RESUMEN
The present study describes the first isolation and characterization of a prokaryotic protein and gene for sucrose-phosphate phosphatase (SPP), the enzyme that catalyzes the terminal step in sucrose synthesis. For gene isolation, a 2,015-bp DNA fragment containing an open reading frame with about 31% amino acid identity to Synechocystis SPS was amplified from Anabaena sp. PCC 7120 DNA. Surprisingly, expression of the putative gene in Escherichia coli demonstrated that it encoded an SPP protein. The expressed protein cross-reacted with antibodies against the native form of Anabaena SPP and its biochemical properties were identical to those of the enzyme purified from the cyanobacterial cells. Comparisons of the Anabaena SPP with the higher-plant enzyme revealed important differences in the C-terminal region, molecular mass, subunit composition and immunoreactivity. Nevertheless, two conserved motifs, including four invariant aspartate residues similar to those found in members of the phosphohydrolase superfamily, were identified in the Anabaena SPP deduced amino acid sequence.
Asunto(s)
Anabaena/enzimología , Cianobacterias/enzimología , Fosfoproteínas Fosfatasas/genética , Monoéster Fosfórico Hidrolasas/genética , Secuencia de Aminoácidos , Anabaena/genética , Cationes/farmacología , Clonación Molecular , Cianobacterias/genética , Escherichia coli/genética , Regulación Enzimológica de la Expresión Génica , Datos de Secuencia Molecular , Técnicas de Amplificación de Ácido Nucleico , Fosfoproteínas Fosfatasas/aislamiento & purificación , Fosfoproteínas Fosfatasas/metabolismo , Monoéster Fosfórico Hidrolasas/antagonistas & inhibidores , Monoéster Fosfórico Hidrolasas/aislamiento & purificación , Monoéster Fosfórico Hidrolasas/metabolismo , Filogenia , Homología de Secuencia de Aminoácido , Especificidad por SustratoAsunto(s)
Anticuerpos Antivirales/análisis , Vacuna Antisarampión/inmunología , Virus del Sarampión/inmunología , Adolescente , Adulto , Argentina , Femenino , Humanos , Inmunidad , Lactante , Embarazo , VacunaciónRESUMEN
In this paper we determined the prevalence of mycoplasma contamination in 17 cell lines. Eighty per cent of the laboratories that currently use cell culture techniques participated in this study. Hoechst 33258 dye was used to detect mycoplasma contamination. The relationship between culture maintenance conditions and the presence of mycoplasma were analyzed, considering the use of antibiotics in the culture media, fetal calf serum (FCS) quality, culture media processing, use of disponsable labware, type of laminar flow cabinet, quantity of operators, and cell culture system. Thirty-five per cent of the analyzed cell lines showed mycoplasma contamination. Those lines belonged to 2 of the 8 surveyed laboratories. When confronting the working conditions versus mycoplasma contamination, 66% of the laboratories that employ non-certified FCS or reuse their labware, show mycoplasma contamination. Mycoplasma presence was found in 50% of the laboratories that use closed culture system, or more than one operator. Laboratories that process their culture media or that include antibiotic in the growing media, show a 40% contamination. The results obtained help to establish working conditions necessary to avoid introducing or spreading the microorganism.
Asunto(s)
Técnicas de Cultivo de Célula/normas , Laboratorios/normas , Mycoplasma/aislamiento & purificación , Argentina , Técnicas de Cultivo de Célula/métodos , Medios de CultivoRESUMEN
En este trabajo se determinó la presencia de micoplasmas en 17 líneas celulares continuas, provenientes de 8 laboratorios de cultivos celulares que corresponden al 80 por ciento de los que utilizan cultivos celulares en la ciudad de Córdoba. La contaminación fue determinada con el reactivo fluorescente Hoechst 33258. Se analizó la relación entre las condiciones de trabajo de cada laboratorio con la contaminación de sus líneas celulares. Las variables de trabajo estudiadas fueron: uso de antibióticos, calidad del suero fetal bovino (SFB), procesamiento del medio de cultivo, uso de materiales descartables, tipo de cabina de flujo laminar, sistema de crecimiento de cultivo y número de operadores. El índice de contaminación por micoplasmas fue 35 por ciento. De los laboratorios evaluados, sólo dos presentaron contaminación. Al evaluar las condiciones de trabajo en cada laboratorio y relacionarlas con la contaminación por micoplasmas, surgió 66 por ciento de infección entre los laboratorios que utilizaban SFB no certificados o reutilizaban el material de laboratorio; 50 por ciento, entre los laboratorios que contaban con sistemas cerrados de crecimiento celular o con un número de operadores mayor a uno; y 40 por ciento en aquéllos que incluían el procesamiento de los medios de cultivo (filtración o dilución) o utilizaban antibióticos en el medio de crecimiento. Los resultados obtenidos de este análisis contribuyen a sugerir condiciones de trabajo que tiendan a disminuir el riesgo de contaminación (AU)
Asunto(s)
Contaminación Ambiental , Técnicas de Cultivo de Célula/normas , Mycoplasma/aislamiento & purificación , Técnicas de Laboratorio Clínico , Contención de Riesgos Biológicos , ArgentinaRESUMEN
En este trabajo se determinó la presencia de micoplasmas en 17 líneas celulares continuas, provenientes de 8 laboratorios de cultivos celulares que corresponden al 80 por ciento de los que utilizan cultivos celulares en la ciudad de Córdoba. La contaminación fue determinada con el reactivo fluorescente Hoechst 33258. Se analizó la relación entre las condiciones de trabajo de cada laboratorio con la contaminación de sus líneas celulares. Las variables de trabajo estudiadas fueron: uso de antibióticos, calidad del suero fetal bovino (SFB), procesamiento del medio de cultivo, uso de materiales descartables, tipo de cabina de flujo laminar, sistema de crecimiento de cultivo y número de operadores. El índice de contaminación por micoplasmas fue 35 por ciento. De los laboratorios evaluados, sólo dos presentaron contaminación. Al evaluar las condiciones de trabajo en cada laboratorio y relacionarlas con la contaminación por micoplasmas, surgió 66 por ciento de infección entre los laboratorios que utilizaban SFB no certificados o reutilizaban el material de laboratorio; 50 por ciento, entre los laboratorios que contaban con sistemas cerrados de crecimiento celular o con un número de operadores mayor a uno; y 40 por ciento en aquéllos que incluían el procesamiento de los medios de cultivo (filtración o dilución) o utilizaban antibióticos en el medio de crecimiento. Los resultados obtenidos de este análisis contribuyen a sugerir condiciones de trabajo que tiendan a disminuir el riesgo de contaminación
Asunto(s)
Técnicas de Cultivo de Célula/normas , Técnicas de Laboratorio Clínico , Contención de Riesgos Biológicos , Contaminación Ambiental , Mycoplasma/aislamiento & purificación , ArgentinaRESUMEN
Culture amplification in colon adenocarcinoma cell line (CaCo-2) combined with enzyme immunoassay (Pathfinder ELISA) was developed as a supplementary tool for rotavirus diagnosis. One hundred and thirty stools in which results by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) were in agreement with those obtained by ELISA were amplified in the CaCo-2 cell line. After the first passage 100% specimens were revealed as positive by ELISA. This result was confirmed by PAGE and direct electron microscopy (EM) which increased the rates of rotavirus detection up to 100% after the third and fifth cell passages, respectively. All of the amplified negative stools were confirmed as negative. Among discordant results, three of the eight specimens positive by ELISA but negative by PAGE were confirmed as true positive after the third cell passage. False positive ELISA results could be discarded when the samples were culture amplified and retested by the same ELISA. Using the CaCo-2 amplification-ELISA as supplementary assay, sensitivity and specificity were 1.000 and 0.953 for ELISA and 0.917 and 1.000 for PAGE, respectively. The combined CaCo-2 cell line amplification-immunoassay method proved to be suitable both to evaluate increase in sensitivity of newly developed rotavirus assays and for rotaviral amplification before antigen assays.