Genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Minas Gerais, Brazil / Diversidade genética e susceptibilidade a antimicrobianos em Staphylococcus aureus isoladas de mastite bovina em Minas Gerais, Brasil

ABSTRACT: This study evaluated the genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolates from dairy cows in Minas Gerais, Brazil. Thirty-seven isolates from five municipalities (8 herds) were genotyped using multi-locus sequence typing (MLST) and susceptibility to 12 antimicrobial agents was tested using the disk diffusion method. High resistance rates for penicillin [75.68% (28/37)], ampicillin [70.27% (26/37)], and tetracycline [70.27% (26/37)] were detected. Multidrug resistance was observed in seven [18.92% (7/37)] isolates, and two were suggestive of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Among the 37 isolates, 33 novel sequence types (ST) and two known STs (ST126 and ST746) were identified in MLST. The clonal complexes more frequently observed were: CC97 [78.38%; (29/37)], CC1 [8.11%; (3/37)] and CC5 [5.40%; (2/37)]. Minimum‐spanning tree (MST) analysis according to data from municipalities, herds, and resistance patterns for all isolates did not show any clustering pattern. However, the MST comparing all Brazilian S. aureus isolates deposited in the PubMLST database and from this study depicted an association between the genotype and strain origin (clinical sample). Isolates from this study that belong to CC97 were close to database isolates from milk and dairy products, while those that belong to CC1 and CC5 were close to database isolates from human sources and the environment of dairy farms or industries. In conclusion, our results showed a high rate of resistance to penicillins and tetracyclines and great genetic diversity among the S. aureus isolates from bovine mastitis genotyped in the present study.

RESUMO: Este estudo teve como objetivo avaliar a diversidade genética e a suscetibilidade a antimicrobianos de cepas de Staphylococcus aureus isoladas de vacas leiteiras em Minas Gerais, Brasil. Trinta e sete cepas provenientes de cinco municípios (oito rebanhos) foram genotipadas usando a técnica multi-locus sequence typing (MLST) e a suscetibilidade a 12 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em disco. Foram detectadas altas taxas de resistência para penicilina [75,68% (28/37)], ampicilina [70,27% (26/37)] e tetraciclina [70,27% (26/37)] entre os isolados. A multirresistência foi observada em sete [18,92% (7/37)] isolados e dois foram classificados como sugestivos de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Entre os 37 isolados, 33 novos sequence types (ST) e dois STs conhecidos (ST126 e ST746) foram identificados pelo MLST. Os complexos clonais mais frequentemente observados foram: CC97 [78,38%; (29/37)], CC1 [8,11%; (3/37)] e CC5 [5,40%; (2/37)]. Foi construída uma minimum‐spanning tree (MSTs) com todos isolados estudados e esta não mostrou padrão de agrupamento quando comparada com dados epidemiológicos como municípios e rebanho, do qual foi isolado, e perfis de resistência a antimicrobianos. Uma segunda MST foi construída comparando os isolados deste estudo e todas as cepas de S. aureus depositadas no banco de dados PubMLST provenientes do Brasil, que mostrou associação entre o genótipo, STs e a origem da cepa. Foi possível observar entre os isolados do estudo que, aqueles que pertenciam ao CC97, eram geneticamente mais próximos das cepas depositadas no PubMLST isoladas de leite e de produtos lácteos, enquanto aqueles que pertenciam aos CC1 e CC5 estavam mais próximos a cepas isoladas de humanos ou do ambiente de fazendas e indústrias de laticínios. Em conclusão, nossos resultados mostraram um alto índice de resistência às penicilinas e tetraciclinas e grande diversidade genética entre as cepas de S. aureus isoladas de casos de mastite bovina.

Genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Minas Gerais, Brazil / Diversidade genética e susceptibilidade a antimicrobianos em Staphylococcus aureus isoladas de mastite bovina em Minas Gerais, Brasil

This study evaluated the genetic diversity and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolates from dairy cows in Minas Gerais, Brazil. Thirty-seven isolates from five municipalities (8 herds) were genotyped using multi-locus sequence typing (MLST) and susceptibility to 12 antimicrobial agents was tested using the disk diffusion method. High resistance rates for penicillin [75.68% (28/37)], ampicillin [70.27% (26/37)], and tetracycline [70.27% (26/37)] were detected. Multidrug resistance was observed in seven [18.92% (7/37)] isolates, and two were suggestive of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Among the 37 isolates, 33 novel sequence types (ST) and two known STs (ST126 and ST746) were identified in MLST. The clonal complexes more frequently observed were: CC97 [78.38%; (29/37)], CC1 [8.11%; (3/37)] and CC5 [5.40%; (2/37)]. Minimum­spanning tree (MST) analysis according to data from municipalities, herds, and resistance patterns for all isolates did not show any clustering pattern. However, the MST comparing all Brazilian S. aureus isolates deposited in the PubMLST database and from this study depicted an association between the genotype and strain origin (clinical sample). Isolates from this study that belong to CC97 were close to database isolates from milk and dairy products, while those that belong to CC1 and CC5 were close to database isolates from human sources and the environment of dairy farms or industries. In conclusion, our results showed a high rate of resistance to penicillins and tetracyclines and great genetic diversity among the S. aureus isolates from bovine mastitis genotyped in the present study.

Este estudo teve como objetivo avaliar a diversidade genética e a suscetibilidade a antimicrobianos de cepas de Staphylococcus aureus isoladas de vacas leiteiras em Minas Gerais, Brasil. Trinta e sete cepas provenientes de cinco municípios (oito rebanhos) foram genotipadas usando a técnica multi-locus sequence typing (MLST) e a suscetibilidade a 12 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em disco. Foram detectadas altas taxas de resistência para penicilina [75,68% (28/37)], ampicilina [70,27% (26/37)] e tetraciclina [70,27% (26/37)] entre os isolados. A multirresistência foi observada em sete [18,92% (7/37)] isolados e dois foram classificados como sugestivos de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Entre os 37 isolados, 33 novos sequence types (ST) e dois STs conhecidos (ST126 e ST746) foram identificados pelo MLST. Os complexos clonais mais frequentemente observados foram: CC97 [78,38%; (29/37)], CC1 [8,11%; (3/37)] e CC5 [5,40%; (2/37)]. Foi construída uma minimum­spanning tree (MSTs) com todos isolados estudados e esta não mostrou padrão de agrupamento quando comparada com dados epidemiológicos como municípios e rebanho, do qual foi isolado, e perfis de resistência a antimicrobianos. Uma segunda MST foi construída comparando os isolados deste estudo e todas as cepas de S. aureus depositadas no banco de dados PubMLST provenientes do Brasil, que mostrou associação entre o genótipo, STs e a origem da cepa. Foi possível observar entre os isolados do estudo que, aqueles que pertenciam ao CC97, eram geneticamente mais próximos das cepas depositadas no PubMLST isoladas de leite e de produtos lácteos, enquanto aqueles que pertenciam aos CC1 e CC5 estavam mais próximos a cepas isoladas de humanos ou do ambiente de fazendas e indústrias de laticínios. Em conclusão, nossos resultados mostraram um alto índice de resistência às penicilinas e tetraciclinas e grande diversidade genética entre as cepas de S. aureus isoladas de casos de mastite bovina.

Quality and safety of milk and dairy products / ptos

Milk quality is defined on the basis of its composition and hygiene. The somatic cell count (SCC) is the main indicator of milk quality and the limit of 400,000 cells per milliliter of milk is adopted in the international market. The SCC indicates the mastitis situation in herds, making control of this disease a major challenge for producers. High somatic cell and bacteria counts in raw milk adversely affect cheese yield and the quality, shelf life and sensory characteristics of processed milk and dairy products. Food pathogens can be found in raw milk, and in processed milk and dairy products as a result of post-processing contamination. The presence of chemical residues, notably antibiotics, may affect the manufacture of fermented products and the health of consumers. Prudent use of these drugs is an issue for dairy farmers. It is recommended, therefore, the adoption of good dairy practice programs, both in primary production and in processing plants. Consumers are aware of all these aspects. Ignoring these facts could jeopardize the sectors survival.

A qualidade do leite é definida com base na sua composição e higiene. A contagem de células somáticas (CCS) é o principal indicador de qualidade e o limite usado no mercado internacional é de 400.000 células por mililitro de leite. A CCS indica a situação de mastite nos rebanhos. O controle dessa doença é um dos maiores desafios para os produtores de leite. Alta CCS e alta contagem de bactérias no leite cru interferem com o rendimento de queijos e a qualidade, a vida de prateleira e as características sensoriais do leite e seus derivados. Patógenos alimentares podem contaminar o leite cru e até o leite industrializado, como consequência da contaminação durante e após o processamento. A presença de resíduos de substâncias químics, notadamente os antimicrobianos, pode afetar a manufatura de produtos fermentados e a saúde dos consumidores. Isso torna imperativo o uso prudente dessas drogas pelos produtores de leite. É importante, portanto, a adoção de programas de boas práticas, tanto na produção primária quanto na indústria. Os consumidores estão atentos para todos esses aspectos. Ignorar esses fatos pode colocar em risco a sobrevivência do setor.

Quality and safety of milk and dairy products / ptos

Milk quality is defined on the basis of its composition and hygiene. The somatic cell count (SCC) is the main indicator of milk quality and the limit of 400,000 cells per milliliter of milk is adopted in the international market. The SCC indicates the mastitis situation in herds, making control of this disease a major challenge for producers. High somatic cell and bacteria counts in raw milk adversely affect cheese yield and the quality, shelf life and sensory characteristics of processed milk and dairy products. Food pathogens can be found in raw milk, and in processed milk and dairy products as a result of post-processing contamination. The presence of chemical residues, notably antibiotics, may affect the manufacture of fermented products and the health of consumers. Prudent use of these drugs is an issue for dairy farmers. It is recommended, therefore, the adoption of good dairy practice programs, both in primary production and in processing plants. Consumers are aware of all these aspects. Ignoring these facts could jeopardize the sectors survival.(AU)

A qualidade do leite é definida com base na sua composição e higiene. A contagem de células somáticas (CCS) é o principal indicador de qualidade e o limite usado no mercado internacional é de 400.000 células por mililitro de leite. A CCS indica a situação de mastite nos rebanhos. O controle dessa doença é um dos maiores desafios para os produtores de leite. Alta CCS e alta contagem de bactérias no leite cru interferem com o rendimento de queijos e a qualidade, a vida de prateleira e as características sensoriais do leite e seus derivados. Patógenos alimentares podem contaminar o leite cru e até o leite industrializado, como consequência da contaminação durante e após o processamento. A presença de resíduos de substâncias químics, notadamente os antimicrobianos, pode afetar a manufatura de produtos fermentados e a saúde dos consumidores. Isso torna imperativo o uso prudente dessas drogas pelos produtores de leite. É importante, portanto, a adoção de programas de boas práticas, tanto na produção primária quanto na indústria. Os consumidores estão atentos para todos esses aspectos. Ignorar esses fatos pode colocar em risco a sobrevivência do setor.(AU)

Contagem bacteriana da superfície de tetas de vacas submetidas a diferentes processos de higienizaçäo, incluindo a ordenha manual com participaçäo do bezerro para estimular a descida do leite / Bacterial counts on the surface of the teats of cows milked and different methods of udder preparation, including cows milked by hand and stimulated by suckling a calf

A pele da teta é uma das principais fontes de contaminaçäo microbiana do leite cru, além de ser uma fonte de infecçäo da glândula mamária. Este estudo comparou diferentes métodos de preparaçäo do úbere, incluindo a participaçäo do bezerro para estimular a descida do leite, em relaçäo à contaminaçäo microbiana da pele da teta. Um experimento com 36 vacas ordenhadas mecanicamente foi conduzido para comparar três procedimentos (A, B, C) de preparaçäo do úbere. Duas tetas de cada vaca foram amostradas para contagem total de bactérias (CTB) e de coliformes, antes e após lavagem com água e secagem com papel toalha descartável (A); procedimento A, mais imersäo das tetas em soluçäo de iodo (4.000ppm) e secagem com papel toalha descartável (B); higienizaçäo com toalha de papel embebida em soluçäo desinfetante contendo clorexidina (C). O segundo experimento incluiu 16 vacas ordenhadas manualmente, na presença do bezerro. Permitiu-se a cada bezerro mamar as quatro tetas por alguns segundos, de acordo com o manejo do rebanho. Amostras para bacteriologia de duas tetas de cada vaca foram coletadas, antes, após a mamada do bezerro, e após higienizaçäo semelhante ao procedimento C, citado acima. Os tratamentos foram analisados usando-se o teste näo-paramétrico de Kruskal-Wallis, considerando-se os dados de tCTB após o uso de um dos métodos de preparaçäo do úbere ou da mamada do bezerro. Usou-se a transformaçäo das contagens bacterianas para a escala logarítmica em base 10, com a fórmula tCTB=log10 (CTB+0,5). Para os grupos A,B e C (primeiro experimento), Os valores médios de diminuiçäo de tCTB foram 1,8, 2,2 e 2,4, respectivamente. No segundo experimento, as CTB's aumentaram significativamente (p<0,05) de 3,2 para 4,3 após a mamada do bezerro, mas houve uma reduçäo (P<0,01) de mais de dez vezes após a aplicaçäo do desinfetante (2,0). Os resultados indicaram que: (a) lavagem das tetas com água seguida de secagem com papel toalha reduz o número de microrganismos da superfície das tetas, mas a reduçäo é muito maior quando se emprega um desinfetante; (b) a mamada do bezerro antes da ordenha aumenta em mais de dez vezes o número de bactérias na superfície das tetas; (c) o número de bactérias na pele das tetas pode ser reduzido em mais de 90 por cento após a mamada do bezerro, se as tetas forem cuidadosamente desinfetadas. Nas condiçöes dos experimentos realizados, a presença de coliformes foi insignificante.

Sensibilidade e especificidade do "California Mastitis Test" como recurso diagnóstico da mastite subclínica em relação à contagem de células somáticas / Sensitivity and specificity of the California Mastitis Test as a diagnostic tool for subclinical mastitis in quarter somatic cell count estimation

O "California Mastitis Test" (CMT) estima o conteúdo de células somáticas no leite e é interpretado subjetivamente, estabelecendo-se escores que, na maioria dos casos, variam de 1 a 5. O escore 1 indica uma reação completamente negativa e os de 2-5 indicam graus crescentes de resposta inflamatória do úbere, sendo normalmente considerados como indicativos de mastite subclínica. Dependendo da interpretação dos escores, o CMT pode produzir resultados falso-positivos ou falso-negativos. Esse trabalho teve o objetivo de avaliar a sensibilidade e a especificidade do CMT em relação à contagem de células somáticas (CCS). Foram utilizadas 3.012 amostras de leite provenientes de 760 vacas Holandesas ou mestiças Holandês-Zebu, pertencentes a 15 rebanhos. Todas as amostras foram submetidas ao CMT e processadas para CCS em equipamento Fossomatic 90. Os valores médios de CCS (x 1.000 células/ml) obtidos para os escores de CMT foram 1 (79,9), 2 (333,5), 3 (670,3), 4 (1.354,0) e 5 (4.455,6). Três opções de interpretação (doente/não-doente) para o CMT foram testadas, em relação aos valores de CCS, iniciando com 100.000 células/ml: (a) 1 versus 2, 3, 4, e 5; (b) 1 e 2 versus 3, 4 e 5; (c) 1, 2, 3 versus 4 e 5. As sensibilidades do CMT em identificar corretamente quartos mamários acima de 200.000 células/ml foram 79%, 61% e 34%, para as opções a, b e c, respectivamente. Para identificar corretamente contagens acima de 500.000 células/ml, as sensibilidades do CMT, para as opções a, b e c, foram, respectivamente: 93%, 82% e 54%. A sensibilidade do CMT em identificar quartos mamários com mastite subclínica foi adequada (acima de 80%) quando a interpretação do teste foi mais rigorosa (opções a e b). A interpretação da reação 3 como negativa (opção c) só alcançou sensibilidade de 80% para contagens entre 1.200.000 e 1.400.000 células/ml. As especificidades do CMT, para CCS de 200.000 e 500.000 foram, respectivamente, 90% e 80% (opção a), 97% e 90% (opção b) e 99% e 97% (opção c)

Detecção de soroalbuminas e imunoglobulinas no leite bovino como indicadores de mastite subclínica / Evaluation of serum albumin and immunoglobulins in bovine milk as an indicator of subclinical mastitis

Com o objetivo de verificar a utilidade da detecção de soroalbumina (BSA) e imunoglobulinas (Ig) no leite como diagnóstico da mastite subclínica, avaliou-se a relação entre a concentração dessas proteínas, o exame microbiológico e o teste "California Mastitis Test" (CMT). Amostras de leite de 172 quartos mamários previamente examinadas pelo CMT foram colhidas e levadas imediatamente ao laboratório para exames bacteriológicos. Uma alíquota de cada amostra foi congelada a -20°C e posteriomente testada para a presença de BSA e Ig, por meio da técnica de imunodifusão radial simples. Das amostras testadas, 111 apresentaram níveis fisiológicos de BSA (< 0,2mg/ml) e de Ig (< 0,5 mg/ml), 22 apresentaram níveis elevados de ambas proteínas e 39 apresentaram níveis elevados de Ig, mas níveis fisiológicos de BSA. Concentrações de BSA e Ig acima dos limites fisiológicos foram observadas mais frequentemente em amostras onde o CMT apresentou reação de maior severidade (+++) e naquelas onde foram isoladas Streptococcus spp. e Staphylococcus aureus. Entre as 88 amostras positivas no exame bacteriológico, níveis de BSA e Ig acima do limite fisiológico foram observados em 10 e 35, respectivamente. Em amostras onde não se isolou bactérias (84 das 172 examinadas), níveis fisiológicos de BSA e Ig foram observados em 72 e 58 delas, respectivamente. A detecção de BSA e Ig nas amostras de leite forneceu informações adicionais sobre o grau de lesão tecidual, mas não pode ser considerada como um indicador sensível para detecção precoce da reação inflamatória.

This work aimed to evaluate the feasibility of milk serum albumin (BSA) and immunoglobulin (Ig) detection for the diagnosis of subclinical mastitis. Bacteriological examinations and concentrations of BSA and Ig were determined in 172 milk samples. The samples were also examined by the California Mastitis Test (CMT). Immediately after collection, the samples were taken to the laboratory and bacteriologically examined. An aliquot of each sample was kept at -20°C and later, concentrations of BSA and Ig were determined by radial immunodiffusion. A total of 111 milk samples had physiological levels of BSA (< 0.2 mg/ml) and Ig (< 0.5mg/ml). Twenty-two samples had higher levels of both proteins and 39 samples had higher levels of Ig and physiological levels of BSA. Concentrations of BSA and Ig above the physiological levels were more frequently observed in quarters samples with severo (+++) CMT reaction and udder infection caused by Streptococcus spp and Staphylococcus aureus. In bacteriologically positive quarters (88 out of 172), increased levels of BSA and Ig were found in 10 and 35 samples, respectively. In the bacteriologically negativo quartors (84 out of 172), physiological levels of BSA and Ig were found in 72 and 58 samples, respectively. Although BSA and Ig measurements in milk samples gave further information about udder tissue damage, they can not be used as a sensitive parameter to detect early inflammatory reaction.