in mammals. Moreover, it was observed that the thickness of the retina in the central region was significantly higher in all measured parameters (p<0.001), except for the outer plexiform layer (OPL) which was significantly higher in the peripheral region (p<0.001). The retinas of the three species showed a horizontal visual streak with a higher concentration of retinal ganglion cells (RGCs) at the inferotemporal region. In addition, the species A. lituratus exhibited extras areas of high cell density in the retina. Thus, A. lituratus showed the highest visual acuity (1.92 cycles/degree), while A. planirostris showed a visual acuity of (1.77 cycles/degree) and A. obscurus exhibited the lowest visual acuity (1.50 cycles/degree). All these characteristics are related to the echolocation system and the eating habits of each species. Therefore, it can be concluded that bats of the genus Artibeus have a high visual acuity value compared to other echolocating bats and all these differences might be directly linked to the phylogeny of the genus.(AU)

Este estudo realizou uma análise histomorfométrica da retina e determinou os valores de acuidade visual de três espécies de morcegos do gênero Artibeus, incluindo Artibeus lituratus, Artibeus planirostris e Artibeus obscurus. Em total, 13 animais foram usados para esse estudo, no qual as retinas foram hemidissecadas, fixadas, cortadas e coradas. A acuidade visual foi determinada pela densidade de células ganglionares na retina e também foi realizado a mensuração das camadas retinianas a partir de cortes histológicos. As retinas dessas três espécies são avasculares, não apresentaram tapetum lucidum em nenhum quadrante e possuem as 10 camadas retinianas comum em mamíferos. Verificou-se também que a espessura da retina na região central foi significativamente maior em todos os parâmetros mensurados (p<0,001), com exceção da camada plexiforme externa (OPL) que foi significativamente maior na região periférica (p<0,001). As retinas das três espécies exibiram uma especialização retiniana em forma de faixa visual horizontal apresentando a maior concentração de células ganglionares na região inferotemporal. Além disso, a espécie A. lituratus exibiu áreas extras de alta densidade celular na retina. Assim, a espécie A. lituratus exibiu a maior acuidade visual (1,92 ciclos/grau), A. planirostris mostrou um valor intermediário entre essas duas espécies (1,77 ciclos/grau) e A. obscurus exibiu a menor acuidade visual (1,50 ciclos/grau). Todas estas características estão relacionadas aos padrões de ecolocalização e hábitos alimentares de cada espécie. Portanto, pode-se concluir que os morcegos do gênero Artibeus têm um alto valor de acuidade visual em comparação com outros morcegos ecolocalizadores e todas essas diferenças devem estar diretamente ligadas à filogenia do gênero.(AU)

Analysis of the reproductive stage and ovarian histomorphometry of Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in an Atlantic Forest fragment of Pernambuco, northeastern Brazil / Análise do estágio reprodutivo e histomorfometria ovariana de Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) em um fragmento de Mata Atlântica de Pernambuco, Nordeste do Brasil

This study aimed to analyze the reproductive stage, histology and morphometry of the ovary of Dermanura cinerea in an Atlantic Forest fragments in the Biological Reserve of Saltinho, Pernambuco, Brazil. Adult females were captured monthly by mist net, during two consecutive nights from June/2014 to November/2015. The meteorological data were provided by the National Institute of Meteorology and grouped together with the reproductive data, in six periods: period I (June to August/2014), period II (September to November/2014), period III (December/2014 to February/2015), period IV (March to May/2015), period V (June to August/2015) and period VI (September to November/2015). The females were classified according to their reproductive stages in: Inactive, pregnant, lactating and postlactating. Among the 25 females caught, 10 inactive females were selected for the histomorphometric analysis of the ovaries and then they were euthanized. After that, the specimens had their ovaries removed, fixed, processed and included in Paraplast. The organs were cut and stained by Hematoxylin - Eosin and the histological slides produced were submitted to the appropriate optical microscope analysis. Each type of ovarian follicle was estimated according to the histological characteristics evidenced for other mammals. In the morphometric analysis, it was considered: The area of the ovary (measured in square millimeter), Quantification of different types of ovarian follicles (unilaminar and multilaminar primary follicles, antral and matures) and corpus luteum, as well as the area of each by those different follicles (measured in square micrometer) The results indicated that 16 females were inactive, 5 were lactating, 4 were pregnant and no post-lactating. The histological analysis revealed that the ovaries of D. cinerea exhibit characteristics, structures and cellular types similar to other mammals...(AU)

Esse estudo objetivou analisar o estágio reprodutivo, histologia e morfometria do ovário de Dermanura cinerea em um fragmento de Mata Atlântica da Reserva Biológica de Saltinho (Pernambuco, Brasil). Foram utilizadas fêmeas adultas capturadas por redes de neblina, de modo que as coletas ocorreram mensalmente, durante duas noites consecutivas de Junho/2014 a Novembro/2015. Os dados meteorológicos foram fornecidos pelo Instituto Nacional de Meteorologia e agrupados, juntamente com os dados reprodutivos, em seis períodos, sendo estes: período I (Junho a agosto/2014), período II (Setembro a novembro/2014), período III (Dezembro/2014 a fevereiro/2015) período IV (Março a maio/2015), período V (Junho a agosto/2015) e período VI (Setembro a novembro/2015). As fêmeas foram classificadas, de acordo com o estágio reprodutivo em: inativas, grávidas, lactantes e pós-lactantes. Das 25 fêmeas capturadas, foram selecionadas, para as análises histomorfométricas dos ovários, 10 fêmeas inativas, as quais foram eutanasiadas. Depois disso, os espécimes tiveram os seus ovários removidos, fixados, processados e inclusos em paraplast. Os cortes foram corados por Hematoxilina - Eosina e as lâminas histológicas produzidas foram submetidas às devidas análises em microscópio óptico. Cada tipo de folículo ovariano foi estimado de acordo com as características histológicas evidenciadas para outros mamíferos. Nas análises morfométricas, considerou-se: a área do ovário (mensurada em milímetro quadrado), quantificação dos diferentes tipos de folículos ovarianos (primários unilaminar e multilaminar, antrais e maduros) e corpo lúteo, bem como foi medida a área de cada um desses diferentes tipos de folículos (mensurada em micrômetro quadrado). Os resultados indicaram a presença de 16 fêmeas inativas, 5 lactantes, 4 grávidas e nenhuma pós-lactante. As análises histológicas destacaram que os ovários de D. cinerea possui características, estruturas e tipos celulares padrões...(AU)

Analysis of the reproductive stage and ovarian histomorphometry of Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in an Atlantic Forest fragment of Pernambuco, northeastern Brazil / Análise do estágio reprodutivo e histomorfometria ovariana de Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) em um fragmento de Mata Atlântica de Pernambuco, Nordeste do Brasil

This study aimed to analyze the reproductive stage, histology and morphometry of the ovary of Dermanura cinerea in an Atlantic Forest fragments in the Biological Reserve of Saltinho, Pernambuco, Brazil. Adult females were captured monthly by mist net, during two consecutive nights from June/2014 to November/2015. The meteorological data were provided by the National Institute of Meteorology and grouped together with the reproductive data, in six periods: period I (June to August/2014), period II (September to November/2014), period III (December/2014 to February/2015), period IV (March to May/2015), period V (June to August/2015) and period VI (September to November/2015). The females were classified according to their reproductive stages in: Inactive, pregnant, lactating and postlactating. Among the 25 females caught, 10 inactive females were selected for the histomorphometric analysis of the ovaries and then they were euthanized. After that, the specimens had their ovaries removed, fixed, processed and included in Paraplast. The organs were cut and stained by Hematoxylin - Eosin and the histological slides produced were submitted to the appropriate optical microscope analysis. Each type of ovarian follicle was estimated according to the histological characteristics evidenced for other mammals. In the morphometric analysis, it was considered: The area of the ovary (measured in square millimeter), Quantification of different types of ovarian follicles (unilaminar and multilaminar primary follicles, antral and matures) and corpus luteum, as well as the area of each by those different follicles (measured in square micrometer) The results indicated that 16 females were inactive, 5 were lactating, 4 were pregnant and no post-lactating. The histological analysis revealed that the ovaries of D. cinerea exhibit characteristics, structures and cellular types similar to other mammals. The morphometric data of the study area were statistically evaluated using the Student's t-test. Therefore, ovarian histomorphometric analysis are very important to infer with greater certainty about the reproduction of a species. Thus, it was observed that females of D. cinerea exhibit two reproductive peaks, that is, they can give birth either at the end of dry periods or from the beginning to the middle of the rainy season. The main feature observed in the ovary of this species, found in the Atlantic Forest area of the state of Pernambuco, is the preparation of the ovarian cortex to ovulate in months of high rainfall throughout the year. Therefore, this species tries to adjust its reproductive period with the variations of the environmental conditions, so that the reproduction might occur during the period more favorable for the maintenance of their offspring.(AU)

Esse estudo objetivou analisar o estágio reprodutivo, histologia e morfometria do ovário de Dermanura cinerea em um fragmento de Mata Atlântica da Reserva Biológica de Saltinho (Pernambuco, Brasil). Foram utilizadas fêmeas adultas capturadas por redes de neblina, de modo que as coletas ocorreram mensalmente, durante duas noites consecutivas de Junho/2014 a Novembro/2015. Os dados meteorológicos foram fornecidos pelo Instituto Nacional de Meteorologia e agrupados, juntamente com os dados reprodutivos, em seis períodos, sendo estes: período I (Junho a agosto/2014), período II (Setembro a novembro/2014), período III (Dezembro/2014 a fevereiro/2015) período IV (Março a maio/2015), período V (Junho a agosto/2015) e período VI (Setembro a novembro/2015). As fêmeas foram classificadas, de acordo com o estágio reprodutivo em: inativas, grávidas, lactantes e pós-lactantes. Das 25 fêmeas capturadas, foram selecionadas, para as análises histomorfométricas dos ovários, 10 fêmeas inativas, as quais foram eutanasiadas. Depois disso, os espécimes tiveram os seus ovários removidos, fixados, processados e inclusos em paraplast. Os cortes foram corados por Hematoxilina - Eosina e as lâminas histológicas produzidas foram submetidas às devidas análises em microscópio óptico. Cada tipo de folículo ovariano foi estimado de acordo com as características histológicas evidenciadas para outros mamíferos. Nas análises morfométricas, considerou-se: a área do ovário (mensurada em milímetro quadrado), quantificação dos diferentes tipos de folículos ovarianos (primários unilaminar e multilaminar, antrais e maduros) e corpo lúteo, bem como foi medida a área de cada um desses diferentes tipos de folículos (mensurada em micrômetro quadrado). Os resultados indicaram a presença de 16 fêmeas inativas, 5 lactantes, 4 grávidas e nenhuma pós-lactante. As análises histológicas destacaram que os ovários de D. cinerea possui características, estruturas e tipos celulares padrões semelhantes ao dos demais mamíferos. Os dados morfométricos da área do ovário foram avaliados estatisticamente por meio do teste t de Student. Assim, as análises histomorfométricas ovariana são de suma importância para inferir com maior segurança sobre a reprodução de uma dada espécie. Portanto, ficou constatado que as fêmeas de D. cinerea apresentam dois picos reprodutivos, isto é, podem parir no final de períodos secos ou do início para metade do período chuvoso. A principal característica observada no ovário dessa espécie, encontrada em área de Mata Atlântica do estado de Pernambuco, foi a preparação do córtex ovariano para ovular em meses de elevados índices pluviométricos ao longo do ano. Logo, essa espécie procura ajustar seu período reprodutivo com as variações das condições ambientais, de forma que a reprodução ocorra em períodos mais favoráveis para manutenção da prole.(AU)

Analysis of the reproductive stage and ovarian histomorphometry of Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in an Atlantic Forest fragment of Pernambuco, northeastern Brazil

ABSTRACT: This study aimed to analyze the reproductive stage, histology and morphometry of the ovary of Dermanura cinerea in an Atlantic Forest fragments in the Biological Reserve of Saltinho, Pernambuco, Brazil. Adult females were captured monthly by mist net, during two consecutive nights from June/2014 to November/2015. The meteorological data were provided by the National Institute of Meteorology and grouped together with the reproductive data, in six periods: period I (June to August/2014), period II (September to November/2014), period III (December/2014 to February/2015), period IV (March to May/2015), period V (June to August/2015) and period VI (September to November/2015). The females were classified according to their reproductive stages in: Inactive, pregnant, lactating and postlactating. Among the 25 females caught, 10 inactive females were selected for the histomorphometric analysis of the ovaries and then they were euthanized. After that, the specimens had their ovaries removed, fixed, processed and included in Paraplast. The organs were cut and stained by Hematoxylin - Eosin and the histological slides produced were submitted to the appropriate optical microscope analysis. Each type of ovarian follicle was estimated according to the histological characteristics evidenced for other mammals. In the morphometric analysis, it was considered: The area of the ovary (measured in square millimeter), Quantification of different types of ovarian follicles (unilaminar and multilaminar primary follicles, antral and matures) and corpus luteum, as well as the area of each by those different follicles (measured in square micrometer) The results indicated that 16 females were inactive, 5 were lactating, 4 were pregnant and no post-lactating. The histological analysis revealed that the ovaries of D. cinerea exhibit characteristics, structures and cellular types similar to other mammals. The morphometric data of the study area were statistically evaluated using the Students t-test. Therefore, ovarian histomorphometric analysis are very important to infer with greater certainty about the reproduction of a species. Thus, it was observed that females of D. cinerea exhibit two reproductive peaks, that is, they can give birth either at the end of dry periods or from the beginning to the middle of the rainy season. The main feature observed in the ovary of this species, found in the Atlantic Forest area of the state of Pernambuco, is the preparation of the ovarian cortex to ovulate in months of high rainfall throughout the year. Therefore, this species tries to adjust its reproductive period with the variations of the environmental conditions, so that the reproduction might occur during the period more favorable for the maintenance of their offspring.

RESUMO: Esse estudo objetivou analisar o estágio reprodutivo, histologia e morfometria do ovário de Dermanura cinerea em um fragmento de Mata Atlântica da Reserva Biológica de Saltinho (Pernambuco, Brasil). Foram utilizadas fêmeas adultas capturadas por redes de neblina, de modo que as coletas ocorreram mensalmente, durante duas noites consecutivas de Junho/2014 a Novembro/2015. Os dados meteorológicos foram fornecidos pelo Instituto Nacional de Meteorologia e agrupados, juntamente com os dados reprodutivos, em seis períodos, sendo estes: período I (Junho a agosto/2014), período II (Setembro a novembro/2014), período III (Dezembro/2014 a fevereiro/2015) período IV (Março a maio/2015), período V (Junho a agosto/2015) e período VI (Setembro a novembro/2015). As fêmeas foram classificadas, de acordo com o estágio reprodutivo em: inativas, grávidas, lactantes e pós-lactantes. Das 25 fêmeas capturadas, foram selecionadas, para as análises histomorfométricas dos ovários, 10 fêmeas inativas, as quais foram eutanasiadas. Depois disso, os espécimes tiveram os seus ovários removidos, fixados, processados e inclusos em paraplast. Os cortes foram corados por Hematoxilina - Eosina e as lâminas histológicas produzidas foram submetidas às devidas análises em microscópio óptico. Cada tipo de folículo ovariano foi estimado de acordo com as características histológicas evidenciadas para outros mamíferos. Nas análises morfométricas, considerou-se: a área do ovário (mensurada em milímetro quadrado), quantificação dos diferentes tipos de folículos ovarianos (primários unilaminar e multilaminar, antrais e maduros) e corpo lúteo, bem como foi medida a área de cada um desses diferentes tipos de folículos (mensurada em micrômetro quadrado). Os resultados indicaram a presença de 16 fêmeas inativas, 5 lactantes, 4 grávidas e nenhuma pós-lactante. As análises histológicas destacaram que os ovários de D. cinerea possui características, estruturas e tipos celulares padrões semelhantes ao dos demais mamíferos. Os dados morfométricos da área do ovário foram avaliados estatisticamente por meio do teste t de Student. Assim, as análises histomorfométricas ovariana são de suma importância para inferir com maior segurança sobre a reprodução de uma dada espécie. Portanto, ficou constatado que as fêmeas de D. cinerea apresentam dois picos reprodutivos, isto é, podem parir no final de períodos secos ou do início para metade do período chuvoso. A principal característica observada no ovário dessa espécie, encontrada em área de Mata Atlântica do estado de Pernambuco, foi a preparação do córtex ovariano para ovular em meses de elevados índices pluviométricos ao longo do ano. Logo, essa espécie procura ajustar seu período reprodutivo com as variações das condições ambientais, de forma que a reprodução ocorra em períodos mais favoráveis para manutenção da prole.

Estágio reprodutivo, histologia e morfometria sazonal do testículo de Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) em fragmento de Mata Atlântica no Litoral Sul de Pernambuco, Brasil / Reproductive stage, histology and seasonal morphometry of the testes of Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in Atlantic Forest fragment on the South Coast of Pernambuco, Brazil

This study analyzed the reproductive stage, histology and morphometry of the testes of Dermanura cinerea (Gervais, 1856) in Atlantic Forest fragment on the South Coast of Pernambuco. Specimens were captured by mist net, and collections occurred monthly over two consecutive nights for 18 months. The meteorological data were grouped in rainy and dry months. Eighteen adult specimens were used, which were classified in males with descendant testes and with testes no descendant. For the histological analysis, the testes were collected, fixed and processed following the routine histological technique. The slides obtained were stained by Hematoxylin-Eosin. In the morphometric analysis the area of occupation of the tubular and intertubular compartment were measured, the number of Leydig, Sertoli, spermatocytes and elongated spermatids were quantified. The morphometric data were submitted to statistical analysis. Dermanura cinerea presented higher sperm production activity in dry months and higher hormone production in rainy months. This information is also related to the reproductive pattern of the females and to the increase in rainfall indexes, since it is a determinant factor in the mediation of the food availability of the frugivorous species, such as D. cinerea in the Atlantic Forest area of Pernambuco.

Esse estudo analisou o estágio reprodutivo, a histologia e a morfometria dos testículos de Dermanura cinerea (Gervais, 1856) em fragmento de Mata Atlântica no Litoral Sul de Pernambuco. Os espécimes foram capturados por redes de neblina e as coletas ocorreram mensalmente, ao longo de duas noites consecutivas, durante 18 meses. Os dados meteorológicos foram agrupados em meses chuvosos e secos. Foram utilizados 18 espécimes adultos, os quais foram classificados em machos com testículos descendentes e não descendentes. Para as análises histológicas, os testículos foram coletados, fixados e processados seguindo a técnica histológica de rotina. As lâminas obtidas foram coradas por Hematoxilina-Eosina. Nas análises morfométricas foram mensuradas a área de ocupação do compartimento tubular e intertubular, quantificados o número de células de Leydig, de Sertoli, de espermatócitos e de espermátides alongadas. Os dados morfométricos foram submetidos às análises estatísticas. Dermanura cinerea apresentou maior atividade de produção espermática em meses secos e maior produção hormonal em meses chuvosos. Essas informações estão relacionadas também com o padrão reprodutivo das fêmeas e com a elevação nos índices pluviométricos, já que é um fator determinante na mediação da disponibilidade alimentar das espécies frugívoras, como D. cinerea em área de Mata Atlântica de Pernambuco.

Estágio reprodutivo, histologia e morfometria sazonal do testículo de Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) em fragmento de Mata Atlântica no Litoral Sul de Pernambuco, Brasil

ABSTRACT This study analyzed the reproductive stage, histology and morphometry of the testes of Dermanura cinerea (Gervais, 1856) in Atlantic Forest fragment on the South Coast of Pernambuco. Specimens were captured by mist net, and collections occurred monthly over two consecutive nights for 18 months. The meteorological data were grouped in rainy and dry months. Eighteen adult specimens were used, which were classified in males with descendant testes and with testes no descendant. For the histological analysis, the testes were collected, fixed and processed following the routine histological technique. The slides obtained were stained by Hematoxylin-Eosin. In the morphometric analysis the area of occupation of the tubular and intertubular compartment were measured, the number of Leydig, Sertoli, spermatocytes and elongated spermatids were quantified. The morphometric data were submitted to statistical analysis. Dermanura cinerea presented higher sperm production activity in dry months and higher hormone production in rainy months. This information is also related to the reproductive pattern of the females and to the increase in rainfall indexes, since it is a determinant factor in the mediation of the food availability of the frugivorous species, such as D. cinerea in the Atlantic Forest area of Pernambuco.

RESUMO Esse estudo analisou o estágio reprodutivo, a histologia e a morfometria dos testículos de Dermanura cinerea (Gervais, 1856) em fragmento de Mata Atlântica no Litoral Sul de Pernambuco. Os espécimes foram capturados por redes de neblina e as coletas ocorreram mensalmente, ao longo de duas noites consecutivas, durante 18 meses. Os dados meteorológicos foram agrupados em meses chuvosos e secos. Foram utilizados 18 espécimes adultos, os quais foram classificados em machos com testículos descendentes e não descendentes. Para as análises histológicas, os testículos foram coletados, fixados e processados seguindo a técnica histológica de rotina. As lâminas obtidas foram coradas por Hematoxilina-Eosina. Nas análises morfométricas foram mensuradas a área de ocupação do compartimento tubular e intertubular, quantificados o número de células de Leydig, de Sertoli, de espermatócitos e de espermátides alongadas. Os dados morfométricos foram submetidos às análises estatísticas. Dermanura cinerea apresentou maior atividade de produção espermática em meses secos e maior produção hormonal em meses chuvosos. Essas informações estão relacionadas também com o padrão reprodutivo das fêmeas e com a elevação nos índices pluviométricos, já que é um fator determinante na mediação da disponibilidade alimentar das espécies frugívoras, como D. cinerea em área de Mata Atlântica de Pernambuco.

Estágio reprodutivo, histologia e morfometria sazonal do testículo de Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) em fragmento de Mata Atlântica no Litoral Sul de Pernambuco, Brasil / Reproductive stage, histology and seasonal morphometry of the testes of Dermanura cinerea (Chiroptera: Phyllostomidae) in Atlantic Forest fragment on the South Coast of Pernambuco, Brazil

This study analyzed the reproductive stage, histology and morphometry of the testes of Dermanura cinerea (Gervais, 1856) in Atlantic Forest fragment on the South Coast of Pernambuco. Specimens were captured by mist net, and collections occurred monthly over two consecutive nights for 18 months. The meteorological data were grouped in rainy and dry months. Eighteen adult specimens were used, which were classified in males with descendant testes and with testes no descendant. For the histological analysis, the testes were collected, fixed and processed following the routine histological technique. The slides obtained were stained by Hematoxylin-Eosin. In the morphometric analysis the area of occupation of the tubular and intertubular compartment were measured, the number of Leydig, Sertoli, spermatocytes and elongated spermatids were quantified. The morphometric data were submitted to statistical analysis. Dermanura cinerea presented higher sperm production activity in dry months and higher hormone production in rainy months. This information is also related to the reproductive pattern of the females and to the increase in rainfall indexes, since it is a determinant factor in the mediation of the food availability of the frugivorous species, such as D. cinerea in the Atlantic Forest area of Pernambuco.(AU)

Esse estudo analisou o estágio reprodutivo, a histologia e a morfometria dos testículos de Dermanura cinerea (Gervais, 1856) em fragmento de Mata Atlântica no Litoral Sul de Pernambuco. Os espécimes foram capturados por redes de neblina e as coletas ocorreram mensalmente, ao longo de duas noites consecutivas, durante 18 meses. Os dados meteorológicos foram agrupados em meses chuvosos e secos. Foram utilizados 18 espécimes adultos, os quais foram classificados em machos com testículos descendentes e não descendentes. Para as análises histológicas, os testículos foram coletados, fixados e processados seguindo a técnica histológica de rotina. As lâminas obtidas foram coradas por Hematoxilina-Eosina. Nas análises morfométricas foram mensuradas a área de ocupação do compartimento tubular e intertubular, quantificados o número de células de Leydig, de Sertoli, de espermatócitos e de espermátides alongadas. Os dados morfométricos foram submetidos às análises estatísticas. Dermanura cinerea apresentou maior atividade de produção espermática em meses secos e maior produção hormonal em meses chuvosos. Essas informações estão relacionadas também com o padrão reprodutivo das fêmeas e com a elevação nos índices pluviométricos, já que é um fator determinante na mediação da disponibilidade alimentar das espécies frugívoras, como D. cinerea em área de Mata Atlântica de Pernambuco.(AU)

Hepatic toxicity caused by PLGA-microspheres containing usnic acid from the lichen C ladonia substellata (AHTI) during pregnancy in Wistar rats

ABSTRACT This study aimed to evaluate the teratogenic and hepatotoxic potential of the usnic acid encapsulated into PLGA-microspheres. In total, 12 female Wistar rats in pregnancy were randomly distributed in the control group (n= 6) that received 1.0 mL of physiological solution and treatment group (n= 6) that received 25 mg/kg of encapsulated usnic acid by oral administration. All females were euthanized at day 20 of pregnancy and their fetuses were removed and analyzed. During the pregnancy was observed a reduction in weight gain. There was no difference in serum transaminases levels analyzed as well as any difference in liver weight in both groups. The histomorphometric analysis of the liver from the treatment group revealed an increase in number of hepatocytes and a decrease in nuclear area of these cells. Moreover, no alteration was observed in cell area of hepatocytes or number of Kupffer cells. The fetuses had an increase in total number of hepatocytes and a reduction in the amount of megakaryocytes. These results show the hepatotoxic potential of usnic acid during pregnancy. However, its toxicity can be minimized by encapsulation in microspheres.

Análise histomorfométrica dos cardiomiócitos e deposição de colágeno no músculo cardíaco de ratas ooforectomizadas / Histomorphometric analysis of cardiomyocytes and collagen deposition in the heart muscle of ovariectomized rats

Esse estudo objetivou avaliar o efeito da ooforectomia sob os parâmetros histomorfométricos dos cardiomiócitos e quantificação de colágeno em ratas Wistar. Vinte ratas foram utilizadas e separadas em dois grupos: GI - ooforectomizada e GII - sham-ooforectomizada. Após a recuperação anestésica os animais foram acomodados em gaiolas e separados nas condições de ciclo claro/escuro 12/12h por um período de 6 meses. Passado o período experimental, os animais foram anestesiados, o coração retirado e mergulhado em formaldeído a 10%. Os fragmentos dos ventrículos foram submetidos ao processamento histológico e corados com hematoxilina e eosina. As análises histomorfométricas (área celular e área e volume nuclear) foram realizadas pelo microscópio de luz e software ImageJ versão 1.44. Os dados foram submetidos à análise ANOVA e quando significantes, complementados pelo teste t de student (p<0,001). Observou-se uma diminuição significativa das áreas celular e nuclear dos cardiomiócitos do grupo GI quando comparado ao grupo GII, bem como a área ocupada, pelo colágeno, no músculo cardíaco foi maior em GI, quando comparado a GII. Diante disso, conclui-se que as alterações observadas nos cardiomiócitos do grupo GI, sugerem uma maior atividade apoptótica nesse grupo, devido à diminuição dos níveis séricos do estrógeno provocado pela ooforectomia e o aumento da área ocupada pelo colágeno, no grupo ooforectomizado, está associada ao efeito cardioprotetor do estrógeno.(AU)

This study aimed to evaluate the effect of oophorectomy on the morphometric variables of cardiomyocytes and quantification collagen in Wistar rats. Twenty rats were used and divided into two groups: GI - ovariectomized and GII - sham-ovariectomized. After recovery from anesthesia the animals were housed in separate cages and under the conditions of light / dark cycle 12/12h for a period of six months. After the experimental period, the animals were anesthetized, the heart removed and immersed in 10% formaldehyde. The fragments of the ventricles were subjected to histological analysis and stained with hematoxylin and eosin. Histomorphometric analysis (cell area and nuclear area and volume) were performed by light microscopy and ImageJ software version 1.44. The data were submitted to ANOVA and when significant, complemented by Student's t test (p<0.001). There was a significant decrease in cellular and nuclear areas of the GI cardiomyocytes compared to GII and the area occupied by collagen was greater in cardiac muscle GI, when compared to GII. Therefore, it is concluded that the changes observed in the GI group cardiomyocytes, suggest a higher apoptotic activity in this group, due to decreased serum estrogen levels caused by ovariectomy and increased area occupied by collagen in oophorectomized group is associated the cardioprotective effect of estrogen.(AU)

Análise histomorfométrica dos cardiomiócitos e deposição de colágeno no músculo cardíaco de ratas ooforectomizadas / Histomorphometric analysis of cardiomyocytes and collagen deposition in the heart muscle of ovariectomized rats

Esse estudo objetivou avaliar o efeito da ooforectomia sob os parâmetros histomorfométricos dos cardiomiócitos e quantificação de colágeno em ratas Wistar. Vinte ratas foram utilizadas e separadas em dois grupos: GI - ooforectomizada e GII - sham-ooforectomizada. Após a recuperação anestésica os animais foram acomodados em gaiolas e separados nas condições de ciclo claro/escuro 12/12h por um período de 6 meses. Passado o período experimental, os animais foram anestesiados, o coração retirado e mergulhado em formaldeído a 10%. Os fragmentos dos ventrículos foram submetidos ao processamento histológico e corados com hematoxilina e eosina. As análises histomorfométricas (área celular e área e volume nuclear) foram realizadas pelo microscópio de luz e software ImageJ versão 1.44. Os dados foram submetidos à análise ANOVA e quando significantes, complementados pelo teste t de student (p<0,001). Observou-se uma diminuição significativa das áreas celular e nuclear dos cardiomiócitos do grupo GI quando comparado ao grupo GII, bem como a área ocupada, pelo colágeno, no músculo cardíaco foi maior em GI, quando comparado a GII. Diante disso, conclui-se que as alterações observadas nos cardiomiócitos do grupo GI, sugerem uma maior atividade apoptótica nesse grupo, devido à diminuição dos níveis séricos do estrógeno provocado pela ooforectomia e o aumento da área ocupada pelo colágeno, no grupo ooforectomizado, está associada ao efeito cardioprotetor do estrógeno.

This study aimed to evaluate the effect of oophorectomy on the morphometric variables of cardiomyocytes and quantification collagen in Wistar rats. Twenty rats were used and divided into two groups: GI - ovariectomized and GII - sham-ovariectomized. After recovery from anesthesia the animals were housed in separate cages and under the conditions of light / dark cycle 12/12h for a period of six months. After the experimental period, the animals were anesthetized, the heart removed and immersed in 10% formaldehyde. The fragments of the ventricles were subjected to histological analysis and stained with hematoxylin and eosin. Histomorphometric analysis (cell area and nuclear area and volume) were performed by light microscopy and ImageJ software version 1.44. The data were submitted to ANOVA and when significant, complemented by Student's t test (p<0.001). There was a significant decrease in cellular and nuclear areas of the GI cardiomyocytes compared to GII and the area occupied by collagen was greater in cardiac muscle GI, when compared to GII. Therefore, it is concluded that the changes observed in the GI group cardiomyocytes, suggest a higher apoptotic activity in this group, due to decreased serum estrogen levels caused by ovariectomy and increased area occupied by collagen in oophorectomized group is associated the cardioprotective effect of estrogen.