RESUMEN
BACKGROUND: A century after its discovery, Chagas disease still represents a major neglected tropical threat. Accurate diagnostics tools as well as surrogate markers of parasitological response to treatment are research priorities in the field. The purpose of this study was to evaluate the performance of PCR methods in detection of Trypanosoma cruzi DNA by an external quality evaluation. METHODOLOGY/FINDINGS: An international collaborative study was launched by expert PCR laboratories from 16 countries. Currently used strategies were challenged against serial dilutions of purified DNA from stocks representing T. cruzi discrete typing units (DTU) I, IV and VI (set A), human blood spiked with parasite cells (set B) and Guanidine Hidrochloride-EDTA blood samples from 32 seropositive and 10 seronegative patients from Southern Cone countries (set C). Forty eight PCR tests were reported for set A and 44 for sets B and C; 28 targeted minicircle DNA (kDNA), 13 satellite DNA (Sat-DNA) and the remainder low copy number sequences. In set A, commercial master mixes and Sat-DNA Real Time PCR showed better specificity, but kDNA-PCR was more sensitive to detect DTU I DNA. In set B, commercial DNA extraction kits presented better specificity than solvent extraction protocols. Sat-DNA PCR tests had higher specificity, with sensitivities of 0.05-0.5 parasites/mL whereas specific kDNA tests detected 5.10(-3) par/mL. Sixteen specific and coherent methods had a Good Performance in both sets A and B (10 fg/µl of DNA from all stocks, 5 par/mL spiked blood). The median values of sensitivities, specificities and accuracies obtained in testing the Set C samples with the 16 tests determined to be good performing by analyzing Sets A and B samples varied considerably. Out of them, four methods depicted the best performing parameters in all three sets of samples, detecting at least 10 fg/µl for each DNA stock, 0.5 par/mL and a sensitivity between 83.3-94.4%, specificity of 85-95%, accuracy of 86.8-89.5% and kappa index of 0.7-0.8 compared to consensus PCR reports of the 16 good performing tests and 63-69%, 100%, 71.4-76.2% and 0.4-0.5, respectively compared to serodiagnosis. Method LbD2 used solvent extraction followed by Sybr-Green based Real time PCR targeted to Sat-DNA; method LbD3 used solvent DNA extraction followed by conventional PCR targeted to Sat-DNA. The third method (LbF1) used glass fiber column based DNA extraction followed by TaqMan Real Time PCR targeted to Sat-DNA (cruzi 1/cruzi 2 and cruzi 3 TaqMan probe) and the fourth method (LbQ) used solvent DNA extraction followed by conventional hot-start PCR targeted to kDNA (primer pairs 121/122). These four methods were further evaluated at the coordinating laboratory in a subset of human blood samples, confirming the performance obtained by the participating laboratories. CONCLUSION/SIGNIFICANCE: This study represents a first crucial step towards international validation of PCR procedures for detection of T. cruzi in human blood samples.
Asunto(s)
Enfermedad de Chagas/diagnóstico , ADN Protozoario/sangre , Parasitología/métodos , Reacción en Cadena de la Polimerasa/métodos , Trypanosoma cruzi/aislamiento & purificación , Enfermedad de Chagas/parasitología , Humanos , Cooperación Internacional , Sensibilidad y Especificidad , Trypanosoma cruzi/genéticaRESUMEN
El principal vector de la enfermedad de Chagas en países de la región del Cono Sur de América Latina es Triatoma infestans, y con la disminución de la población de esta especie debido a las acciones de control y vigilancia vectorial, surge el problema de reinfestación de las viviendas desde focos residuales o la invasión por especies no domésticas. En este contexto, especies nativas y secundarias como Triatoma sordida, adquieren importancia epidemiológica por la capacidad potencial de reemplazar el nicho ecológico de triatominos estrictamente domiciliarios como T. infestans después de su eliminación. En este estudio se analizaron los indicadores entomológicos: infestación discriminada por lugar de captura intra y peridomicilio, colonización, infección natural y fuente de alimentación de T. sordida capturados durante los años 2004 al 2007 en el Departamento de Concepción (región endémica de la enfermedad de Chagas) en fase de vigilancia entomológica (control químico masivo realizado en el año 2002). Se analizaron 216 ejemplares de T. sordida capturados en 83 viviendas ubicadas en 40 localidades de 4 distritos, encontrándose colonización de T. sordida en el 22% de las viviendas infestadas. Se emplearon métodos moleculares para: i) la detección de Trypanosoma cruzi en T. sordida (infección natural), resultando 23 (10,6%) triatominos infectados (10 del intradomicilio) y ii) la caracterización de T. cruzi en linajes y sublinajes, siendo el sublinaje mayoritario T.cruzi IIc (UDTs: TcIII) (58%) de los 23 triatominos infectados. Se detectó la fuente de alimentación en 11 (5%) de los 216 T. sordida analizados (técnica PCR-RFLP del gen cyt b), de los cuales 8 (73%) correspondían a sangre humana confirmado con marcadores específicos de microsatélites para humanos. Los resultados obtenidos demuestran el potencial rol de la especie T. sordida en la trasmisión de la enfermedad de Chagas en el Paraguay