The use of in situ hybridization and immunohistochemistry to study the pathogenesis of various Newcastle disease virus strains and recombinants in embryonated chicken eggs.

Avian paramyxovirus type 1, commonly referred to as Newcastle disease virus (NDV), is a serious pathogen of significant economic importance to the industry. To investigate the role of the fusion (F), hemagglutinin-neuraminidase (HN), and (P) phosphoprotein gene sequences in virulence, six strains of Newcastle disease virus (NDV) representing all pathotypes and seven recombinant strains created by reverse genetics were inoculated into 9-day-old chicken embryos. Tissues and chorioallantoic membranes (CAM) were harvested at 24-hour intervals post-inoculation. Riboprobe in situ hybridization and immunohistochemistry highlighted distinct tissue tropisms among the viruses. Presence of F and/or HN from virulent viruses inserted into lentogenic backbones caused dissemination of virus in a manner similar to wild type virulent viruses. Disruption of P gene decreased dissemination of velogeinic infectious clones. It is concluded that each of these genes contributes to pathogenicity.

Soroneutralização e imunofluorescência utilizando anticorpos monoclonais no diagnóstico rápido de infecções pelo herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BHV-1 e BHV-5) / Serum neutralizing and fluorescent antibody assays using monoclonal antibodies in rapid diagnostic tests for bovine herpesvirus types 1 (BHV-1) and 5 (BHV-5) infections

Anticorpos monoclonais (AcMs) produzidos com uma amostra brasileira do herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) foram utilizados na adaptação e padronização de técnicas rápidas para o diagnóstico de infecções pelo BHV-1 e BHV-5. A detecção de antígenos virais por imunofluorescência em células descamativas (IFCD) foi comparada com o isolamento viral, em secreções nasais de 16 bezerros, sendo 6 inoculados com o BHV-1 e 10 com o BHV-5. De 203 amostras testadas, 182 (89,6 por cento) apresentaram resultados concordantes nos dois testes (143 positivas; 39 negativas). Comparando-se com o isolamento, a IFCD apresentou sensibilidade de 96,6 por cento, especificidade de 70,9 por cento, e precisão de 89,6 por cento. Os AcMs também foram utilizados para detectar antígenos do BHV-5 em impressões frescas do cérebro de bezerros acometidos de enfermidade neurológica e em células de cultivo utilizadas na técnica de soroneutralização (SN), permitindo a obtenção dos resultados em 24 horas. A técnica, denominada de soroneutralização rápida (SNR), apresentou sensibilidade de 97,3 por cento; especificidade de 95,5 por cento e precisão de 96,2 por cento em comparação com a SN tradicional; e sensibilidade de 94,7 por cento, especificidade de 97,3 por cento e precisão de 96,1 por cento em comparação com um ELISA comercial. Esses resultados demonstram que esses AcMs podem ser muito úteis para uso em técnicas rápidas de diagnóstico de infecções suspeitas de BHV-1 ou de BHV-5, sobretudo em situações de surto, quando a tomada de decisões adequadas depende de um diagnóstico rápido e confiável.

Soroneutralização e imunofluorescência utilizando anticorpos monoclonais no diagnóstico rápido de infecções pelo herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BHV-1 e BHV-5)

Monoclonal antibodies (mAbs) produced to a Brazilian isolate of bovine herpesvirus type 5 (BHV-5) were used to standardize rapid tests for the diagnostic of BHV-1 and BHV-5 infections. The detection of viral antigens by immunofluorescence in descamative cells (IFDC) was compared to virus isolation in nasal secretions of 16 calves inoculated with BHV-1 (n=6) or BHV-5 (n=10). One hundred and sixty two out of 203 specimens (89.6%) had identical results in both assays (143 positive; 39 negative); the IFDC assay showing a sensitivity of 96.6%, specificity of 70.9% and precision of 89.6%. The mAbs were also used to detect BHV-5 antigens in fresh brain smears of calves from outbreaks of neurological disease; and in cell cultures used in a virus neutralizing (VN) test, allowing the obtention of results in 24 hours. The rapid virus neutralizing test (RVN) showed a sensitivity of 97.3%, specificity of 95.5% and precision of 96.2% comparing to the standard VN test; and a sensitivity of 94.7%, specificity of 97.3% and precision of 96.1% as compared to a commercial ELISA. These results demonstrate that these mAbs are useful in rapid diagnostic tests, which may be very important in field outbreaks, when taking adequate decisions depends on rapid and reliable diagnostic tests.

Anticorpos monoclonais (AcMs) produzidos com uma amostra brasileira do herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) foram utilizados na adaptação e padronização de técnicas rápidas para o diagnóstico de infecções pelo BHV-1 e BHV-5. A detecção de antígenos virais por imunofluorescência em células descamativas (IFCD) foi comparada com o isolamento viral, em secreções nasais de 16 bezerros, sendo 6 inoculados com o BHV-1 e 10 com o BHV-5. De 203 amostras testadas, 182 (89,6%) apresentaram resultados concordantes nos dois testes (143 positivas; 39 negativas). Comparando-se com o isolamento, a IFCD apresentou sensibilidade de 96,6%, especificidade de 70,9%, e precisão de 89,6%. Os AcMs também foram utilizados para detectar antígenos do BHV-5 em impressões frescas do cérebro de bezerros acometidos de enfermidade neurológica e em células de cultivo utilizadas na técnica de soroneutralização (SN), permitindo a obtenção dos resultados em 24 horas. A técnica, denominada de soroneutralização rápida (SNR), apresentou sensibilidade de 97,3%; especificidade de 95,5% e precisão de 96,2% em comparação com a SN tradicional; e sensibilidade de 94,7%, especificidade de 97,3% e precisão de 96,1% em comparação com um ELISA comercial. Esses resultados demonstram que esses AcMs podem ser muito úteis para uso em técnicas rápidas de diagnóstico de infecções suspeitas de BHV-1 ou de BHV-5, sobretudo em situações de surto, quando a tomada de decisões adequadas depende de um diagnóstico rápido e confiável.

Soroneutralização e imunofluorescência utilizando anticorpos monoclonais no diagnóstico rápido de infecções pelo herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BHV-1 e BHV-5)

Monoclonal antibodies (mAbs) produced to a Brazilian isolate of bovine herpesvirus type 5 (BHV-5) were used to standardize rapid tests for the diagnostic of BHV-1 and BHV-5 infections. The detection of viral antigens by immunofluorescence in descamative cells (IFDC) was compared to virus isolation in nasal secretions of 16 calves inoculated with BHV-1 (n=6) or BHV-5 (n=10). One hundred and sixty two out of 203 specimens (89.6%) had identical results in both assays (143 positive; 39 negative); the IFDC assay showing a sensitivity of 96.6%, specificity of 70.9% and precision of 89.6%. The mAbs were also used to detect BHV-5 antigens in fresh brain smears of calves from outbreaks of neurological disease; and in cell cultures used in a virus neutralizing (VN) test, allowing the obtention of results in 24 hours. The rapid virus neutralizing test (RVN) showed a sensitivity of 97.3%, specificity of 95.5% and precision of 96.2% comparing to the standard VN test; and a sensitivity of 94.7%, specificity of 97.3% and precision of 96.1% as compared to a commercial ELISA. These results demonstrate that these mAbs are useful in rapid diagnostic tests, which may be very important in field outbreaks, when taking adequate decisions depends on rapid and reliable diagnostic tests.

Anticorpos monoclonais (AcMs) produzidos com uma amostra brasileira do herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) foram utilizados na adaptação e padronização de técnicas rápidas para o diagnóstico de infecções pelo BHV-1 e BHV-5. A detecção de antígenos virais por imunofluorescência em células descamativas (IFCD) foi comparada com o isolamento viral, em secreções nasais de 16 bezerros, sendo 6 inoculados com o BHV-1 e 10 com o BHV-5. De 203 amostras testadas, 182 (89,6%) apresentaram resultados concordantes nos dois testes (143 positivas; 39 negativas). Comparando-se com o isolamento, a IFCD apresentou sensibilidade de 96,6%, especificidade de 70,9%, e precisão de 89,6%. Os AcMs também foram utilizados para detectar antígenos do BHV-5 em impressões frescas do cérebro de bezerros acometidos de enfermidade neurológica e em células de cultivo utilizadas na técnica de soroneutralização (SN), permitindo a obtenção dos resultados em 24 horas. A técnica, denominada de soroneutralização rápida (SNR), apresentou sensibilidade de 97,3%; especificidade de 95,5% e precisão de 96,2% em comparação com a SN tradicional; e sensibilidade de 94,7%, especificidade de 97,3% e precisão de 96,1% em comparação com um ELISA comercial. Esses resultados demonstram que esses AcMs podem ser muito úteis para uso em técnicas rápidas de diagnóstico de infecções suspeitas de BHV-1 ou de BHV-5, sobretudo em situações de surto, quando a tomada de decisões adequadas depende de um diagnóstico rápido e confiável.

Magnitude, duraçäo e especificidade da resposta sorológica em bovinos vacinados contra o vírus da diarréia viral bovina (BVDV) / Magnitude duration and specicicity of the serological response in cattle vaccinated against bovine viral diarrhea virus (BVDV)

A resposta sorológica induzida por três vacinas comerciais inativadas contra o vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) foi avaliada em bovinos imunizados três vezes (dias 0, 30 e 180) e testados a diferentes intervalos após a vacinaçäo. Trinta dias após a segunda vacinaçäo, 74,5 por cento (70/94) dos animais apresentavam anticorpos neutralizantes contra o BVDV-1 e 52,1 por cento (49/94) contra o BVDV-2. Os títulos médios (GMT) e o número de animais reagentes contra o BVDV-1 eram de 109,3 (32/36); 54,6 (22/28) e 25,5 (16/30) para as vacinas A, B e C, respectivamente; e de 19 (27/36), 42,3 (12/28) e 18,4 (10/30) contra o BVDV-2. Os títulos reduziram-se aos 180 dias, sendo que 31,9 por cento (30/94) dos animais já näo apresentavam atividade neutralizante frente ao BVDV-1 e 63,8 por cento (60/94) frente ao BVDV-2. Nesta data, os títulos médios e o número de animais positivos frente ao BVDV-1 eram de 28,3 (30/36), 28,3 (20/28) e 16,1 (14/30) e frente ao BVDV-2 de 16,8 (18/36), 21,6 (10/28) e 28,3 (6/30) para as vacinas A, B e C, respectivamente. Após o reforço (dia 180), os títulos médios contra o BVDV-1 aumentaram significativamente nos três grupos vacinais e contra o BVDV-2 apenas no grupo A. Trinta dias após, os títulos médios e o número de reagentes contra o BVDV-1 eram de 104,8 (23/24), 50,3 (24/26) e 43,7 (24/28) e contra o BVDV-2 de 33,4 (23/24), 23,3 (22/26) e 15,7 (22/28) para as vacinas A, B e C. Os títulos contra o BVDV-1 no dia 210 foram estatisticamente superiores aos títulos contra o BVDV-2 nos três grupos vacinais. O soro de alguns animais positivos de cada grupo foi testado frente a quatro amostras brasileiras de BVDV-1 e duas de BVDV-2. Além dos títulos baixos a moderados, os testes de neutralizaçäo cruzada revelaram variaçöes marcantes na atividade neutralizante frente a isolados de campo antigenicamente diferentes. Esses resultados demonstram que a vacinaçäo näo induziu uma resposta sorológica de magnitude e duraçäo adequadas na maioria dos animais, principalmente frente à grande diversidade antigênica das amostras de BVDV.

Magnitude, duração e especificidade da resposta sorológica em bovinos vacinados contra o vírus da diarréia viral bovina (bvdv)

The serological response induced by three inactivated commercial vaccines against bovine viral diarrhea virus (BVDV) was evaluated in calves immunized three times (days 0, 30 and 180) and examined at different intervals after vaccination. Thirty days after the second vaccination, 74.5% (70/94) of the calves had developed neutralizing antibodies titers against BVDV-1 and 52.1% (49/94) against BVDV-2. The geometric mean titers (GMT) and the number of animals with antibodies to BVDV-1 were 109.3(32/36); 54.6(22/28) and 25.5(16/30) for vaccines A, B e C, respectively and 19(27/36), 42.3(12/28) and 18.4(10/30) to BVDV-2. The antibody titers decreased by day 180, when 31.9%(30/94) of the calves showed no neutralizing activity against BVDV-1 and 63.8%(60/94) to BVDV-2. At that time, the GMTs and the number of animals seropositive to BVDV-1 were 28.3 (30/36), 28.3(20/28) and 16.1(14/30); and to BVDV-2 were 16.8(18/36), 21.6(10/28) and 28.3(6/30) for vaccines A, B and C, respectively. After the third dosis (day 180), the antibody titers to BVDV-1 increased significantly in all groups whereas a significant increase in BVDV-2 titers was observed only for vaccine A. At day 210, GMTs and the number of positive animals to BVDV-1 were 104.8(23/24), 50.3(24/26) and 43.7(24/28) and to BVDV-2 were 33.4(23/24), 23.3(22/26) and 15.7(22/28) for vaccines A, B and C. The neutralizing activity against BVDV-1 was higher than to BVDV-2 in all groups at day 210. Sera from five seropositive animals of each vaccine group were tested against four Brazilian BVDV-1 and two BVDV-2 isolates. In addition to the low and moderate titers, the cross-neutralization assays revealed a highly variable neutralizing activity against the Brazilian field isolates. These results demonstrated that the vaccination did not induce an adequate serological response in most animals, mainly due to the high antigenic variability of BVDV.

A resposta sorológica induzida por três vacinas comerciais inativadas contra o vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) foi avaliada em bovinos imunizados três vezes (dias 0, 30 e 180) e testados a diferentes intervalos após a vacinação. Trinta dias após a segunda vacinação, 74,5% (70/94) dos animais apresentavam anticorpos neutralizantes contra o BVDV-1 e 52,1% (49/94) contra o BVDV-2. Os títulos médios (GMT) e o número de animais reagentes contra o BVDV-1 eram de 109,3(32/36); 54,6(22/28) e 25,5(16/30) para as vacinas A, B e C, respectivamente; e de 19(27/36), 42,3(12/28) e 18,4(10/30) contra o BVDV-2. Os títulos reduziram-se aos 180 dias, sendo que 31,9%(30/94) dos animais já não apresentavam atividade neutralizante frente ao BVDV-1 e 63,8%(60/94) frente ao BVDV-2. Nesta data, os títulos médios e o número de animais positivos frente ao BVDV-1 eram de 28,3 (30/36), 28,3(20/28) e 16,1(14/30) e frente ao BVDV-2 de 16,8(18/36), 21,6(10/28) e 28,3(6/30) para as vacinas A, B e C, respectivamente. Após o reforço (dia 180), os títulos médios contra o BVDV-1 aumentaram significativamente nos três grupos vacinais e contra o BVDV-2 apenas no grupo A. Trinta dias após, os títulos médios e o número de reagentes contra o BVDV-1 eram de 104,8(23/24), 50,3(24/26) e 43,7(24/28) e contra o BVDV-2 de 33,4(23/24), 23,3(22/26) e 15,7(22/28) para as vacinas A, B e C. Os títulos contra o BVDV-1 no dia 210 foram estatisticamente superiores aos títulos contra o BVDV-2 nos três grupos vacinais. O soro de alguns animais positivos de cada grupo foi testado frente a quatro amostras brasileiras de BVDV-1 e duas de BVDV-2. Além dos títulos baixos a moderados, os testes de neutralização cruzada revelaram variações marcantes na atividade neutralizante frente a isolados de campo antigenicamente diferentes. Esses resultados demonstram que a vacinação não induziu uma resposta sorológica de magnitude e duração adequadas na maioria dos animais, principalmente frente à grande diversidade antigênica das amostras de BVDV.

MAGNITUDE, DURAÇÃO E ESPECIFICIDADE DA RESPOSTA SOROLÓGICA EM BOVINOS VACINADOS CONTRA O VÍRUS DA DIARRÉIA VIRAL BOVINA (BVDV)

The serological response induced by three inactivated commercial vaccines against bovine viral diarrhea virus (BVDV) was evaluated in calves immunized three times (days 0, 30 and 180) and examined at different intervals after vaccination. Thirty days after the second vaccination, 74.5% (70/94) of the calves had developed neutralizing antibodies titers against BVDV-1 and 52.1% (49/94) against BVDV-2. The geometric mean titers (GMT) and the number of animals with antibodies to BVDV-1 were 109.3(32/36); 54.6(22/28) and 25.5(16/30) for vaccines A, B e C, respectively and 19(27/36), 42.3(12/28) and 18.4(10/30) to BVDV-2. The antibody titers decreased by day 180, when 31.9%(30/94) of the calves showed no neutralizing activity against BVDV-1 and 63.8%(60/94) to BVDV-2. At that time, the GMTs and the number of animals seropositive to BVDV-1 were 28.3 (30/36), 28.3(20/28) and 16.1(14/30); and to BVDV-2 were 16.8(18/36), 21.6(10/28) and 28.3(6/30) for vaccines A, B and C, respectively. After the third dosis (day 180), the antibody titers to BVDV-1 increased significantly in all groups whereas a significant increase in BVDV-2 titers was observed only for vaccine A. At day 210, GMTs and the number of positive animals to BVDV-1 were 104.8(23/24), 50.3(24/26) and 43.7(24/28) and to BVDV-2 were 33.4(23/24), 23.3(22/26) and 15.7(22/28) for vaccines A, B and C. The neutralizing activity against BVDV-1 was higher than to BVDV-2 in all groups at day 210. Sera from five seropositive animals of each vaccine group were tested against four Brazilian BVDV-1 and two BVDV-2 isolates. In addition to the low and moderate titers, the cross-neutralization assays revealed a highly variable neutralizing activity against the Brazilian field isolates. These results demonstrated that the vaccination did not induce an adequate serological response in most animals, mainly due to the high antigenic variability of BVDV.

A resposta sorológica induzida por três vacinas comerciais inativadas contra o vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) foi avaliada em bovinos imunizados três vezes (dias 0, 30 e 180) e testados a diferentes intervalos após a vacinação. Trinta dias após a segunda vacinação, 74,5% (70/94) dos animais apresentavam anticorpos neutralizantes contra o BVDV-1 e 52,1% (49/94) contra o BVDV-2. Os títulos médios (GMT) e o número de animais reagentes contra o BVDV-1 eram de 109,3(32/36); 54,6(22/28) e 25,5(16/30) para as vacinas A, B e C, respectivamente; e de 19(27/36), 42,3(12/28) e 18,4(10/30) contra o BVDV-2. Os títulos reduziram-se aos 180 dias, sendo que 31,9%(30/94) dos animais já não apresentavam atividade neutralizante frente ao BVDV-1 e 63,8%(60/94) frente ao BVDV-2. Nesta data, os títulos médios e o número de animais positivos frente ao BVDV-1 eram de 28,3 (30/36), 28,3(20/28) e 16,1(14/30) e frente ao BVDV-2 de 16,8(18/36), 21,6(10/28) e 28,3(6/30) para as vacinas A, B e C, respectivamente. Após o reforço (dia 180), os títulos médios contra o BVDV-1 aumentaram significativamente nos três grupos vacinais e contra o BVDV-2 apenas no grupo A. Trinta dias após, os títulos médios e o número de reagentes contra o BVDV-1 eram de 104,8(23/24), 50,3(24/26) e 43,7(24/28) e contra o BVDV-2 de 33,4(23/24), 23,3(22/26) e 15,7(22/28) para as vacinas A, B e C. Os títulos contra o BVDV-1 no dia 210 foram estatisticamente superiores aos títulos contra o BVDV-2 nos três grupos vacinais. O soro de alguns animais positivos de cada grupo foi testado frente a quatro amostras brasileiras de BVDV-1 e duas de BVDV-2. Além dos títulos baixos a moderados, os testes de neutralização cruzada revelaram variações marcantes na atividade neutralizante frente a isolados de campo antigenicamente diferentes. Esses resultados demonstram que a vacinação não induziu uma resposta sorológica de magnitude e duração adequadas na maioria dos animais, principalmente frente à grande diversidade antigênica das amostras de BVDV.