Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex in animals: identification and antimicrobial resistance profile / Complexo Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii em animais: identificação e perfil de resistência antimicrobiana

Acinetobacter spp. is emerging as an important human and veterinary pathogen, mostly due to intrinsic and acquired resistance to antimicrobials. Despite its public health relevance, little is known about the prevalence, role of different Acinetobacter species and antimicrobial resistance profile of animal-origin isolates. Traditional phenotypic tests may fail to discriminate Acinetobacter species, therefore molecular analyses are often required as a complementary approach. The objectives of this study were to evaluate the occurrence of strains of the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (Acb) complex isolated from animal infections including urinary tract infections, otitis, piodermitis and pododermatitis, and its resistance profile against different antimicrobial classes, including carbapenems. All Gram-negative coccobacilli isolates were characterized by MALDI-TOF and multiplex PCR, and the disk diffusion test was used to investigate multi-drug resistance (MDR) and carbapenem resistance genes by PCR as preconized by the standard guidelines. MALDI-TOF technique identified 21 strains belonging to the Acb complex (10 A. pittii, 8 A. baumannii, 3 A. nosocomialis, 1 A. ursingii, and 1 A. venetianus). Multiplex PCR confirmed the results of MALDI-TOF for 20 strains. Eight strains (34.78%) were classified as MDR, being 50% (4/8) A. baumannii, 37.5% (3/8) A. pittii, and 12.5% (1/8) A. nosocomialis. None of the isolates presented phenotypic carbapenemase production. Considering the carbapenem resistance genes, 26.09% (6/23) of the isolates presented one or more carbapenemase genes. From these, 50% (3/6) presented only bla VIM, 33.33% (2/6) presented only blaIMP, and 16.67% (1/6) presented blaIMP e blaVIM, simultaneously. These genes were detected among A. pittii isolates mostly (66.67%, 4/6). This study provides further insights into the occurrence and resistance profile of Acinetobacter of animal origin.

Acinetobacter spp. está emergindo como um importante patógeno humano e veterinário, principalmente devido à resistência intrínseca e adquirida aos antimicrobianos. Apesar de sua relevância para a saúde pública, pouco se sabe sobre a prevalência, o papel das diferentes espécies de Acinetobacter e o perfil de resistência antimicrobiana de isolados de origem animal. Testes fenotípicos tradicionais podem falhar em discriminar espécies de Acinetobacter, portanto, análises moleculares são frequentemente necessárias como uma abordagem complementar. Os objetivos deste estudo foram avaliar a ocorrência de cepas do complexo Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii (Acb) isolados de infecções de animais, incluindo infecções do trato urinário, otite, piodermite e pododermatite, e seu perfil de resistência a diferentes classes de antimicrobianos, incluindo os carbapenêmicos. Todas as cepas cocobacilos Gram-negativas foram caracterizados por MALDI-TOF e PCR multiplex, e o teste de difusão em disco foi usado para investigar genes de resistência a múltiplas drogas (MDR) e resistência a carbapenêmicos por PCR conforme preconizado pelas diretrizes padrão. A técnica MALDI-TOF identificou 21 cepas pertencentes ao complexo Acb (10 A. pittii, 8 A. baumannii, 3 A. nosocomialis, 1 A. ursingii e 1 A. venetianus). Multiplex PCR confirmou os resultados de MALDI-TOF para 20 cepas. Oito cepas (34.78%) foram classificadas como MDR, sendo 50% (4/8) A. baumannii, 37.5% (3/8) A. pittii e 12.5% (1/8) A. nosocomialis. Nenhum dos isolados apresentou produção fenotípica de carbapenemases. Considerando os genes de resistência a carbapenemas, 26.09% (6/23) dos isolados apresentaram um ou mais genes de carbapenemases. Destes, 50% (3/6) apresentaram apenas bla VIM, 33.33% (2/6) apresentaram apenas bla IMP e 16.67% (1/6) apresentaram bla IMP e bla VIM, simultaneamente. Esses genes foram detectados principalmente entre os isolados de A. pittii (66.67%, 4/6). Este estudo fornece mais informações sobre a ocorrência e perfil de resistência de Acinetobacter de origem animal.

Expression of icaA and icaD genes in biofilm formation in Staphylococcus aureus isolates from bovine subclinical mastitis / Expressão dos genes icaA e icaD na formação de biofilme em isolados de Staphylococcus aureus de mastite subclínica bovina

Staphylococcus spp. plays a significant role in the etiology of bovine mastitis. Staphylococcus aureus is considered the most important species due to the high prevalence and the difficulty of in vivo treatment that is related to the expression of virulence factors and biofilm formation. This study aimed to detect the phenotypic expression of the biofilm formation in 20 S. aureus isolated from bovine mastitis and to evaluate the expression and regulation of genes involved in its production. MALDI-TOF and phenogenotypic identification assays were performed to characterize the isolates. The phenotypic biofilm production and the presence of icaA and icaD and bap genes were evaluated. The Agr system was typified (agr I, agr II, agr III and agr IV) and its regulator (agr RNAIII) was detected. Furtherly, Real-time PCR (qPCR) was performed at chosen times to quantify the expression of icaA, icaD and hld genes in three selected isolates. All 20 strains were biofilm producers and most presented icaA and icaD genes. Only one isolate presented the bap gene. The agr gene type II showed a prevalence of 70%. Transcriptional analysis revealed increased expression of ica genes at eight hours of growth. These results confirm that polysaccharides production mediated by the icaADBC operon genes is an essential mechanism to the biofilm formation and contributes to the early stages of bacterial growth.(AU)

Staphylococcus spp. desempenham um papel significativo na etiologia da mastite bovina. Staphylococcus aureus é considerada a espécie mais importante devido a alta prevalência e a dificuldade de tratamento in vivo que está relacionado à expressão dos fatores de virulência e formação de biofilme. Este estudo teve como objetivo detectar a expressão fenotípica da formação de biofilme em 20 cepas de S. aureus isoladas de mastite bovina e avaliar a expressão e regulação de genes envolvidos em sua produção. MALDI-TOF e ensaios de identificação fenogenotípica foram realizados para caracterizar os isolados. A produção fenotípica de biofilme e a presença dos genes icaA, icaD e bap foram avaliadas. O sistema Agr foi tipificado (agr I, agr II, agr III e agr IV) e seu regulador (agr RNAIII) foi detectado. Além disso, a PCR em tempo real (qPCR) foi realizada nos tempos determinados para quantificar a expressão dos genes icaA, icaD e hld em três isolados selecionados. Todas as 20 linhagens foram produtoras de biofilme e a maioria apresentava os genes icaA e icaD. Apenas um isolado apresentou o gene bap. O gene agr do tipo II mostrou uma prevalência de 70%. A análise transcricional revelou aumento da expressão de genes ica às oito horas de crescimento. Estes resultados confirmam que a produção de polissacarídeos mediada pelos genes do operon icaADBC é um mecanismo essencial para a formação do biofilme e contribui para os estágios iniciais do crescimento bacteriano.(AU)

Expression of icaA and icaD genes in biofilm formation in Staphylococcus aureus isolates from bovine subclinical mastitis

ABSTRACT: Staphylococcus spp. plays a significant role in the etiology of bovine mastitis. Staphylococcus aureus is considered the most important species due to the high prevalence and the difficulty of in vivo treatment that is related to the expression of virulence factors and biofilm formation. This study aimed to detect the phenotypic expression of the biofilm formation in 20 S. aureus isolated from bovine mastitis and to evaluate the expression and regulation of genes involved in its production. MALDI-TOF and phenogenotypic identification assays were performed to characterize the isolates. The phenotypic biofilm production and the presence of icaA and icaD and bap genes were evaluated. The Agr system was typified (agr I, agr II, agr III and agr IV) and its regulator (agr RNAIII) was detected. Furtherly, Real-time PCR (qPCR) was performed at chosen times to quantify the expression of icaA, icaD and hld genes in three selected isolates. All 20 strains were biofilm producers and most presented icaA and icaD genes. Only one isolate presented the bap gene. The agr gene type II showed a prevalence of 70%. Transcriptional analysis revealed increased expression of ica genes at eight hours of growth. These results confirm that polysaccharides production mediated by the icaADBC operon genes is an essential mechanism to the biofilm formation and contributes to the early stages of bacterial growth.

RESUMO: Staphylococcus spp. desempenham um papel significativo na etiologia da mastite bovina. Staphylococcus aureus é considerada a espécie mais importante devido a alta prevalência e a dificuldade de tratamento in vivo que está relacionado à expressão dos fatores de virulência e formação de biofilme. Este estudo teve como objetivo detectar a expressão fenotípica da formação de biofilme em 20 cepas de S. aureus isoladas de mastite bovina e avaliar a expressão e regulação de genes envolvidos em sua produção. MALDI-TOF e ensaios de identificação fenogenotípica foram realizados para caracterizar os isolados. A produção fenotípica de biofilme e a presença dos genes icaA, icaD e bap foram avaliadas. O sistema Agr foi tipificado (agr I, agr II, agr III e agr IV) e seu regulador (agr RNAIII) foi detectado. Além disso, a PCR em tempo real (qPCR) foi realizada nos tempos determinados para quantificar a expressão dos genes icaA, icaD e hld em três isolados selecionados. Todas as 20 linhagens foram produtoras de biofilme e a maioria apresentava os genes icaA e icaD. Apenas um isolado apresentou o gene bap. O gene agr do tipo II mostrou uma prevalência de 70%. A análise transcricional revelou aumento da expressão de genes ica às oito horas de crescimento. Estes resultados confirmam que a produção de polissacarídeos mediada pelos genes do operon icaADBC é um mecanismo essencial para a formação do biofilme e contribui para os estágios iniciais do crescimento bacteriano.

Expression of icaA and icaD genes in biofilm formation in Staphylococcus aureus isolates from bovine subclinical mastitis / Expressão dos genes icaA e icaD na formação de biofilme em isolados de Staphylococcus aureus de mastite subclínica bovina

Staphylococcus spp. plays a significant role in the etiology of bovine mastitis. Staphylococcus aureus is considered the most important species due to the high prevalence and the difficulty of in vivo treatment that is related to the expression of virulence factors and biofilm formation. This study aimed to detect the phenotypic expression of the biofilm formation in 20 S. aureus isolated from bovine mastitis and to evaluate the expression and regulation of genes involved in its production. MALDI-TOF and phenogenotypic identification assays were performed to characterize the isolates. The phenotypic biofilm production and the presence of icaA and icaD and bap genes were evaluated. The Agr system was typified (agr I, agr II, agr III and agr IV) and its regulator (agr RNAIII) was detected. Furtherly, Real-time PCR (qPCR) was performed at chosen times to quantify the expression of icaA, icaD and hld genes in three selected isolates. All 20 strains were biofilm producers and most presented icaA and icaD genes. Only one isolate presented the bap gene. The agr gene type II showed a prevalence of 70%. Transcriptional analysis revealed increased expression of ica genes at eight hours of growth. These results confirm that polysaccharides production mediated by the icaADBC operon genes is an essential mechanism to the biofilm formation and contributes to the early stages of bacterial growth.(AU)

Staphylococcus spp. desempenham um papel significativo na etiologia da mastite bovina. Staphylococcus aureus é considerada a espécie mais importante devido a alta prevalência e a dificuldade de tratamento in vivo que está relacionado à expressão dos fatores de virulência e formação de biofilme. Este estudo teve como objetivo detectar a expressão fenotípica da formação de biofilme em 20 cepas de S. aureus isoladas de mastite bovina e avaliar a expressão e regulação de genes envolvidos em sua produção. MALDI-TOF e ensaios de identificação fenogenotípica foram realizados para caracterizar os isolados. A produção fenotípica de biofilme e a presença dos genes icaA, icaD e bap foram avaliadas. O sistema Agr foi tipificado (agr I, agr II, agr III e agr IV) e seu regulador (agr RNAIII) foi detectado. Além disso, a PCR em tempo real (qPCR) foi realizada nos tempos determinados para quantificar a expressão dos genes icaA, icaD e hld em três isolados selecionados. Todas as 20 linhagens foram produtoras de biofilme e a maioria apresentava os genes icaA e icaD. Apenas um isolado apresentou o gene bap. O gene agr do tipo II mostrou uma prevalência de 70%. A análise transcricional revelou aumento da expressão de genes ica às oito horas de crescimento. Estes resultados confirmam que a produção de polissacarídeos mediada pelos genes do operon icaADBC é um mecanismo essencial para a formação do biofilme e contribui para os estágios iniciais do crescimento bacteriano.(AU)

MALDI-TOF MS as a tool for the identification of Vibrio alginolyticus from Perna perna mussels (Linnaeus, 1758) / MALDI-TOF MS como ferramenta na identificação de Vibrio alginolyticus isolados de mexilhões Perna perna (Linnaeus, 1758)

Vibrio species are ubiquitous in aquatic environments, including coastal and marine habitats. Vibrio alginolyticus is an opportunistic pathogen for fish, crustaceans and mussels and their identification by biochemical tests may be impaired due their nutritional requirements. The study used Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) to identify 49 Vibrio spp. isolates associated with mussels (Perna perna) from different locations along the Rio de Janeiro coast. The rpoA gene was used as a genus-specific marker of Vibrio spp. and was positive in all 209 isolates. MALDI-TOF MS confirmed 87.8% of V. alginolyticus when compared to the results of the biochemical tests. Four isolates were identified as Shewanella putrefaciens (8.16%) and one was identified as V. parahaemolyticus (2.0%). Just one isolate was not identified by this technique (2.0%). The pyrH sequencing confirmed 75% of the proteomic technique results. MALDI-TOF MS is an excellent option for characterization of bacterial species, as it is efficient, fast and easy to apply. In addition, our study confirms its high specificity and sensitivity in these marine bacteria identification.(AU)

Espécies de Vibrio são ubiquitárias em ambientes aquáticos, incluindo habitats costeiros e marinhos. A espécie Vibrio alginolyticus é oportunista para peixes, crustáceos e moluscos e a sua identificação através de testes bioquímicos pode ter a qualidade prejudicada devido às suas exigências nutricionais. O presente estudo utilizou Espectrometria de Massa por Tempo de Vôo de Ionização/Desorção por Laser Assistida por Matriz (MALDI-TOF MS) para identificar diferentes espécies de Vibrio provenientes de mexilhões (Perna perna) coletados em diferentes locais ao longo da costa do Rio de Janeiro. O gene rpoA foi utilizado como um marcador gênero-específico de Vibrio spp. sendo positivo em todos os 209 isolados. MALDI-TOF MS confirmou 87,75% de V. alginolyticus quando comparados com os resultados dos testes bioquímicos. Quatro isolados foram identificados como Shewanella putrefaciens (8,16%), um como V. parahaemolyticus (2,0%) e apenas um (2,0%) não foi identificado pela técnica proteômica. E o sequenciamento do pyrH confirmou 75% dos resultados da técnica proteomica. MALDI-TOF MS tem sido considerada uma excelente opção para a caracterização bacteriana, por ser eficiente, rápida, de fácil aplicação e este estudo confirmou a sua elevada especificidade e sensibilidade na identificação de bactérias marinhas.(AU)

MALDI-TOF MS as a tool for the identification of Vibrio alginolyticus from Perna perna mussels (Linnaeus, 1758) / MALDI-TOF MS como ferramenta na identificação de Vibrio alginolyticus isolados de mexilhões Perna perna (Linnaeus, 1758)

Vibrio species are ubiquitous in aquatic environments, including coastal and marine habitats. Vibrio alginolyticus is an opportunistic pathogen for fish, crustaceans and mussels and their identification by biochemical tests may be impaired due their nutritional requirements. The study used Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) to identify 49 Vibrio spp. isolates associated with mussels (Perna perna) from different locations along the Rio de Janeiro coast. The rpoA gene was used as a genus-specific marker of Vibrio spp. and was positive in all 209 isolates. MALDI-TOF MS confirmed 87.8% of V. alginolyticus when compared to the results of the biochemical tests. Four isolates were identified as Shewanella putrefaciens (8.16%) and one was identified as V. parahaemolyticus (2.0%). Just one isolate was not identified by this technique (2.0%). The pyrH sequencing confirmed 75% of the proteomic technique results. MALDI-TOF MS is an excellent option for characterization of bacterial species, as it is efficient, fast and easy to apply. In addition, our study confirms its high specificity and sensitivity in these marine bacteria identification.(AU)

Espécies de Vibrio são ubiquitárias em ambientes aquáticos, incluindo habitats costeiros e marinhos. A espécie Vibrio alginolyticus é oportunista para peixes, crustáceos e moluscos e a sua identificação através de testes bioquímicos pode ter a qualidade prejudicada devido às suas exigências nutricionais. O presente estudo utilizou Espectrometria de Massa por Tempo de Vôo de Ionização/Desorção por Laser Assistida por Matriz (MALDI-TOF MS) para identificar diferentes espécies de Vibrio provenientes de mexilhões (Perna perna) coletados em diferentes locais ao longo da costa do Rio de Janeiro. O gene rpoA foi utilizado como um marcador gênero-específico de Vibrio spp. sendo positivo em todos os 209 isolados. MALDI-TOF MS confirmou 87,75% de V. alginolyticus quando comparados com os resultados dos testes bioquímicos. Quatro isolados foram identificados como Shewanella putrefaciens (8,16%), um como V. parahaemolyticus (2,0%) e apenas um (2,0%) não foi identificado pela técnica proteômica. E o sequenciamento do pyrH confirmou 75% dos resultados da técnica proteomica. MALDI-TOF MS tem sido considerada uma excelente opção para a caracterização bacteriana, por ser eficiente, rápida, de fácil aplicação e este estudo confirmou a sua elevada especificidade e sensibilidade na identificação de bactérias marinhas.(AU)

Genetic analysis of mecA gene and detection of homologue pbpD in Stahylococcus sciuri group.

Oxacillin/methicillin-resistance is related to the mecA and its regulatory genes mecR1 and mecI. Its origin is still unknown, although evidences support that it is related to CNS, once mecA and a homologue gene, pbpD, were both detected in Staphylococcus sciuri species group. The present work evaluated 210 samples of skin and ear swabs from rodents and 60 nasal swabs from equines of Army Biologic Institute, Rio de Janeiro. Pheno- and genotypic characterization provided 59.52% (25/42) and 78.57% (11/14) S. lentus and S. sciuri, respectively. It was observed that although all S. sciuri isolates tested positive for pbpD, there was no correlation with oxacillin-resistance. On the other hand, isolates tested positive for mecA gene also presented phenotypic oxacillin-resistance in at least one assay. The alignment of the mecA gene showed that the nucleotide sequences were sorted into 2 different groups, one comprising the bovine strains and the other containing human and equine strains.

Genetic analysis of mecA gene and detection of homologue pbpD in Stahylococcus sciuri group

Oxacillin/methicillin-resistance is related to the mecA and its regulatory genes mecR1 and mecI. Its origin is still unknown, although evidences support that it is related to CNS, once mecA and a homologue gene, pbpD, were both detected in Staphylococcus sciuri species group. The present work evaluated 210 samples of skin and ear swabs from rodents and 60 nasal swabs from equines of Army Biologic Institute, Rio de Janeiro. Pheno- and genotypic characterization provided 59.52% (25/42) and 78.57% (11/14) S. lentus and S. sciuri, respectively. It was observed that although all S. sciuri isolates tested positive for pbpD, there was no correlation with oxacillin-resistance. On the other hand, isolates tested positive for mecA gene also presented phenotypic oxacillin-resistance in at least one assay. The alignment of the mecA gene showed that the nucleotide sequences were sorted into 2 different groups, one comprising the bovine strains and the other containing human and equine strains.

Genetic analysis of mecA gene and detection of homologue pbpD in Stahylococcus sciuri group

Oxacillin/methicillin-resistance is related to the mecA and its regulatory genes mecR1 and mecI. Its origin is still unknown, although evidences support that it is related to CNS, once mecA and a homologue gene, pbpD, were both detected in Staphylococcus sciuri species group. The present work evaluated 210 samples of skin and ear swabs from rodents and 60 nasal swabs from equines of Army Biologic Institute, Rio de Janeiro. Pheno- and genotypic characterization provided 59.52% (25/42) and 78.57% (11/14) S. lentus and S. sciuri, respectively. It was observed that although all S. sciuri isolates tested positive for pbpD, there was no correlation with oxacillin-resistance. On the other hand, isolates tested positive for mecA gene also presented phenotypic oxacillin-resistance in at least one assay. The alignment of the mecA gene showed that the nucleotide sequences were sorted into 2 different groups, one comprising the bovine strains and the other containing human and equine strains.