Apoptosis in the transplanted canine transmissible venereal tumor during growth and regression phases / Apoptose no tumor venéreo transmissível canino durante as fases de crescimento e regressão

Twelve male, mongrel, adult dogs were subcutaneously transplanted with cells originated from two canine transmissible venereal tumors (TVT). The aim was to demonstrate and to quantify the occurrence of apoptosis in the TVT regression. After six months of transplantation, a tumor sample was obtained from each dog, being six dogs with TVT in the growing phase and six in the regression phase as verified by daily measurements. Samples were processed for histological and ultrastructural purposes as well as for DNA extraction. Sections of 4µm were stained by HE, Shorr, methyl green pyronine, Van Gieson, TUNEL reaction and immunostained for P53. The Shorr stained sections went through morphometry that demonstrated an increase of the apoptotic cells per field in the regressive tumors. It was also confirmed by transmission electron microscopy, which showed cells with typical morphology of apoptosis and by the TUNEL reaction that detected in situ the 3'OH nick end labeling mainly in the regressive tumors. The regressive TVTs also showed an intensified immunostaining for P53 besides a more intense genomic DNA fragmentation detected by the agarose gel electrophoresis. In conclusion, apoptosis has an important role in the regression of the experimental TVT in a way that is P53-dependent.

Doze cães, adultos, machos e sem raça definida foram transplantados subcutaneamente, na região hipogástrica, com células originadas de dois tumores venéreos transmissíveis caninos (TVT). O objetivo do estudo foi demonstrar e quantificar a ocorrência de apoptose na regressão do TVT. Após seis meses, foi obtido um tumor de cada animal, totalizando seis em crescimento e seis em regressão. Fragmentos dos tumores foram processados para avaliação histológica, ultra-estrutural e também para extração de DNA. Cortes de 4µm foram corados em HE, Shorr, verde de metila pironina e Van Gieson e alguns foram submetidos à reação do TUNEL e à imunoistoquímica para P53. Secções coradas pelo Shorr, submetidas à morfometria, demonstram maior índice apoptótico nos tumores em regressão. Esse achado foi confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão que evidenciou células com morfologia típica de apoptose e pela reação de TUNEL que marcou mais células nos tumores em regressão que naqueles em crescimento. A imunomarcação para P53 foi mais intensa nos tumores em regressão, assim como a fragmentação internucleossômica do genoma mostrada pela eletroforese em gel de agarose. Concluiu-se que a apoptose tem importante papel na regressão do TVT transplantado experimentalmente, sendo, nesse caso, dependente de P53 para a sua execução.

Apoptosis in the transplanted canine transmissible venereal tumor during growth and regression phases / Apoptose no tumor venéreo transmissível canino durante as fases de crescimento e regressão

Twelve male, mongrel, adult dogs were subcutaneously transplanted with cells originated from two canine transmissible venereal tumors (TVT). The aim was to demonstrate and to quantify the occurrence of apoptosis in the TVT regression. After six months of transplantation, a tumor sample was obtained from each dog, being six dogs with TVT in the growing phase and six in the regression phase as verified by daily measurements. Samples were processed for histological and ultrastructural purposes as well as for DNA extraction. Sections of 4µm were stained by HE, Shorr, methyl green pyronine, Van Gieson, TUNEL reaction and immunostained for P53. The Shorr stained sections went through morphometry that demonstrated an increase of the apoptotic cells per field in the regressive tumors. It was also confirmed by transmission electron microscopy, which showed cells with typical morphology of apoptosis and by the TUNEL reaction that detected in situ the 3'OH nick end labeling mainly in the regressive tumors. The regressive TVTs also showed an intensified immunostaining for P53 besides a more intense genomic DNA fragmentation detected by the agarose gel electrophoresis. In conclusion, apoptosis has an important role in the regression of the experimental TVT in a way that is P53-dependent.(AU)

Doze cães, adultos, machos e sem raça definida foram transplantados subcutaneamente, na região hipogástrica, com células originadas de dois tumores venéreos transmissíveis caninos (TVT). O objetivo do estudo foi demonstrar e quantificar a ocorrência de apoptose na regressão do TVT. Após seis meses, foi obtido um tumor de cada animal, totalizando seis em crescimento e seis em regressão. Fragmentos dos tumores foram processados para avaliação histológica, ultra-estrutural e também para extração de DNA. Cortes de 4µm foram corados em HE, Shorr, verde de metila pironina e Van Gieson e alguns foram submetidos à reação do TUNEL e à imunoistoquímica para P53. Secções coradas pelo Shorr, submetidas à morfometria, demonstram maior índice apoptótico nos tumores em regressão. Esse achado foi confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão que evidenciou células com morfologia típica de apoptose e pela reação de TUNEL que marcou mais células nos tumores em regressão que naqueles em crescimento. A imunomarcação para P53 foi mais intensa nos tumores em regressão, assim como a fragmentação internucleossômica do genoma mostrada pela eletroforese em gel de agarose. Concluiu-se que a apoptose tem importante papel na regressão do TVT transplantado experimentalmente, sendo, nesse caso, dependente de P53 para a sua execução.(AU)

Purine nucleoside phosphorylase: a potential target for the development of drugs to treat T-cell- and apicomplexan parasite-mediated diseases.

Purine nucleoside phosphorylase (PNP) catalyzes the reversible phosphorolysis of nucleosides and deoxynucleosides, generating ribose 1-phosphate and the purine base, which is an important step of purine catabolism pathway. The lack of such an activity in humans, owing to a genetic disorder, causes T-cell impairment, and thus drugs that inhibit human PNP activity have the potential of being utilized as modulators of the immunological system to treat leukemia, autoimmune diseases, and rejection in organ transplantation. Besides, the purine salvage pathway is the only possible way for apicomplexan parasites to obtain the building blocks for RNA and DNA synthesis, which makes PNP from these parasites an attractive target for drug development against diseases such as malaria. Hence, a number of research groups have made efforts to elucidate the mechanism of action of PNP based on structural and kinetic studies. It is conceivable that the mechanism may be different for PNPs from diverse sources, and influenced by the oligomeric state of the enzyme in solution. Furthermore, distinct transition state structures can make possible the rational design of specific inhibitors for human and apicomplexan enzymes. Here, we review the current status of these research efforts to elucidate the mechanism of PNP-catalyzed chemical reaction, focusing on the mammalian and Plamodium falciparum enzymes, targets for drug development against, respectively, T-Cell- and Apicomplexan parasites-mediated diseases.

Morphometric analysis of the thymus of puppies infected with the Snyder Hill Strain of canine distemper virus / Análise morfométrica do timo de cães filhotes infectados com a amostra Snyder Hill do vírus de cinomose canina

The thymic morphometry analysis was used for determining apoptosis and atrophy of the thymus of eight puppies inoculated with canine distemper virus (CDV). Three healthy dogs were used as negative controls. Sections, 5æm thick, were stained by HE and Shorr, and the latter were evaluated by morphometry. CDV nucleoprotein was detected by immunohistochemistry. Morphometric results confirmed lymphoid hypotrophy in CDV inoculated dog thymuses, more stroma, less parenchyma and higher apoptotic index/field than negative control (not inoculated) puppies. Apoptosis plays a role in the mechanism of thymus atrophy that develops in canine distemper.

Determinaram-se a apoptose e a atrofia no timo de oito cães novos, inoculados experimentalmente com o vírus de cinomose. Três cães saudáveis foram usados como controle negativo. Secções coradas pelo Shorr foram avaliadas por morfometria. A nucleoproteína viral foi detectada por imunoistoquímica. Os resultados morfométricos confirmaram a hipotrofia e mostraram que o timo dos cães inoculados tinha mais estroma, menos parênquima e maior índice apoptótico/campo que o dos animais-controle. Pode-se concluir que a apoptose desempenha importante papel no mecanismo de hipotrofia tímica que se desenvolve na cinomose.

Morphometric analysis of the thymus of puppies infected with the Snyder Hill Strain of canine distemper virus / Análise morfométrica do timo de cães filhotes infectados com a amostra Snyder Hill do vírus de cinomose canina

The thymic morphometry analysis was used for determining apoptosis and atrophy of the thymus of eight puppies inoculated with canine distemper virus (CDV). Three healthy dogs were used as negative controls. Sections, 5µm thick, were stained by HE and Shorr, and the latter were evaluated by morphometry. CDV nucleoprotein was detected by immunohistochemistry. Morphometric results confirmed lymphoid hypotrophy in CDV inoculated dog thymuses, more stroma, less parenchyma and higher apoptotic index/field than negative control (not inoculated) puppies. Apoptosis plays a role in the mechanism of thymus atrophy that develops in canine distemper.(AU)

Determinaram-se a apoptose e a atrofia no timo de oito cães novos, inoculados experimentalmente com o vírus de cinomose. Três cães saudáveis foram usados como controle negativo. Secções coradas pelo Shorr foram avaliadas por morfometria. A nucleoproteína viral foi detectada por imunoistoquímica. Os resultados morfométricos confirmaram a hipotrofia e mostraram que o timo dos cães inoculados tinha mais estroma, menos parênquima e maior índice apoptótico/campo que o dos animais-controle. Pode–se concluir que a apoptose desempenha importante papel no mecanismo de hipotrofia tímica que se desenvolve na cinomose.(AU)

Determination of the minimal representative number of microscopic fields to quantify apoptosis in canine lymph nodes

Determinou-se o número mínimo de campos por lâmina para se ter uma amostragem representativa para o estudo de apoptose em linfonodos de cães com cinomose. Um linfonodo traqueobrônquico de cão foi colhido e processado segundo técnica para inclusão em parafina. Secções de 5æm foram coradas pelo tricrômico de Shorr. Utilizou-se um analisador de imagens para registrar o número de células em apoptose e os índices apoptóticos de 300 campos, na mesma lâmina. Obtiveram-se, então, valores médios para 10 amostras de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 campos ao acaso. Realizou-se o estudo dos desvios-padrão das médias (DP) em relação ao tamanho da amostra que os originou. Quando as oscilações de DP entre amostras consecutivas foram menores que 5 por cento, o ganho em representatividade produzido pelo acréscimo no número de campos não se justificou, dispensando amostragens maiores. Desse modo, a análise de 40 campos por lâmina, na pesquisa de índices apoptóticos em linfonodos caninos, é suficientemente representativa, uma vez que apresenta instabilidade aceitável.

Determination of the minimal representative number of microscopic fields to quantify apoptosis in canine lymph nodes / Determinação do número mínimo representativo de campos microscópicos para quantificar apoptose em linfonodos caninos

Determinou-se o número mínimo de campos por lâmina para se ter uma amostragem representativa para o estudo de apoptose em linfonodos de cães com cinomose. Um linfonodo traqueobrônquico de cão foi colhido e processado segundo técnica para inclusão em parafina. Secções de 5µm foram coradas pelo tricrômico de Shorr. Utilizou-se um analisador de imagens para registrar o número de células em apoptose e os índices apoptóticos de 300 campos, na mesma lâmina. Obtiveram-se, então, valores médios para 10 amostras de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 campos ao acaso. Realizou-se o estudo dos desvios-padrão das médias (DP) em relação ao tamanho da amostra que os originou. Quando as oscilações de DP entre amostras consecutivas foram menores que 5%, o ganho em representatividade produzido pelo acréscimo no número de campos não se justificou, dispensando amostragens maiores. Desse modo, a análise de 40 campos por lâmina, na pesquisa de índices apoptóticos em linfonodos caninos, é suficientemente representativa, uma vez que apresenta instabilidade aceitável.(AU)

Porcentagem de parênquima e índice apoptótico da bolsa cloacal em frangos de corte em ambiente de conforto e estresse térmico / Parenchymal percentage and apoptotic index of cloacal bursa of broiler chickens maintained in thermal comfort or stress

Noventa e seis pintos de corte foram mantidos em diferentes temperaturas ambientais (calor, 29ºC; neutro, 24ºC; frio, 15ºC) e oito aves de cada grupo de temperatura (tratamento) foram sacrificadas nos dias 1, 7, 14, 21, 28, 35 e 42, e suas bolsas cloacais (BC) coletadas e processadas segundo técnica de rotina para inclusäo em parafina. Cortes de 4m m, corados em HE, foram submetidos à análise histométrica utilizando-se o programa Kontron KS300, V 2.0. De cada corte foram mensurados a porcentagem de parênquima e o índice apoptótico nas BC. As médias da porcentagem de parênquima nas BC das aves com cinco semanas foram significativamente menores quando mantidas em ambiente frio (53,0 por cento), quando comparadas com as do ambiente neutro (78,5 por cento). As médias do índice apoptótico foram significativamente maiores nas BC de aves mantidas no ambiente frio (0,26), em relaçäo às do neutro (0,12). Conclui-se que o estresse térmico induz apoptose de linfócitos e, conseqüentemente, hipotrofia da bolsa cloacal, alterando sua maturaçäo

Porcentagem de parênquima e índice apoptótico da bolsa cloacal em frangos de corte em ambiente de conforto e estresse térmico / Parenchymal percentage and apoptotic index of cloacal bursa of broiler chickens maintained in thermal comfort or stress

Noventa e seis pintos de corte foram mantidos em diferentes temperaturas ambientais (calor, 29ºC; neutro, 24ºC; frio, 15ºC) e oito aves de cada grupo de temperatura (tratamento) foram sacrificadas nos dias 1, 7, 14, 21, 28, 35 e 42, e suas bolsas cloacais (BC) coletadas e processadas segundo técnica de rotina para inclusão em parafina. Cortes de 4m m, corados em HE, foram submetidos à análise histométrica utilizando-se o programa Kontron KS300, V 2.0. De cada corte foram mensurados a porcentagem de parênquima e o índice apoptótico nas BC. As médias da porcentagem de parênquima nas BC das aves com cinco semanas foram significativamente menores quando mantidas em ambiente frio (53,0%), quando comparadas com as do ambiente neutro (78,5%). As médias do índice apoptótico foram significativamente maiores nas BC de aves mantidas no ambiente frio (0,26), em relação às do neutro (0,12). Conclui-se que o estresse térmico induz apoptose de linfócitos e, conseqüentemente, hipotrofia da bolsa cloacal, alterando sua maturação.(AU)

Ninety six broiler chickens were kept in climatic chambers and submitted to three different environmental temperatures 24h/day: 29ºC (hot), 24ºC (neutral) and 15ºC (cold). Eight chickens of each temperature group were sacrificed at 1, 7, 14, 21, 28, 35 and 42 days, and the cloacal bursae (CB) were collected, processed and embedded in paraffin. Sections were stained with HE and histometric evaluation was carried out. From each section, parenchyma ratio (PR) and apoptotic index (AI) were measured. The CB of five week-old chickens kept in lower temperature showed PR lower than CB of chickens kept in neutral temperature. The CB of five week-old chickens kept in lower temperature showed an AI greater than CB of chickens submitted to neutral temperature. The present study shows that environmental temperature stress induces lymphocytes apoptosis, cloacal bursae atrophy and affects CB maturation.(AU)

Ocorrência de apoptose em leucócitos no esfregaço de sangue periférico e em sincícios na infecçäo in vivo pelo vírus da cinomose canina / Occurrence of apoptosis in leukocytes in the peripheral blood smear and in syncytia in canine distemper infection in vivo

The aim of this paper is to report the occurrence of apoptosis in peripheral blood leukocytes and in syncytia induced by experimental infection of dogs with canine distemper virus. Blood was collected from nine puppies that were inoculated with the Snyder Hill strain of CDV, and stained with May Grunwaldt-Giemsa. Dogs were necropsied and retropharyngeal lymph nodes were collected and processed for paraffin embedding. Five micrometers thick sections were stained with hematoxylin-eosin and methyl green pyronin. Other sections were submitted to TUNEL reaction for in situ detection of apoptosis, and immunohistochemistry to detect CDV antigen. Immunohistochemistry confirmed the presence of viral antigen. Syncytia were present in all retropharyngeal lymph nodes. Several syncytia contained apoptotic nuclei as detected by hematoxylin-eosin and methyl green pyronin stains. Apoptotic nuclei were labeled inside syncytia by the TUNEL reaction. Blood smear analyses indicated higher proportion of apoptotic leukocytes in the peripheral blood of infected dogs

Ocorrência de apoptose em leucócitos no esfregaço de sangue periférico e em sincícios na infecção in vivo pelo vírus da cinomose canina / Occurrence of apoptosis in leukocytes in the peripheral blood smear and in syncytia in canine distemper infection in vivo

The aim of this paper is to report the occurrence of apoptosis in peripheral blood leukocytes and in syncytia induced by experimental infection of dogs with canine distemper virus. Blood was collected from nine puppies that were inoculated with the Snyder Hill strain of CDV, and stained with May Grunwaldt-Giemsa. Dogs were necropsied and retropharyngeal lymph nodes were collected and processed for paraffin embedding. Five micrometers thick sections were stained with hematoxylin-eosin and methyl green pyronin. Other sections were submitted to TUNEL reaction for in situ detection of apoptosis, and immunohistochemistry to detect CDV antigen. Immunohistochemistry confirmed the presence of viral antigen. Syncytia were present in all retropharyngeal lymph nodes. Several syncytia contained apoptotic nuclei as detected by hematoxylin-eosin and methyl green pyronin stains. Apoptotic nuclei were labeled inside syncytia by the TUNEL reaction. Blood smear analyses indicated higher proportion of apoptotic leukocytes in the peripheral blood of infected dogs.(AU)

Estudo comparativo da virulência de amostras de vacina do vírus da doença de Newcastle em galinhas SPF por meio da análise morfométrica da espessura traqueal / Comparative morphometric analysis of vaccinal virulence of some lentogenic strains of Newcastle disease virus in tracheas of SPF chickens

A virulência das amostras de vacinas lentogênicas La Sota, Ulster e VG-GA do vírus da doença de Newcastle (VDN) foi determinada por análise morfométrica da espessura da traquéia de galinhas (n=12) de 45 dias de idade, livres de anticorpos anti-VDN, vacinadas por via intra-traqueal. As traquéias foram avaliadas 1, 2, 3, 4, 6 e 8 dias pós-vacinaçäo. A amostra La Sota induziu maior espessamento da traquéia no decorrer de todo período experimental. Ao terceiro dia pós-vacinaçäo, período em que as traquéias se apresentaram mais espessas, as amostras La Sota e Ulster näo diferiram em sua virulência, sendo ambas mais virulentas do que a amostra VG-GA, induzindo maior espessamento de traquéia e causando lesöes histológicas mais severas

Preservaçäo do sistema genital de cabras para a avaliaçäo em microscopia de luz / Preservation of goat genital system for microscopic evaluation purpose

The preservation of the goat genital organs with a fixed solution of paraformaldehyde 10 per cent and a saturated solution of Bouin during 4, 8, 12 and 24 hours of fixation, included in paraffin and stained with hematoxylin-eosin was evaluated. The Bouin solution with four hours of fixation showed to be the best protocol of fixation for the ovary, oviduct, uterus and vagina, resulting in little tissue retraction and better cellular integration when compared to the other fixing times (8, 12 and 24 hours). The fixation with paraformaldehyde showed significant alteration in the tissue architecture of the oviduct and vagina. Althouh paraformaldehyde is not the most adequate solution for the goat genital system preservation, its use can be considered in the absence of Bouin solution

Preservação do sistema genital de cabras para a avaliação em microscopia de luz / Preservation of goat genital system for microscopic evaluation purpose

The preservation of the goat genital organs with a fixed solution of paraformaldehyde 10 per cent and a saturated solution of Bouin during 4, 8, 12 and 24 hours of fixation, included in paraffin and stained with hematoxylin-eosin was evaluated. The Bouin solution with four hours of fixation showed to be the best protocol of fixation for the ovary, oviduct, uterus and vagina, resulting in little tissue retraction and better cellular integration when compared to the other fixing times (8, 12 and 24 hours). The fixation with paraformaldehyde showed significant alteration in the tissue architecture of the oviduct and vagina. Althouh paraformaldehyde is not the most adequate solution for the goat genital system preservation, its use can be considered in the absence of Bouin solution.(AU)

Estudo comparativo da virulência de amostras de vacina do vírus da doença de Newcastle em galinhas SPF por meio da análise morfométrica da espessura traqueal

Virulence of three vaccinal lentogenic strains (La Sota, Ulster and VG-GA) of the Newcastle disease virus (NDV) was determined by morphometric analysis of tracheal thickness, in 45-day-old SPF chickens (n=12), free from NDV antibodies. Tracheal thickness was evaluated 1, 2, 3, 4, 6, and 8 days after intratracheal vaccination. La Sota strain induced higher tracheal swelling than the others, during most of the time of the experiment. Maximum swelling of tracheal mucosa occurred at the thirdday after vaccination. At that time, La Sota and Ulster had the same virulence, and both caused higher swelling of tracheal mucosa than VG-GA strain.

A virulência das amostras de vacinas lentogênicas La Sota, Ulster e VG-GA do vírus da doença de Newcastle (VDN) foi determinada por análise morfométrica da espessura da traquéia de galinhas (n=12) de 45 dias de idade, livres de anticorpos anti-VDN, vacinadas por via intra-traqueal. As traquéias foram avaliadas 1, 2, 3, 4, 6 e 8 dias pós-vacinação. A amostra La Sota induziu maior espessamento da traquéia no decorrer de todo período experimental. Ao terceiro dia pós-vacinação, período em que as traquéias se apresentaram mais espessas, as amostras La Sota e Ulster não diferiram em sua virulência, sendo ambas mais virulentas do que a amostra VG-GA, induzindo maior espessamento de traquéia e causando lesões histológicas mais severas.

Apoptose no tumor venéreo transmissível canino: características morfológicas e evidenciaçäo bioquímica / Apoptosis in the canine transmissible venereal tumor: morphological features and biochemical evidence

Fragmentos de tumor venéreo transmissível canino (TVTC) de ocorrência natural, com localizaçäo genital, foram obtidos de cinco animais, machos, adultos, sem raça definida. "Imprints" da superfície de corte em lâmina de microscopia foram fixadas em metanol, coradas pelo Giemsa e submetidas à avaliaçäo citológica. Os fragmentos foram fixados e processados rotineiramente para inclusäo em parafina e coloraçäo com HE e Shorr, para confirmaçäo histológica do tumor e identificaçäo da apoptose. Outros fragmentos foram envolvidos com papel alumínio e acondicionados dentro de frascos de vidro em gelo seco, para serem processados no mesmo dia, visando à extraçäo de DNA e eletroforese em gel de agarose. Análises cito e histológica do TVTC mostraram a distribuiçäo e o padräo celular e tecidual característicos dessa neoplasia, sobressaindo-se a presença de vacúolos claros, bem definidos no citoplasma à análise citológica. Pela coloraçäo com Shorr pôde-se identificar células retraídas, com aumento da acidofilia citoplasmática e condensaçäo da cromatina nuclear, às vezes com fragmentaçäo do núcleo e das células, caracterizando apoptose. A coloraçäo pelo Shorr mostrou ser mais eficiente na distinçäo de células apoptóticas do que a coloraçäo por HE. A eletroforese de DNA em gel de agarose demonstrou a fragmentaçäo internucleossômica do genoma, que pôde ser reconhecida pelo clássico "padräo em escada"

Apoptose no tumor venéreo transmissível canino: características morfológicas e evidenciação bioquímica

Fragments of canine transmissible venereal tumors, from natural cases and genital localization, were obtained from five adult male mongrel dogs. Imprints of the tumors were fixed, stained by Giemsa and submitted to cytological analysis to confirm the diagnosis. Representative samples of the tumoral tissue were fixed, embedded in paraffin and processed routinely for microscopic examination. Sections were stained with hematoxylin - eosin and Shorr. Another set of fragments was packed and maintained in dry ice, until DNA could be extracted for agarose gel electrophoresis. Cytological and histological results confirmed the diagnosis of the neoplasia and showed characteristic cellular and tissular patterns, with well-defined clear vacuoles in the cytoplasm. Shorr stained sections showed several shrunken cells, with cytoplasmic acidophilia, chromatin condensation, besides nuclear and cellular fragmentation, typical of apoptosis. Shorr was better than hematoxylin - eosin to distinguish apoptotic cells. Agarose gel electrophoresis of DNA showed the internucleosomal fragmentation of the genome, which was recognized as the classic "ladder pattern". Apoptosis does occur in the natural evolution of canine transmissible venereal tumor.

Fragmentos de tumor venéreo transmissível canino (TVTC) de ocorrência natural, com localização genital, foram obtidos de cinco animais, machos, adultos, sem raça definida. "Imprints" da superfície de corte em lâmina de microscopia foram fixadas em metanol, coradas pelo Giemsa e submetidas à avaliação citológica. Os fragmentos foram fixados e processados rotineiramente para inclusão em parafina e coloração com HE e Shorr, para confirmação histológica do tumor e identificação da apoptose. Outros fragmentos foram envolvidos com papel alumínio e acondicionados dentro de frascos de vidro em gelo seco, para serem processados no mesmo dia, visando à extração de DNA e eletroforese em gel de agarose. Análises cito e histológica do TVTC mostraram a distribuição e o padrão celular e tecidual característicos dessa neoplasia, sobressaindo-se a presença de vacúolos claros, bem definidos no citoplasma à análise citológica. Pela coloração com Shorr pôde-se identificar células retraídas, com aumento da acidofilia citoplasmática e condensação da cromatina nuclear, às vezes com fragmentação do núcleo e das células, caracterizando apoptose. A coloração pelo Shorr mostrou ser mais eficiente na distinção de células apoptóticas do que a coloração por HE. A eletroforese de DNA em gel de agarose demonstrou a fragmentação internucleossômica do genoma, que pôde ser reconhecida pelo clássico "padrão em escada".