GnRH analogs induce a LH peak and increase pregnancy per timed-AI in ewes.

To date, there have been no studies testing the capacity of GnRH analogs and respective doses to induce a LH peak in sheep. In this sense, the present study aimed to evaluate the capacity of different synthetic forms and doses of GnRH in inducing LH release in sheep, and the effect of GnRH administration at timed artificial insemination (TAI) on pregnancy per timed-AI. In experiment 1, ewes (n = 40) received an intravaginal device (IVD) of medroxyprogesterone acetate (MPA; 60 mg) for 7 d and prostaglandin F2α analog on Day 5. On Day 7, the ewes were allocated randomly into one of eight groups (n = 5/group), which received a GnRH analog at a specific dose, as follows: lecirelin (12.5 or 25 µg), gonadorelin (50 or 100 µg), buserelin acetate (4.2 or 8.4 µg), or deslorelin (375 or 750 µg). Blood samples for LH determination were obtained at 0, 2, 4, and 6 h after GnRH and the IVDs were removed after the last blood collection. The maximal LH concentration induced by gonadorelin at doses of 50 µg and 100 µg (12.0 ± 2.4 ng/mL and 28.6 ± 7.1 ng/mL, respectively) was lower (P < 0.05) than serum LH induced by 8.4 µg of buserelin (78.9 ± 12.9 ng/mL), 375 µg and 750 µg of deslorelin (75.6 ± 7.4 ng/mL and 72.1 ± 10.6 ng/mL, respectively) and 12.5 µg and 25 µg of lecirelin (73.3 ± 17.8 ng/mL and 61.6 ± 5.9 ng/mL, respectively). However, the maximal LH concentration induced by 4.2 µg of buserelin (49.4 ± 5.9 ng/mL) was similar (P > 0.05) to the 100 µg of gonadorelin. The total release of LH (area under the curve - AUC) after treatment with 50 µg of gonadorelin (31.7 ± 5.9 ng h/mL) was lower (P < 0.05) than after other agonists. In a second experiment, 330 ewes were treated with IVD containing MPA for 7 d. Simultaneously with IVD removal, 250 µg of cloprostenol and 200 IU of eCG were administered. Then, ewes were assigned randomly to either no further treatment (control); or to receive 4.2 µg of buserelin acetate (GnRH group) at cervical TAI, which was performed with fresh semen 54 h after IVD withdrawal in all the animals. Higher pregnancy per timed-AI was observed for GnRH (50.3 %) compared to control (40.7 %). We conclude that buserelin acetate (8.4 µg), lecirelin (12.5 and 25 µg) and deslorelin (375 and 750 µg) induced a greater stimulatory effect on LH secretion than gonadorelin treatment. Furthermore, buserelin acetate treatment at TAI increased pregnancy per timed-AI in ewes previously treated with MPA and eCG.

Use of a one-step freezing protocol for boar sperm with distinct cryoprotectants / Protocolo de congelamento one-step para sêmen suíno utilizando diferentes crioprotetores

The present study evaluated the cryoprotectant efficacy of dimethylacetamide (DMA) and ethylene glycol in a one-step protocol to freeze boar sperm. The sperm-rich portion of the ejaculates from two boars were collected once a week, for 10 weeks. After collection, the ejaculates were diluted (1:1; v/v) in the cooling extender. After determining their spermatozoa concentration, the ejaculates were pooled with the same number of spermatozoa from each boar and stabilized at 20°C for 120 min. Distinct cryoprotectants were added to the cooling extender at 20 °C, at different concentrations, composing six treatments: 1.25% and 2.5% glycerol (control); 1.25% and 2.5% ethylene glycol; 2.5% and 5.0% DMA. The samples were stored in 0.25 mL straws, containing 35 × 106 spermatozoa. After 90 min at 20 °C, the straws were submitted to a cooling curve until 5 °C (0.3 to 0.5 °C/min) and kept at 5°C for 60 min. Freezing was conducted by placing the straws horizontally 5 cm above the liquid nitrogen for 10 min, followed by immersion on liquid nitrogen. After thawing at 37 °C for 30 seconds, sperm quality was evaluated through a computer-assisted semen analysis system and flow cytometry. Sperm motility was greater (P< 0.05) in treatments with 5.0% and 2.5% DMA (22.2 ± 2.6% and 20.0 ± 2.8%, respectively) than in treatment with 2.5% ethylene glycol (8.2 ± 1.0%). The integrity of the plasma membrane (P = 0.08) and mitochondrial membrane potential (P = 0.27) was similar among the treatments. The treatment with 2.5% ethylene glycol was the least efficient to maintain intact acrosome membrane (P< 0.01). Some kinetics parameters (DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL e ALH) were positively affected by 5.0% DMA. The one-step freezing protocol resulted in unsatisfactory boar sperm motility after thawing, regardless of the cryoprotectant.

O presente estudo objetivou avaliar a eficácia de um protocolo one-step de congelamento do sêmen suíno utilizando dimetilacetamida (DMA) e etilenoglicol como crioprotetores. Durante 10 semanas, a fração rica dos ejaculados de dois machos suínos foram coletados, uma vez por semana. Após a coleta, os ejaculados foram diluídos (1:1; v/v) no diluidor de resfriamento. Após a avaliação da concentração espermática, os ejaculados foram agrupados em um pool com o mesmo número de espermatozoides de cada macho e estabilizados a 20 °C por 120 min. Os criopropetores foram adicionados ao diluidor de congelamento a 20 °C, em diferentes concentrações, compondo seis tratamentos: glicerol (controle), 1,25% e 2,5%; etilenoglicol, 1,5% e 2,5%; e DMA, 2,5% e 5,0%. As amostras foram armazendadas em palhetas de 0,25 mL contendo 35 x 106 espermatozoides. Após 90 min a 20 °C as palhetas foram submetidas a uma curva de resfriamento até 5 °C (0,3 a 0,5 °C/mim) e mantidas a 5 °C por 60 min. O congelamento foi realizado a partir da colocação das palhetas horizontalmente a 5 cm acima do nitrogênio líquido por 10 min, com sua posterior imersão no nitrogênio líquido. Após o descongelamento a 37 °C por 30 segundos a qualidade espermática foi avaliada através de um sistema computadorizado e por citometria de fluxo. A motilidade espermática foi maior (P < 0,05) nos tratamentos com 5,0% e 2,5% DMA (22,2 ± 2,6% e 20,0 ± 2,8%, respectivamente) do que no tratamento com 2,5% etilenoglicol (8,2 ± 1,0%). A integridade da membrana plasmática (P = 0,08) e potencial de membrana mitocondrial (P = 0,27) foi similar entre os tratamentos. O tratamento com 2,5% de etilenoglicol foi menos eficiente em manter membrana acrossomal intacta (P< 0,01). Alguns parâmetros de cinética espermática (DAP, DCL, DSL, VAP, VCL, VSL e ALH) foram afetados positivamente pelo uso de DMA a 5.0%. O protocolo simplificado para congelamento de sêmen suíno resultou em motilidade espermática insatifatória após o descongelamento, independente do crioprotetor utilizado.

Desafios e perspectivas na produção comercial de embriões in vivo e in vitro de raças taurinas e sintéticas / Current challenges and perspectives of in vivo and in vitro commercial embryo production of taurine and synthetic breeds

As biotécnicas de produção in vivo e in vitro de embriões bovinos permitem aumentar significativamente o número de descendentes de fêmeas genética e/ou zootecnicamente importantes. Porém, antes de se optar por um dos métodos, deve-se avaliar suas peculiaridades. A produção in vivo pode ser empregada de forma satisfatória tanto em zebuínos quanto em raças sintéticas e taurinas, permitindo a obtenção de, em média, seis a sete embriões viáveis por coleta, com boa tolerância à criopreservação. Já a produção in vitro é mais eficiente em raças zebuínas e sintéticas, visto que possuem maior número de folículos antrais aspiráveis. Além disso, esta técnica permite a produção de embriões sem estímulos hormonais exógenos, porém com menor criotolerância. Desse modo, a presente revisão discute os desafios atuais e perspectivas futuras na produção de embriões in vivo e in vitro com base nos dados da rotina de uma central de doadoras e laboratório de produção de embriões que desenvolve simultaneamente ambas as técnicas de produção de embriões na região Sul do Brasil.(AU)

Biotechniques for in vivo and in vitro production of bovine embryos allow to significantly increase the number of descendants from cows genetically and/or zootechnically superior. However, before opting for one of the methods, one should evaluate its peculiarities. In vivo production can be used satisfactorily both in zebu cattle and in synthetic and taurine breeds, allowing to obtain, on average, six to seven viable embryos per procedure, with good tolerance to cryopreservation. In vitro production is more efficient in Zebu and synthetic breeds, since they have a greater number of aspirable antral follicles. In addition, this technique allows the production of embryos without exogenous hormonal stimuli, but with lower cryotolerance. This review discusses current challenges and future perspectives in in vivo and in vitro embryo production based on routine data from an embryo production center and a laboratory that develop, simultaneously, the two embryo production techniques in southern Brazil.(AU)

Does combining estradiol cypionate and GnRH for ovulation induction in recipient cows increase pregnancy rate after timed embryo transfer?

Estradiol cypionate (EC) or GnRH have been widely used for ovulation induction in timed embryo transfer (TET). EC administration increases the proportion of cows that show estrus, whereas GnRH promotes more synchronized ovulations. The aim of the present study was to evaluate the potential beneficial effects of combining EC and GnRH in TET. In experiment 1, no difference was observed on serum progesterone concentrations on Day 6 and 13 after GnRH treatment between GnRH and EC+GnRH groups. In experiment 2, pregnancy per embryo transfer (P/ET) did not differ (p = 0.69) between GnRH (62.8%) and EC+GnRH (58.7%) groups. In conclusion, combining EC and GnRH for ovulation induction does not increase progesterone secretion and pregnancy rate after TET in cattle.

Docosahexaenoic acid and phenazine ethosulfate are not efficient lipid modulators for porcine in vitro maturation systems.

The high lipid content in porcine oocytes impairs in vitro embryo production (IVP). Here, we evaluated the influence of two different lipid modulators during in vitro maturation (IVM) on the embryo development and the lipid content of oocytes and embryos. In Experiment I, oocytes were exposed to 50 µM docosahexaenoic acid (DHA) with (+) or without (-) the presence of porcine follicular fluid (pFF). In Experiment II, phenazine ethosulfate (PES) was added during IVM at two concentrations (0.5 and 0.05 µM). The pFF- with 50 µM DHA treatment impaired nuclear maturation, cleavage and blastocyst rates (p < 0.05). Oocytes in pFF- media accumulated less lipids (p < 0.05). The addition of 0.5 µ M PES reduced all development rates (p < 0.05) and resulted in higher lipid content for oocytes and embryos. Only 0.05 µM PES oocytes matured similarly to the control (p > 0.05), although embryo development and embryo lipid content was similar to 0.5 µM PES oocytes (p > 0.05). Thus, 50 µM DHA supplementation in the IVM medium without pFF impaired oocyte maturation and embryo development rates without interfering in oocyte lipid content even in the presence of pFF. Maturation with PES neither favored porcine embryo development nor reduced their lipid content.

Manual collapse of blastocoels in not effective in increasing the viability of vitrified equine embryos / Colabamento manual da blastocele não foi efetivo para aumentar a viabilidade de embriões equinos vitrificados

Embryo cryopreservation methods have been used for commercialization and formation of genetic banks. Cryopreservation of equine embryos <300 µm in diameter, collected at days 6-6.5 after ovulation, allows satisfactory pregnancy rates. However, higher embryo collection rates in mares are obtained when uterine flush is performed between days 7 and 8 after ovulation when embryos are >300 µm in diameter, needing blastocoel collapse for satisfactory resistance to cryopreservation by vitrification. To evaluate the viability of simplified blastocoel collapse by embryo puncture with low technology and low-cost equipment, 22 embryos, collected at day 8 post-ovulation (D8), were allocated to the following groups: (1) micropuncture with a 30 G needle, assisted by a mechanical micromanipulator, before vitrification (n=4); (2) manual blade microsection before vitrification (n=6); (3) no manipulation prior to vitrification (n=8); and (4) freshly inovulated embryos (n=4). Despite the high re-expansion rates observed after vitrification, embryos manipulated prior to vitrification (groups MP and MS) did not result in pregnancy 25 days after transfer. On the other hand, embryos from groups NM (non-micromanipulated) and FR (freshly inovulated) resulted in pregnancies at 25 days. Under the conditions of the present study, manual blastocoel collapse was not efficient in increasing cryotolerance to vitrification among large embryos, requiring improvements to obtain pregnancies.(AU)

Métodos de criopreservação de embriões têm sido utilizados com diversos objetivos. Maiores taxas de coleta embrio-nária em éguas com lavagem uterina realizada 7 a 8 dias pós ovulação. A criopreservação de embriões equinos com diâmetro <300 µm (6-6,5 dias após a ovulação) permite a obtenção de taxas de prenhez satisfatórias. Embriões com diâmetro >300 µm (7º dia pós-ovulação) somente são adequadamente criopreservados quando submetidos a colabamento da blastocele. Objetivando avaliar a viabilidade da punção da blastocele com equipamento de baixa sofisticação e custo, 22 embriões coletados no 8º. dia pós-ovulação (D8) foram alocados aos seguintes grupos: (1) micropunção com uma agulha 30 G assistida por micromanipula-dor antes da vitrificação (n=4); (2) microssecção manual por lâmina antes da vitrificação (n=6); (3) sem manipulação anterior à vitrificação (n=8); e (4) transferidos a fresco (n=4). Apesar de altas taxas de reexpansão após a criopreservação, os embriões manipulados previamente a vitrificação não resultaram em prenhez aos 25 dias. Tanto os embriões não micromanipulados, quanto os transferidos a fresco resultaram em prenhezes aos 25 dias. A microssecção manual não se mostrou eficiente como método para aumento da criotolerância de embriões grandes, necessitando um aprimoramento visando a obtenção de prenhezes.(AU)

Does combining estradiol cypionate and GnRH for ovulation induction in recipient cows increase pregnancy rate after timed embryo transfer?

Estradiol cypionate (EC) or GnRH have been widely used for ovulation induction in timed embryo transfer (TET). EC administration increases the proportion of cows that show estrus, whereas GnRH promotes more synchronized ovulations. The aim of the present study was to evaluate the potential beneficial effects of combining EC and GnRH in TET. In experiment 1, no difference was observed on serum progesterone concentrations on Day 6 and 13 after GnRH treatment between GnRH and EC+GnRH groups. In experiment 2, pregnancy per embryo transfer (P/ET) did not differ (p = 0.69) between GnRH (62.8%) and EC+GnRH (58.7%) groups. In conclusion, combining EC and GnRH for ovulation induction does not increase progesterone secretion and pregnancy rate after TET in cattle.(AU)

Approaches to reduce lipids: a review of its impacts on in vitro embryo production / Abordagens para reduzir lipídeos: uma revisão sobre seus impactos na produção de embriões in vitro

In vitro embryo production (IVP) has limitations for better outcomes in blastocyst production, cryopreservation efficiency and pregnancy rates. Among the factors impairing IVP, high lipid content in both oocytes and embryos, and consequent reactive oxygen species (ROS) production, have a negative impact in embryo development and further biotechnologies. The present review aims to address techniques and strategies that collaborate to improve embryo development rates through reduction of lipid content either in the oocyte or in the embryo.(AU)

A produção in vitro de embriões (PIVE) possui limitações para melhoras na produção de blastocistos, eficiência da criopreservação e taxas de prenhez. Dentre os fatores limitantes à PIVE, o alto conteúdo lipídico tanto em oócitos quanto em embriões e a consequente produção de espécies reativas a oxigênio (ROS), possuem impacto negativo no desenvolvimento embrionário e subsequentes biotecnologias. A presente revisão visa tratar sobre tecnologias e estratégias capazes de colaborar com a melhora nas taxas de desenvolvimento embrionário através da redução do conteúdo lipídico tanto em oócitos quanto em embriões.(AU)

Efeito do estrógeno no ambiente uterino de fêmeas bovinas: Revisão / Effect of estrogen on the uterine environment of bovine females: Review

A eficiência reprodutiva na bovinocultura é essencial para a produtividade e lucratividade do sistema. O ambiente uterino tem importância fundamental para o estabelecimento e manutenção da gestação em diferentes espécies e pode ser influenciado pela ação de diversos hormônios. Sabe-se que as concentrações fisiológicas de estrógeno possuem efeito sobre a imunidade, estrutura e funcionalidade uterina. Alguns autores utilizaram administrações de estrógeno, em doses isoladas, como profilaxia ou terapia em casos de infertilidade, entretanto, não foram observados efeitos benéficos ou até mesmo houve um aumento da contaminação bacteriana. Porém, outros estudos que utilizaram repetidas doses de estrógeno demonstraram efeitos positivos no desempenho reprodutivo em vacas repetidoras. Ainda, protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) com suplementação de estrógeno ou com período prolongado de proestro têm possibilitado maiores taxas de prenhez e menos perdas gestacionais. Com base nisso, se faz necessário a realização de pesquisas que abordem o efeito do estrógeno sobre a fertilidade em condições controladas. O objetivo desta revisão é discutir aspectos relacionados a exposição ao estrógeno para prevenção ou terapia de transtornos reprodutivos com foco no ambiente uterino.(AU)

Reproductive efficiency in cattle is essential for the productivity and profitability of the system. The uterine environment has a fundamental importance for pregnancy establishment and maintenance in different species and can be influenced by the action of several hormones. It is well established that physiological concentrations of estrogen have effect on the uterine immunity, structure and functionality. Some authors evaluated estrogen administration, in single doses, for prophylaxis or therapy of infertility; however, no beneficial effects were observed, and, in some cases, there was an increase in bacterial contamination. Conversely, other studies using repeated doses of estrogen demonstrated positive effects on reproductive performance in repeat breeder cows. Furthermore, timedartificial insemination (TAI) protocols using estrogen or with prolonged proestrus are associated with increased pregnancy rates and seem to prevent pregnancy losses. Based on this, it is necessary to perform studies evaluating the effect of estrogen on fertility under controlled conditions. The objective of this review is to discuss aspects related to the exposure to estrogens to prevent or overcome reproductive disorders focusing on the uterine environment.(AU)

Approaches to reduce lipids: a review of its impacts on in vitro embryo production / Abordagens para reduzir lipídeos: uma revisão sobre seus impactos na produção de embriões in vitro

In vitro embryo production (IVP) has limitations for better outcomes in blastocyst production, cryopreservation efficiency and pregnancy rates. Among the factors impairing IVP, high lipid content in both oocytes and embryos, and consequent reactive oxygen species (ROS) production, have a negative impact in embryo development and further biotechnologies. The present review aims to address techniques and strategies that collaborate to improve embryo development rates through reduction of lipid content either in the oocyte or in the embryo.

A produção in vitro de embriões (PIVE) possui limitações para melhoras na produção de blastocistos, eficiência da criopreservação e taxas de prenhez. Dentre os fatores limitantes à PIVE, o alto conteúdo lipídico tanto em oócitos quanto em embriões e a consequente produção de espécies reativas a oxigênio (ROS), possuem impacto negativo no desenvolvimento embrionário e subsequentes biotecnologias. A presente revisão visa tratar sobre tecnologias e estratégias capazes de colaborar com a melhora nas taxas de desenvolvimento embrionário através da redução do conteúdo lipídico tanto em oócitos quanto em embriões.

Efeito do estrógeno no ambiente uterino de fêmeas bovinas: Revisão / Effect of estrogen on the uterine environment of bovine females: Review

A eficiência reprodutiva na bovinocultura é essencial para a produtividade e lucratividade do sistema. O ambiente uterino tem importância fundamental para o estabelecimento e manutenção da gestação em diferentes espécies e pode ser influenciado pela ação de diversos hormônios. Sabe-se que as concentrações fisiológicas de estrógeno possuem efeito sobre a imunidade, estrutura e funcionalidade uterina. Alguns autores utilizaram administrações de estrógeno, em doses isoladas, como profilaxia ou terapia em casos de infertilidade, entretanto, não foram observados efeitos benéficos ou até mesmo houve um aumento da contaminação bacteriana. Porém, outros estudos que utilizaram repetidas doses de estrógeno demonstraram efeitos positivos no desempenho reprodutivo em vacas repetidoras. Ainda, protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF) com suplementação de estrógeno ou com período prolongado de proestro têm possibilitado maiores taxas de prenhez e menos perdas gestacionais. Com base nisso, se faz necessário a realização de pesquisas que abordem o efeito do estrógeno sobre a fertilidade em condições controladas. O objetivo desta revisão é discutir aspectos relacionados a exposição ao estrógeno para prevenção ou terapia de transtornos reprodutivos com foco no ambiente uterino.

Reproductive efficiency in cattle is essential for the productivity and profitability of the system. The uterine environment has a fundamental importance for pregnancy establishment and maintenance in different species and can be influenced by the action of several hormones. It is well established that physiological concentrations of estrogen have effect on the uterine immunity, structure and functionality. Some authors evaluated estrogen administration, in single doses, for prophylaxis or therapy of infertility; however, no beneficial effects were observed, and, in some cases, there was an increase in bacterial contamination. Conversely, other studies using repeated doses of estrogen demonstrated positive effects on reproductive performance in repeat breeder cows. Furthermore, timedartificial insemination (TAI) protocols using estrogen or with prolonged proestrus are associated with increased pregnancy rates and seem to prevent pregnancy losses. Based on this, it is necessary to perform studies evaluating the effect of estrogen on fertility under controlled conditions. The objective of this review is to discuss aspects related to the exposure to estrogens to prevent or overcome reproductive disorders focusing on the uterine environment.

The implementation of a HACCP system improved the efficiency of a bull semen collection and processing center

Bull Semen Collection and Processing Centers (SCPC) have satisfactory control of sperm quality, but commonly lack standardized quality control of hygiene procedures. This study assessed the impact of implementing a Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) system in a bull SCPC, comparing microbial counts on various steps of semen processing, semen quality and costs across two periods (before and after the HACCP implementation). After surveying all routine activities of the SCPC, control points were identified, preventive measures were designed and corrective actions were employed, whenever necessary. Six months after HACCP implementation, the system was audited and production data covering two similar periods of two consecutive years were compared. Counts of colony forming units in samples collected from artificial vaginas, flexible tubes from the straw filling machine and from fresh and frozen semen after HACCP implementation were lower than during the previous period (P < 0.05). Improved post-thawing sperm motility, membrane integrity and acrosome integrity (P < 0.0001) and reduced rejection of semen batches and frozen doses were observed after HACCP implementation (P < 0.01), resulting in reduced opportunity costs. Thus, the implementation of a HACCP system in a bull SCPC allowed low-cost production of high-quality semen doses with reduced microbial contamination.(AU)

The implementation of a HACCP system improved the efficiency of a bull semen collection and processing center

Bull Semen Collection and Processing Centers (SCPC) have satisfactory control of sperm quality, but commonly lack standardized quality control of hygiene procedures. This study assessed the impact of implementing a Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) system in a bull SCPC, comparing microbial counts on various steps of semen processing, semen quality and costs across two periods (before and after the HACCP implementation). After surveying all routine activities of the SCPC, control points were identified, preventive measures were designed and corrective actions were employed, whenever necessary. Six months after HACCP implementation, the system was audited and production data covering two similar periods of two consecutive years were compared. Counts of colony forming units in samples collected from artificial vaginas, flexible tubes from the straw filling machine and from fresh and frozen semen after HACCP implementation were lower than during the previous period (P < 0.05). Improved post-thawing sperm motility, membrane integrity and acrosome integrity (P < 0.0001) and reduced rejection of semen batches and frozen doses were observed after HACCP implementation (P < 0.01), resulting in reduced opportunity costs. Thus, the implementation of a HACCP system in a bull SCPC allowed low-cost production of high-quality semen doses with reduced microbial contamination.

The implementation of a HACCP system improved the efficiency of a bull semen collection and processing center.

Bull Semen Collection and Processing Centers (SCPC) have satisfactory control of sperm quality, but commonly lack standardized quality control of hygiene procedures. This study assessed the impact of implementing a Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP) system in a bull SCPC, comparing microbial counts on various steps of semen processing, semen quality and costs across two periods (before and after the HACCP implementation). After surveying all routine activities of the SCPC, control points were identified, preventive measures were designed and corrective actions were employed, whenever necessary. Six months after HACCP implementation, the system was audited and production data covering two similar periods of two consecutive years were compared. Counts of colony forming units in samples collected from artificial vaginas, flexible tubes from the straw filling machine and from fresh and frozen semen after HACCP implementation were lower than during the previous period (P < 0.05). Improved post-thawing sperm motility, membrane integrity and acrosome integrity (P < 0.0001) and reduced rejection of semen batches and frozen doses were observed after HACCP implementation (P < 0.01), resulting in reduced opportunity costs. Thus, the implementation of a HACCP system in a bull SCPC allowed low-cost production of high-quality semen doses with reduced microbial contamination.

Systemic inflammatory and stress markers in cattle and sheep submitted to different reproductive procedures / Marcadores sistêmicos de inflamação e estresse em bovinos e ovinos submetidos a diferentes procedimentos reprodutivos

Previous studies have evaluated the effects of different reproductive procedures on discomfort markers in sheep and cattle. Such studies may help stimulate the adoption of techniques that are more beneficial for animal welfare. However, markers that are commonly used to evaluate discomfort are highly influenced by external factors. To overcome this, several systemic markers can be evaluated to more precisely identify stress, pain, and inflammation. Such markers include cortisol, acute phase proteins, bradykinin, and substance P. We aimed to review the potential markers of stress, pain, and inflammation, and discuss how and when they are regulated after different stimuli related to reproductive procedures in cattle and sheep. Furthermore, we aimed to review how reproductive procedures with different degrees of invasiveness cause stress and provide information that may help develop strategies to limit animal discomfort.(AU)

Estudos anteriores avaliaram o efeito de diferentes procedimentos reprodutivos sobre marcadores de desconforto em bovinos e ovinos. Tais estudos podem estimular a adoção de técnicas que preservem o bem-estar animal. Entretanto, os marcadores comumente utilizados apresentam alta influência de fatores externos. Para contornar isso, a avaliação conjunta de diferentes parâmetros sistêmicos pode ser utilizada para determinar com maior precisão a presença de estresse, dor ou inflamação, como cortisol, proteínas de fase aguda, a bradicinina e a substância P. O objetivo desta revisão é relacionar potenciais marcadores de inflamação e estresse, discutindo como e quando são regulados frente aos estímulos em bovinos e ovinos. Ainda, pretende-se revisar de que forma procedimentos reprodutivos com diferentes graus de invasividade acarretam em desconforto, fornecendo informações para a elaboração de estratégias que possibilitem minimizá-lo.(AU)

Systemic inflammatory and stress markers in cattle and sheep submitted to different reproductive procedures / Marcadores sistêmicos de inflamação e estresse em bovinos e ovinos submetidos a diferentes procedimentos reprodutivos

ABSTRACT: Previous studies have evaluated the effects of different reproductive procedures on discomfort markers in sheep and cattle. Such studies may help stimulate the adoption of techniques that are more beneficial for animal welfare. However, markers that are commonly used to evaluate discomfort are highly influenced by external factors. To overcome this, several systemic markers can be evaluated to more precisely identify stress, pain, and inflammation. Such markers include cortisol, acute phase proteins, bradykinin, and substance P. We aimed to review the potential markers of stress, pain, and inflammation, and discuss how and when they are regulated after different stimuli related to reproductive procedures in cattle and sheep. Furthermore, we aimed to review how reproductive procedures with different degrees of invasiveness cause stress and provide information that may help develop strategies to limit animal discomfort.

RESUMO: Estudos anteriores avaliaram o efeito de diferentes procedimentos reprodutivos sobre marcadores de desconforto em bovinos e ovinos. Tais estudos podem estimular a adoção de técnicas que preservem o bem-estar animal. Entretanto, os marcadores comumente utilizados apresentam alta influência de fatores externos. Para contornar isso, a avaliação conjunta de diferentes parâmetros sistêmicos pode ser utilizada para determinar com maior precisão a presença de estresse, dor ou inflamação, como cortisol, proteínas de fase aguda, a bradicinina e a substância P. O objetivo desta revisão é relacionar potenciais marcadores de inflamação e estresse, discutindo como e quando são regulados frente aos estímulos em bovinos e ovinos. Ainda, pretende-se revisar de que forma procedimentos reprodutivos com diferentes graus de invasividade acarretam em desconforto, fornecendo informações para a elaboração de estratégias que possibilitem minimizá-lo.

Microbiological and functional evaluation of an alternative device (OB®) for estrous synchronization in ewes / Avaliação microbiológica e funcional de um dispositivo vaginal alternativo (OB®) para sincronização de cio em ovelhas

The use of synthetic progestagens released by vaginal devices is an important tool to overcome the reproductive seasonality in sheep, but cost and/or subsequent vaginitis are limiting factors for their use. To identify economic, simple and innocuous alternative vaginal devices for estrous synchronization/induction protocols in sheep, this study aimed to evaluate the microbiological and functional viability of the human vaginal tampons (OB®) impregnated with medroxyprogesterone acetate (MAP) on reproductive performance of ewes. The study compared them with commercial vaginal inserts (CIDR®) and polyurethane sponges impregnated with MAP. In Experiment 1, the device loss rate, the degree of vaginitis during the device removal, the count and identification of bacterial colonies at the device insertion and removal, and efficiency in estrous synchronization and estrus temporal distribution were evaluated. Pubertal ewes at the beginning of the breeding season were randomly allocated to three experimental groups: CIDR®, PSP (polyurethane sponge) and OB®. No device losses occurred in any group, but the use of OB® caused milder signs of vaginitis than polyurethane sponges, with a similar vaginal bacterial growth and microbiota than the CIDR group. The estrus distribution was more disperse in the CIDR than PSP or OB groups. In Experiment 2, pregnancy rates using CIDR® or OB® devices were compared, with estrus manifestation (85.4 percent and 89.8 percent) and pregnancy rates (58.3 percent and 49.0 percent) being similar between groups (P>0.05), respectively. In conclusion, the use of human intra-vaginal tampons (OB®) impregnated with MAP was proven highly hygienic, practical and effective as a low-cost alternative for estrous synchronization and AI in sheep.

O uso de progestágeno sintético liberado por pessários vaginais é uma importante ferramenta para suplantar a sazonalidade reprodutiva em ovelhas. Todavia, seu uso é limitado pelo custo ou pelas subsequentes vaginites. Na busca de uma alternativa simples e de baixo custo para sincronizar estro em ovelhas, este estudo avaliou o tampão vaginal humano (OB®) impregnado com MAP, na performance reprodutiva de ovelhas, comparando com o CIDR® e as esponjas de poliuretano, estas também impregnadas com MAP. No experimento 1 foram avaliados a taxa de perdas; o grau das vaginites no momento da remoção do pessário; a contagem e identificação das colônias bacterianas; bem como a eficiência da sincronização e a distribuição temporal dos cios. As ovelhas foram aleatoriamente distribuídas em um de três grupos experimentais: CIDR, Esponjas e OB, no inicio da estação reprodutiva. Não ocorreram perdas de pessários em qualquer grupo, porém o OB causou menor grau de vaginite em relação às esponjas, com um crescimento bacteriano e microbiota similares ao grupo CIDR. A distribuição dos cios foi mais dispersa no grupo CIDR do que nos grupos Esponja ou OB. No experimento 2, foram comparados o CIDR e OB em relação à manifestação de cio (85,4 por cento e 89,8 por cento) e taxa de prenhez (58,3 por cento e 49,0 por cento), que foram similares (P<0,05). Conclui-se que o pessário OB impregnado com MAP é higiênico, de baixo custo, prático e efetivo como para a sincronização de cios e IA em ovelhas.

Expressão gênica das células do cumulus oophorus de bovinos após a vitrificação / Gene expression of bovine cumulus oophorus cells after vitrification

Um dos desafios da criobiologia continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione a manutenção da viabilidade após a criopreservação de oócitos imaturos na espécie bovina. A vitrificação tem sido a metodologia que proporciona resultados de sobrevivência após a criopreservação mais promissores para complexos cumulus-oócito (CCOs) imaturos bovinos. Entretanto, a ação dos crioprotetores sobre as células do cumulus oophorus, no que diz respeito à regulação da expressão de genes importantes nesta fase, ainda é pouco compreendida. O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e proteína de choque térmico HSP70-1 (HSP70-1) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação na solução crioprotetora (SV) composta por 20% de etileno glicol (EG) + 20% dimetil sulfóxido (DMSO) + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram selecionados e distribuídos em 4 grupos experimentais: G1, CCOs não submetidos a maturação in vitro (MIV); G2, CCOs submetidos à MIV; G3, CCOs maturados após a exposição à SV; e G4, CCOs maturados após a vitrificação com a SV. A MIV foi realizada em TCM 199, suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. A extração do RNA das amostras de células do cumulus foi realizada pelo método do fenol-clorofórmio seguido por uma etapa de captação específica do mRNA. Após a utilização da técnica de RT-PCR para a obtenção do cDNA e amplificação dos quatro fragmentos específicos, a análise dos resultados não mostrou diferença significativa entre os grupos para a abundância relativa dos transcritos de link protein (p=0,486), HAS2 (p=0,394), conexina 43 (p=0,116) e HSP70-1 (p=0,248).

A challenge of cryobiology remains in to develop a method that provides adequate results of viability after cryopreservation of immature bovine oocytes. Vitrification has been the methodology that provides most promising survival results after cryopreservation for immature bovine cumulus-oocyte complexes (COCs). However, the action of cryoprotectants on the gene expression regulation of cumulus oophorus cells is still poorly understood. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein, connexin 43 and heat shock protein 70 (HSP70-1) in cumulus oophorus cells of immature bovine oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solution (VS) containing 20% ethylene glycol (EG) + 20% dimethilsulfoxide (DMSO) + 0.5 M sucrose before in vitro maturation (IVM). The immature COCs were sellected, and allocated into four experimental groups: G1, COCs no submitted to IVM; G2, COCs submitted to IVM; G3, COCs exposed to VS and submitted to IVM; and G4, COCs vitrified with VS and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. The RNA extraction from cumulus cells samples was performed by using the phenol-chloroform followed by the specific capture of the mRNA. The mRNAs were transcribed into cDNA using RT-PCR to evaluate patterns of gene expression. The results showed no significant difference between the groups tested for the relative abundance of link protein (p=0.486), HAS2 (p=0.394), connexin 43 (p = 0.116) and HSP70-1 (p = 0.248) transcripts.

Expressão gênica das células do cumulus oophorus de bovinos após a vitrificação / Gene expression of bovine cumulus oophorus cells after vitrification

Um dos desafios da criobiologia continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione a manutenção da viabilidade após a criopreservação de oócitos imaturos na espécie bovina. A vitrificação tem sido a metodologia que proporciona resultados de sobrevivência após a criopreservação mais promissores para complexos cumulus-oócito (CCOs) imaturos bovinos. Entretanto, a ação dos crioprotetores sobre as células do cumulus oophorus, no que diz respeito à regulação da expressão de genes importantes nesta fase, ainda é pouco compreendida. O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e proteína de choque térmico HSP70-1 (HSP70-1) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação na solução crioprotetora (SV) composta por 20% de etileno glicol (EG) + 20% dimetil sulfóxido (DMSO) + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram selecionados e distribuídos em 4 grupos experimentais: G1, CCOs não submetidos a maturação in vitro (MIV); G2, CCOs submetidos à MIV; G3, CCOs maturados após a exposição à SV; e G4, CCOs maturados após a vitrificação com a SV. A MIV foi realizada em TCM 199, suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. A extração do RNA das amostras de células do cumulus foi realizada pelo método do fenol-clorofórmio seguido por uma etapa de captação específica do mRNA. Após a utilização da técnica de RT-PCR para a obtenção do cDNA e amplificação dos quatro fragmentos específicos, a análise dos resultados não mostrou diferença significativa entre os grupos para a abundância relativa dos transcritos de link protein (p=0,486), HAS2 (p=0,394), conexina 43 (p=0,116) e HSP70-1 (p=0,248).(AU)

A challenge of cryobiology remains in to develop a method that provides adequate results of viability after cryopreservation of immature bovine oocytes. Vitrification has been the methodology that provides most promising survival results after cryopreservation for immature bovine cumulus-oocyte complexes (COCs). However, the action of cryoprotectants on the gene expression regulation of cumulus oophorus cells is still poorly understood. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein, connexin 43 and heat shock protein 70 (HSP70-1) in cumulus oophorus cells of immature bovine oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solution (VS) containing 20% ethylene glycol (EG) + 20% dimethilsulfoxide (DMSO) + 0.5 M sucrose before in vitro maturation (IVM). The immature COCs were sellected, and allocated into four experimental groups: G1, COCs no submitted to IVM; G2, COCs submitted to IVM; G3, COCs exposed to VS and submitted to IVM; and G4, COCs vitrified with VS and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. The RNA extraction from cumulus cells samples was performed by using the phenol-chloroform followed by the specific capture of the mRNA. The mRNAs were transcribed into cDNA using RT-PCR to evaluate patterns of gene expression. The results showed no significant difference between the groups tested for the relative abundance of link protein (p=0.486), HAS2 (p=0.394), connexin 43 (p = 0.116) and HSP70-1 (p = 0.248) transcripts.(AU)

Vacuum-cooled liquid nitrogen increases the developmental ability of vitrified-warmed bovine oocytes

The objective of this study was to determine the effects of vacuum-cooled liquid nitrogen on the development of vitrified immature (germinal vesicle stage; GV) and mature (metaphase II; MII) bovine oocytes after re-warming. Liquid nitrogen was exposed to either atmospheric pressure or to a vacuum (300mm Hg for 45sec); the latter decreased the temperature of the liquid nitrogen to -200°C. Partially denuded oocytes were vitrified either just after selection (GV) or after 22 hours of in vitro maturation (MII) in TCM 199 medium + 10 percent of estrous mare serum. For vitrification, oocytes were firstly exposed to an intermediate solution (10 percent EG + 10 percent DMSO) for 30sec, followed by the vitrification solution (20 percent EG + 20 percent DMSO + 0.5M sucrose) for 20sec. Groups of three or four oocytes were loaded into an open-pulled-straw and directly plunged into liquid nitrogen. Oocytes were subsequently re-warmed by exposure to air (25°C) for 4sec, followed by 5 min exposure to decreasing concentrations (0.3 and 0.15M) of sucrose. Fertilization (Day 0) was done with 2 x 106 spermatozoa mL-1 (selected by a swim-up procedure) and incubated for 18 to 22 hours. Presumptive zygotes were cultured at 39°C in four-well dishes with SOFaaci medium, under 5 percent CO2 and saturated humidity. Cleavage (Day 2) and blastocyst rates (Day 8) were 33.9 and 4.2 percent, respectively, for GV stage oocytes at atmospheric pressure, 41.2 and 8.8 percent for GV oocytes under vacuum, 43.5 and 6.7 percent for MII oocytes at atmospheric pressure, and 53.6 and 10.6 percent for MII oocytes under vacuum. In conclusion, vacuum-cooled liquid nitrogen improved developmental rates of vitrified-thawed bovine oocytes.

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito do nitrogênio liquido super resfriado por vácuo no desenvolvimento, após reaquecimento, de oócitos bovinos vitrificados imaturos ou maturados. O nitrogênio líquido foi mantido em atmosfera normal ou submetido ao vácuo (300mm Hg por 45s) este último reduzindo a temperatura do nitrogênio para -200°C. Oócitos parcialmente desnudos foram vitrificados logo após a seleção (estádio de vesícula germinativa; VG), ou após 22 horas de maturação (metáfase II; MII) em meio TCM 199 + 10 por cento de soro de égua em estro. Para a vitrificação, os oócitos foram inicialmente expostos a uma solução intermediária (10 por cento EG + 10 por cento DMSO) por 30s e a seguir a uma solução de vitrificação (20 por cento EG + 20 por cento DMSO + 0,5M sacarose) por 20s. Grupos de 3 ou 4 oócitos foram envasados em palhetas estiradas e abertas e mergulhados no nitrogênio líquido. Os oócitos foram então reaquecidos por exposição ao ar (25°C) por 4s, seguido de exposição a concentrações decrescentes de sacarose (0,3 e 0,15M - 5 minutos cada). A fecundação (dia 0) foi realizada com 2 x 106 espermatozóides mL-1 (selecionados por "swim-up") e incubação por 18 a 22 horas. Os presumíveis zigotos foram cultivados a 39°C, em placas de quatro poços, com meio SOFaaci, com 5 por cento de CO2 e umidade saturada. As taxas de clivagem (Dia 2) e de blastocistos (Dia 8) obtidas foram de 33,9 e de 4,2 por cento, respectivamente, para oócitos no estágio de VG / pressão normal, de 41,2 e 8,8 por cento para oócitos VG / vácuo, 43,5 e 6,7 por cento para oócitos MII / pressão normal e de de 53,6 e 10,6 por cento para oócitos MII / vácuo. Conclui-se que o emprego de nitrogênio líquido super resfriado pelo vácuo melhora as taxas de desenvolvimento de oócitos bovinos após a vitrificação.