Efficient RNAi-induced protein knockdown in somatic cells using diced or chemically produced small interfering RNAs (siRNA) / Efficient RNAi-induced protein knockdown in somatic cells using diced or chemically produced small interfering RNAs (siRNA)

Background: RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which double-stranded RNA (dsRNA) directs the degradation of a specifi c corresponding target mRNA. The mediators of this process are small dsRNAs of approximately 21 to 23 bp in length, called small interfering RNAs (siRNAs), which can be prepared in vitro and used to direct the degradation of specifi c mRNAs inside cells. Hence, siRNAs represent a powerful tool to study and control gene and cell function. Rapid progress has been made in the use of siRNA as a means to attenuate the expression of any protein for which the cDNA sequence is known. Individual siRNAs can be chemically synthesized, in vitro-transcribed, or expressed in cells from siRNA expression vectors. However, screening for the most effi cient siRNAs for post-transcriptional gene silencing in cells in culture is a laborious and expensive process. In this study, the effectiveness of two siRNA production strategies for the attenuation of abundant proteins for DNA repair were compared in human cells: (a) the in vitro production of siRNA mixtures by the Dicer enzyme (Diced siRNAs); and (b) the chemical synthesis of very specifi c and unique siRNA sequences (Stealth RNaiTM).Dicing to create mixtures of siRNAs. The Diced fragments of siRNA for each gene sequence were pooled and stored at -80o C. Alternatively, chemically synthesiz

Background: RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which double-stranded RNA (dsRNA) directs the degradation of a specifi c corresponding target mRNA. The mediators of this process are small dsRNAs of approximately 21 to 23 bp in length, called small interfering RNAs (siRNAs), which can be prepared in vitro and used to direct the degradation of specifi c mRNAs inside cells. Hence, siRNAs represent a powerful tool to study and control gene and cell function. Rapid progress has been made in the use of siRNA as a means to attenuate the expression of any protein for which the cDNA sequence is known. Individual siRNAs can be chemically synthesized, in vitro-transcribed, or expressed in cells from siRNA expression vectors. However, screening for the most effi cient siRNAs for post-transcriptional gene silencing in cells in culture is a laborious and expensive process. In this study, the effectiveness of two siRNA production strategies for the attenuation of abundant proteins for DNA repair were compared in human cells: (a) the in vitro production of siRNA mixtures by the Dicer enzyme (Diced siRNAs); and (b) the chemical synthesis of very specifi c and unique siRNA sequences (Stealth RNaiTM).Materials, Methods & Results: For in vitro-produced siRNAs, two segments of the human Ku70 (167 bp in exon 5; and 249 bp in exon 13; NM001469) and Xrcc4 (1

Efficient RNAi-induced protein knockdown in somatic cells using diced or chemically produced small interfering RNAs (siRNA) / Efficient RNAi-induced protein knockdown in somatic cells using diced or chemically produced small interfering RNAs (siRNA)

Background: RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which double-stranded RNA (dsRNA) directs the degradation of a specifi c corresponding target mRNA. The mediators of this process are small dsRNAs of approximately 21 to 23 bp in length, called small interfering RNAs (siRNAs), which can be prepared in vitro and used to direct the degradation of specifi c mRNAs inside cells. Hence, siRNAs represent a powerful tool to study and control gene and cell function. Rapid progress has been made in the use of siRNA as a means to attenuate the expression of any protein for which the cDNA sequence is known. Individual siRNAs can be chemically synthesized, in vitro-transcribed, or expressed in cells from siRNA expression vectors. However, screening for the most effi cient siRNAs for post-transcriptional gene silencing in cells in culture is a laborious and expensive process. In this study, the effectiveness of two siRNA production strategies for the attenuation of abundant proteins for DNA repair were compared in human cells: (a) the in vitro production of siRNA mixtures by the Dicer enzyme (Diced siRNAs); and (b) the chemical synthesis of very specifi c and unique siRNA sequences (Stealth RNaiTM).Dicing to create mixtures of siRNAs. The Diced fragments of siRNA for each gene sequence were pooled and stored at -80o C. Alternatively, chemically synthesiz

Background: RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional gene silencing process in which double-stranded RNA (dsRNA) directs the degradation of a specifi c corresponding target mRNA. The mediators of this process are small dsRNAs of approximately 21 to 23 bp in length, called small interfering RNAs (siRNAs), which can be prepared in vitro and used to direct the degradation of specifi c mRNAs inside cells. Hence, siRNAs represent a powerful tool to study and control gene and cell function. Rapid progress has been made in the use of siRNA as a means to attenuate the expression of any protein for which the cDNA sequence is known. Individual siRNAs can be chemically synthesized, in vitro-transcribed, or expressed in cells from siRNA expression vectors. However, screening for the most effi cient siRNAs for post-transcriptional gene silencing in cells in culture is a laborious and expensive process. In this study, the effectiveness of two siRNA production strategies for the attenuation of abundant proteins for DNA repair were compared in human cells: (a) the in vitro production of siRNA mixtures by the Dicer enzyme (Diced siRNAs); and (b) the chemical synthesis of very specifi c and unique siRNA sequences (Stealth RNaiTM).Materials, Methods & Results: For in vitro-produced siRNAs, two segments of the human Ku70 (167 bp in exon 5; and 249 bp in exon 13; NM001469) and Xrcc4 (1

Microbiological and functional evaluation of an alternative device (OB®) for estrous synchronization in ewes

The use of synthetic progestagens released by vaginal devices is an important tool to overcome the reproductive seasonality in sheep, but cost and/or subsequent vaginitis are limiting factors for their use. To identify economic, simple and innocuous alternative vaginal devices for estrous synchronization/induction protocols in sheep, this study aimed to evaluate the microbiological and functional viability of the human vaginal tampons (OB®) impregnated with medroxyprogesterone acetate (MAP) on reproductive performance of ewes. The study compared them with commercial vaginal inserts (CIDR®) and polyurethane sponges impregnated with MAP. In Experiment 1, the device loss rate, the degree of vaginitis during the device removal, the count and identification of bacterial colonies at the device insertion and removal, and efficiency in estrous synchronization and estrus temporal distribution were evaluated. Pubertal ewes at the beginning of the breeding season were randomly allocated to three experimental groups: CIDR®, PSP (polyurethane sponge) and OB®. No device losses occurred in any group, but the use of OB® caused milder signs of vaginitis than polyurethane sponges, with a similar vaginal bacterial growth and microbiota than the CIDR group. The estrus distribution was more disperse in the CIDR than PSP or OB groups. In Experiment 2, pregnancy rates using CIDR® or OB® devices were compared, with estrus manifestation (85.4% and 89.8%) and pregnancy rates (58.3% and 49.0%) being similar between groups (P>0.05), respectively. In conclusion, the use of human intra-vaginal tampons (OB®) impregnated with MAP was proven highly hygienic, practical and effective as a low-cost alternative for estrous synchronization and AI in sheep.

O uso de progestágeno sintético liberado por pessários vaginais é uma importante ferramenta para suplantar a sazonalidade reprodutiva em ovelhas. Todavia, seu uso é limitado pelo custo ou pelas subsequentes vaginites. Na busca de uma alternativa simples e de baixo custo para sincronizar estro em ovelhas, este estudo avaliou o tampão vaginal humano (OB®) impregnado com MAP, na performance reprodutiva de ovelhas, comparando com o CIDR® e as esponjas de poliuretano, estas também impregnadas com MAP. No experimento 1 foram avaliados a taxa de perdas; o grau das vaginites no momento da remoção do pessário; a contagem e identificação das colônias bacterianas; bem como a eficiência da sincronização e a distribuição temporal dos cios. As ovelhas foram aleatoriamente distribuídas em um de três grupos experimentais: CIDR, Esponjas e OB, no inicio da estação reprodutiva. Não ocorreram perdas de pessários em qualquer grupo, porém o OB causou menor grau de vaginite em relação às esponjas, com um crescimento bacteriano e microbiota similares ao grupo CIDR. A distribuição dos cios foi mais dispersa no grupo CIDR do que nos grupos Esponja ou OB. No experimento 2, foram comparados o CIDR e OB em relação à manifestação de cio (85,4% e 89,8%) e taxa de prenhez (58,3% e 49,0%), que foram similares (P 0,05). Conclui-se que o pessário OB impregnado com MAP é higiênico, de baixo custo, prático e efetivo como para a sincronização de cios e IA em ovelhas.

Microbiological and functional evaluation of an alternative device (OB®) for estrous synchronization in ewes

The use of synthetic progestagens released by vaginal devices is an important tool to overcome the reproductive seasonality in sheep, but cost and/or subsequent vaginitis are limiting factors for their use. To identify economic, simple and innocuous alternative vaginal devices for estrous synchronization/induction protocols in sheep, this study aimed to evaluate the microbiological and functional viability of the human vaginal tampons (OB®) impregnated with medroxyprogesterone acetate (MAP) on reproductive performance of ewes. The study compared them with commercial vaginal inserts (CIDR®) and polyurethane sponges impregnated with MAP. In Experiment 1, the device loss rate, the degree of vaginitis during the device removal, the count and identification of bacterial colonies at the device insertion and removal, and efficiency in estrous synchronization and estrus temporal distribution were evaluated. Pubertal ewes at the beginning of the breeding season were randomly allocated to three experimental groups: CIDR®, PSP (polyurethane sponge) and OB®. No device losses occurred in any group, but the use of OB® caused milder signs of vaginitis than polyurethane sponges, with a similar vaginal bacterial growth and microbiota than the CIDR group. The estrus distribution was more disperse in the CIDR than PSP or OB groups. In Experiment 2, pregnancy rates using CIDR® or OB® devices were compared, with estrus manifestation (85.4% and 89.8%) and pregnancy rates (58.3% and 49.0%) being similar between groups (P>0.05), respectively. In conclusion, the use of human intra-vaginal tampons (OB®) impregnated with MAP was proven highly hygienic, practical and effective as a low-cost alternative for estrous synchronization and AI in sheep.

O uso de progestágeno sintético liberado por pessários vaginais é uma importante ferramenta para suplantar a sazonalidade reprodutiva em ovelhas. Todavia, seu uso é limitado pelo custo ou pelas subsequentes vaginites. Na busca de uma alternativa simples e de baixo custo para sincronizar estro em ovelhas, este estudo avaliou o tampão vaginal humano (OB®) impregnado com MAP, na performance reprodutiva de ovelhas, comparando com o CIDR® e as esponjas de poliuretano, estas também impregnadas com MAP. No experimento 1 foram avaliados a taxa de perdas; o grau das vaginites no momento da remoção do pessário; a contagem e identificação das colônias bacterianas; bem como a eficiência da sincronização e a distribuição temporal dos cios. As ovelhas foram aleatoriamente distribuídas em um de três grupos experimentais: CIDR, Esponjas e OB, no inicio da estação reprodutiva. Não ocorreram perdas de pessários em qualquer grupo, porém o OB causou menor grau de vaginite em relação às esponjas, com um crescimento bacteriano e microbiota similares ao grupo CIDR. A distribuição dos cios foi mais dispersa no grupo CIDR do que nos grupos Esponja ou OB. No experimento 2, foram comparados o CIDR e OB em relação à manifestação de cio (85,4% e 89,8%) e taxa de prenhez (58,3% e 49,0%), que foram similares (P 0,05). Conclui-se que o pessário OB impregnado com MAP é higiênico, de baixo custo, prático e efetivo como para a sincronização de cios e IA em ovelhas.

Bos taurus and Bos indicus folicular aspiration and oocytes vitrification at field conditions / Aspiração folicular em vacas Bos taurus e Bos indicus e vitrificação dos oócitos em condições de campo

The aim of this study was to evaluate the viability of cryopreservation of bovine oocytes from Bos taurus and Bos indicus cows, at field conditions. The average rate of oocyte recovered by Ovum Pick up (OPU) from Bos taurus taurus cows (Devon) or Bos taurus indicus cows (Nelore), and the embryo development after vitrification were determined. After 60 sessions, an average rate of 4.6 oocytes/session was obtained from Devon cows. This number was significantly lower than the 16.3 oocytes obtained from Nelore cows, in 12 sessions. Selected recovered oocytes were vitrified in 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose, in TCM 199 medium, with open pulled straws (OPS) technology, and stored in a cryogenic container. Just after warmed, oocytes were submitted to standard in vitro maturation, fertilization and culture in the laboratory. There were no differences in cleavage rates obtained from Devon cows oocytes (17.6%) and Nelore cows oocytes (29.1%). Evaluation of embryo development resulted in only one blastocyst obtained from Devon cows. Data from this study showed that Bos taurus indicus cows had higher oocytes recovery rates when compared with Bos taurus taurus, and that association of OPU with oocytes vitrification at farm conditions resulted in unsatisfactory indexes of embryo development, regardless of cow breed.

Com o objetivo de avaliar a viabilidade da criopreservação de oócitos de fêmeas taurinas e zebuínas em condição de campo, este estudo determinou a taxa média de oócitos obtidos por punção folicular in vivo (OPU) de fêmeas bovinas Bos taurus taurus (Devon) e Bos taurus indicus (Nelore), bem como o desenvolvimento embrionário após a vitrificação destes oócitos. Em 60 sessões, obteve-se média de 4,6 oócitos por sessão de OPU nas vacas Devon, número significativamente inferior aos 16,3 oócitos obtidos nas vacas Nelore, em 12 sessões. Os oócitos selecionados foram vitrificados em solução de 20% de EG + 20% de DMSO + 0,5 M de sacarose, em meio TCM 199, utilizando-se palhetas estiradas (OPS). O reaquecimento foi efetuado em laboratório, seguindo-se a maturação, fecundação e cultivo in vitro. As taxas de clivagem obtidas foram 17,6% no grupo de vacas Devon e 29,1% no grupo Nelore, não havendo diferença significativa entre as mesmas. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, obteve-se apenas um blastocisto no grupo Devon. Concluiu-se que fêmeas zebuínas (Nelore) proporcionam maior taxa de oócitos recuperados por sessão em relação às fêmeas taurinas (Devon), e que a associação da OPU com a vitrificação dos oócitos na própria fazenda não proporciona taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário, independente da origem dos animais.

Bos taurus and Bos indicus folicular aspiration and oocytes vitrification at field conditions / Aspiração folicular em vacas Bos taurus e Bos indicus e vitrificação dos oócitos em condições de campo

The aim of this study was to evaluate the viability of cryopreservation of bovine oocytes from Bos taurus and Bos indicus cows, at field conditions. The average rate of oocyte recovered by Ovum Pick up (OPU) from Bos taurus taurus cows (Devon) or Bos taurus indicus cows (Nelore), and the embryo development after vitrification were determined. After 60 sessions, an average rate of 4.6 oocytes/session was obtained from Devon cows. This number was significantly lower than the 16.3 oocytes obtained from Nelore cows, in 12 sessions. Selected recovered oocytes were vitrified in 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose, in TCM 199 medium, with open pulled straws (OPS) technology, and stored in a cryogenic container. Just after warmed, oocytes were submitted to standard in vitro maturation, fertilization and culture in the laboratory. There were no differences in cleavage rates obtained from Devon cows oocytes (17.6%) and Nelore cows oocytes (29.1%). Evaluation of embryo development resulted in only one blastocyst obtained from Devon cows. Data from this study showed that Bos taurus indicus cows had higher oocytes recovery rates when compared with Bos taurus taurus, and that association of OPU with oocytes vitrification at farm conditions resulted in unsatisfactory indexes of embryo development, regardless of cow breed.

Com o objetivo de avaliar a viabilidade da criopreservação de oócitos de fêmeas taurinas e zebuínas em condição de campo, este estudo determinou a taxa média de oócitos obtidos por punção folicular in vivo (OPU) de fêmeas bovinas Bos taurus taurus (Devon) e Bos taurus indicus (Nelore), bem como o desenvolvimento embrionário após a vitrificação destes oócitos. Em 60 sessões, obteve-se média de 4,6 oócitos por sessão de OPU nas vacas Devon, número significativamente inferior aos 16,3 oócitos obtidos nas vacas Nelore, em 12 sessões. Os oócitos selecionados foram vitrificados em solução de 20% de EG + 20% de DMSO + 0,5 M de sacarose, em meio TCM 199, utilizando-se palhetas estiradas (OPS). O reaquecimento foi efetuado em laboratório, seguindo-se a maturação, fecundação e cultivo in vitro. As taxas de clivagem obtidas foram 17,6% no grupo de vacas Devon e 29,1% no grupo Nelore, não havendo diferença significativa entre as mesmas. Na avaliação do desenvolvimento embrionário, obteve-se apenas um blastocisto no grupo Devon. Concluiu-se que fêmeas zebuínas (Nelore) proporcionam maior taxa de oócitos recuperados por sessão em relação às fêmeas taurinas (Devon), e que a associação da OPU com a vitrificação dos oócitos na própria fazenda não proporciona taxas aceitáveis de desenvolvimento embrionário, independente da origem dos animais.

Embriões bovinos PIV vitrificados em diferentes soluções crioprotetoras com ou em o uso de nitrogênio super-resfriado

O total aproveitamento de embriões PIV ainda depende de uma metodologia eficiente de criopreservação. Este estudo avaliou a taxa de eclosão de embriões bovinos PIV, vitrificados em OPS usando três diferentes soluções crioprotetoras (Experimento 1) e o emprego de nitrogênio normal (-196C) ou super-resfriado (-210C) (Experimento 2). No primeiro experimento (12 repetições) 576 blastocistos expandidos (Bx) PIV foram aleatoriamente alocados em 4 grupos: G1 (20% EG + 20% DMSO), G2 (25% EG + 25% GLI), G3 (20% EG + 20% PRO) e G4 (controle não vitrificado). Após 72 horas de cultivo in vitro, a taxa de eclosão do grupo controle (84,0%) foi superior às observadas nos grupos vitrificados (P

Embriões bovinos PIV vitrificados em diferentes soluções crioprotetoras com ou em o uso de nitrogênio super-resfriado

O total aproveitamento de embriões PIV ainda depende de uma metodologia eficiente de criopreservação. Este estudo avaliou a taxa de eclosão de embriões bovinos PIV, vitrificados em OPS usando três diferentes soluções crioprotetoras (Experimento 1) e o emprego de nitrogênio normal (-196C) ou super-resfriado (-210C) (Experimento 2). No primeiro experimento (12 repetições) 576 blastocistos expandidos (Bx) PIV foram aleatoriamente alocados em 4 grupos: G1 (20% EG + 20% DMSO), G2 (25% EG + 25% GLI), G3 (20% EG + 20% PRO) e G4 (controle não vitrificado). Após 72 horas de cultivo in vitro, a taxa de eclosão do grupo controle (84,0%) foi superior às observadas nos grupos vitrificados (P

Embriões bovinos PIV vitrificados em diferentes soluções crioprotetoras com ou em o uso de nitrogênio super-resfriado

O total aproveitamento de embriões PIV ainda depende de uma metodologia eficiente de criopreservação. Este estudo avaliou a taxa de eclosão de embriões bovinos PIV, vitrificados em OPS usando três diferentes soluções crioprotetoras (Experimento 1) e o emprego de nitrogênio normal (-196C) ou super-resfriado (-210C) (Experimento 2). No primeiro experimento (12 repetições) 576 blastocistos expandidos (Bx) PIV foram aleatoriamente alocados em 4 grupos: G1 (20% EG + 20% DMSO), G2 (25% EG + 25% GLI), G3 (20% EG + 20% PRO) e G4 (controle não vitrificado). Após 72 horas de cultivo in vitro, a taxa de eclosão do grupo controle (84,0%) foi superior às observadas nos grupos vitrificados (P