Comparison of techniques for corneal epithelium cell culture for the collection of conditioned medium / Comparação das técnicas de cultivo de células epiteliais da córnea para a coleta de meio condicionado

ABSTRACT Purposes: To determine the best protocol in obtaining the higher yield of conditioned culture medium to be used for the bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into corneal epithelial cells, five techniques for the primary culture of human corneal epithelial cells were evaluated. Methods: The studied culture techniques of corneal epithelial cells were: explants in culture flasks with and without hydrophilic surface treatment, on amniotic membrane, with enzymatic digestion, and by corneal scraping. The conditioned culture medium collected from these cultures was used to differentiate human bone marrow mesenchymal stem cells into corneal epithelial cells, which were characterized using flow cytometry with pan-cytokeratin and the corneal-specific markers, cytokeratin 3 and cytokeratin 12. Results: The culture technique using flasks with hydrophilic surface treatment resulted in the highest yield of conditioned culture medium. Flasks without surface treatment resulted to a very low success rate. Enzymatic digestion and corneal scraping showed contamination with corneal fibroblasts. The culture on amniotic membranes only allowed the collection of culture medium during the 1st cell confluence. The effectiveness of cell differentiation was confirmed by cytometry analysis using the collected conditioned culture medium, as demonstrated by the expressions of cytokeratin 3 (95.3%), cytokeratin 12 (93.4%), and pan-cytokeratin (95.3%). Conclusion: The culture of corneal epithelial cell explants in flasks with hydrophilic surface treatment is the best technique for collecting a higher yield of conditioned culture medium to be used to differentiate mesenchymal stem cells.

RESUMO Objetivos: Foram estudadas cinco técnicas de cultivo primário de células epiteliais de córnea humana para se determinar o melhor protocolo para a obtenção do maior rendimento de meio de cultivo condicionado para ser utilizado na diferenciação de células tronco mesenquimais para células epiteliais de córnea. Métodos: As técnicas de cultivo estudadas foram: explantes em frascos de cultivo com e sem tratamento hidrofílico de superfície, sobre membrana amniótica, com digestão enzimática e por raspado de córnea. O meio de cultivo condicionado foi coletado e as células tronco mesenquimais induzidas a se diferenciarem em células epiteliais da córnea utilizando o meio de cultivo condicionado. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo com pan-citoqueratina e com os marcadores específicos da córnea, citoqueratina 3 e citoqueratina 12. Resultados: A técnica utilizando frascos com o tratamento de superfície apresentou o maior rendimento de meio de cultivo condicionado. Os frascos sem tratamento de superfície levaram a uma taxa de sucesso muito baixa. A digestão enzimática e a raspagem da córnea mostraram contaminação das culturas com fibroblastos de córnea. A cultura sobre membranas amnióticas só permitiu a coleta do meio de cultivo condicionado durante a 1ª confluência celular. A análise de citometria de fluxo confirmou o sucesso da diferenciação celular utilizando o meio de cultivo condicionado coletado, demonstrada pela expressão de citoqueratina 3 (95,3%), citoqueratina 12 (93,4%) e pan-citoqueratina (95,3%). Conclusão: O cultivo de explantes de células tronco mesenquimais em frascos com tratamento hidrofílico de superfície é a melhor técnica para a obtenção de um alto rendimento de meio de cultivo condicionado.

Culture of rat mesenchymal stem cells on PHBV-PCL scaffolds: analysis of conditioned culture medium by FT Raman spectroscopy / Cultivo de células-tronco mesenquimais de rato sobre arcabouços de PHBV-PCL: análise do meio de cultura condicionado por espectroscopia de FT-Raman

Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(ε-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37ºC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.(AU)

As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (ε-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a [...].(AU)

Culture of rat mesenchymal stem cells on PHBV-PCL scaffolds: analysis of conditioned culture medium by FT-Raman spectroscopy / Cultivo de células-tronco mesenquimais de rato sobre arcabouços de PHBV-PCL: análise do meio de cultura condicionado por espectroscopia de FT-Raman

Abstract Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(ε-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37oC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.

Resumo As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (ε-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a análise. Não houve variações nas leituras entre as amostras estudadas, concluindo-se que a FT-Raman não atendeu às expectativas nas condições estudadas.

Culture of rat mesenchymal stem cells on PHBV-PCL scaffolds: analysis of conditioned culture medium by FT Raman spectroscopy / Cultivo de células-tronco mesenquimais de rato sobre arcabouços de PHBV-PCL: análise do meio de cultura condicionado por espectroscopia de FT-Raman

Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(ε-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37ºC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.

As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (ε-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a [...].

Culture of rat mesenchymal stem cells on PHBV-PCL scaffolds: analysis of conditioned culture medium by FT-Raman spectroscopy

Abstract Mesenchymal stem cells (MSCs) have great potential for application in cell therapy and tissue engineering procedures because of their plasticity and capacity to differentiate into different cell types. Given the widespread use of MSCs, it is necessary to better understand some properties related to osteogenic differentiation, particularly those linked to biomaterials used in tissue engineering. The aim of this study was to develop an analysis method using FT-Raman spectroscopy for the identification and quantification of biochemical components present in conditioned culture media derived from MSCs with or without induction of osteogenic differentiation. All experiments were performed between passages 3 and 5. For this analysis, MSCs were cultured on scaffolds composed of bioresorbable poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) and poly(-caprolactone) (PCL) polymers. MSCs (GIBCO®) were inoculated onto the pure polymers and 75:25 PHBV/PCL blend (dense and porous samples). The plate itself was used as control. The cells were maintained in DMEM (with low glucose) containing GlutaMAX® and 10% FBS at 37oC with 5% CO2 for 21 days. The conditioned culture media were collected and analyzed to probe for functional groups, as well as possible molecular variations associated with cell differentiation and metabolism. The method permitted to identify functional groups of specific molecules in the conditioned medium such as cholesterol, phosphatidylinositol, triglycerides, beta-subunit polypeptides, amide regions and hydrogen bonds of proteins, in addition to DNA expression. In the present study, FT-Raman spectroscopy exhibited limited resolution since different molecules can express similar or even the same stretching vibrations, a fact that makes analysis difficult. There were no variations in the readings between the samples studied. In conclusion, FT-Raman spectroscopy did not meet expectations under the conditions studied.

Resumo As células-tronco mesenquimais (MSCs) possuem grande potencial para aplicação em procedimentos terapêuticos ligados a terapia celular e engenharia de tecidos, considerando-se a plasticidade e capacidade de formação em diferentes tipos celulares por elas. Dada a abrangência no emprego das MSCs, há necessidade de se compreender melhor algumas propriedades relacionadas à diferenciação osteogênica, particularmente liga à biomateriais usados em engenharia de tecidos. Este projeto objetiva o desenvolvimento de uma metodologia de análise empregando-se a FT-Raman para identificação e quantificação de componentes bioquímicos presentes em meios de cultura condicionados por MSCs, com ou sem indução à diferenciação osteogênica. Todos os experimentos foram realizados entre as passagens 3 e 5. Para essas análises, as MSCs foram cultivadas sobre arcabouços de polímeros biorreabsorvíveis de poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato) (PHBV) e o poli (-caprolactona) (PCL). As MSCs (GIBCO®) foram inoculadas nos polímeros puros e na mistura 75:25 de PHBV / PCL (amostras densas e porosas). As células foram mantidas em DMEM (com baixa glicose) contendo GlutaMAX® e 10% de SFB a 37oC com 5% de CO2 por 21 dias. A própria placa foi usada como controle. Os meios de cultura condicionados foram coletados e analisadas em FT-Raman para sondagem de grupos funcionais, bem como possíveis variações moleculares associadas com a diferenciação e metabolismo celular. Foi possível discernir grupos funcionais de moléculas específicas no meio condicionado, como colesterol, fosfatidilinositol, triglicerídeos, forma Beta de polipeptídeos, regiões de amida e ligações de hidrogênio de proteínas, além da expressão de DNA. Na presente avaliação, a FT-Raman apresentou como uma técnica de resolução limitada, uma vez que modos vibracionais de estiramento próximos ou mesmo iguais podem ser expressos por moléculas diferente, dificultando a análise. Não houve variações nas leituras entre as amostras estudadas, concluindo-se que a FT-Raman não atendeu às expectativas nas condições estudadas.

Efeito da curcumina e três análogos ­ DMAD, DMAM E RI75 ­ sobre viabilidade, diferenciação e expressão gênica em pré-osteoblastos / Effect of curcumin and three of its analogues - DMAD, DMAM and RI75 - on pre-osteoblast cells' viability, differentiation, and gene expression

A curcumina, encontrada nos rizomas da cúrcuma (Curcuma longa L.), tem sido amplamente estudada devido aos seus potenciais benefícios à saúde que, entre outros, incluem propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e cicatrizantes. No entanto, devido à sua baixa biodisponibilidade e farmacocinética desfavorável, compostos análogos são desenvolvidos e estudados para obter melhores características biofarmacêuticas e aumentar os efeitos biológicos. Neste trabalho, avaliamos a atividade da curcumina e três de seus análogos sintéticos (DMAD, DMAM e RI75) sobre a viabilidade e diferenciação de uma linhagem celular pré-osteoblástica (MC3T3-E1). A expressão dos genes fator de crescimento endotelial vascular (vegf), do ligante 12 da quimiocina de motivo C-X-C (cxcl12) e do fator de transcrição runt- related 2 (runx2) também foi avaliada. As células foram estimuladas com curcumina e os três análogos usando concentrações de 10, 30 ou 50 µM. A curcumina e os análogos testados apresentaram nenhuma, ligeira ou moderada citotoxicidade celular em comparação com o controle negativo, após 24, 48 e 72 horas, nas concentrações testadas. Os resultados de atividade de mineralização para a curcumina e o análogo DMAD não apresentaram diferença estatística com o grupo controle, enquanto os análogos DMAM e RI75 apresentaram menor atividade de mineralização. Nenhuma das substâncias apresentou expressão gênica diferencial de cxcl12, um ativador de células endoteliais e inflamatórias. Por outro lado, em comparação com o controle, o análogo de curcumina RI75 mostrou regulação positiva de runx2 e vegf, ambos relacionados ao reparo tecidual. Os resultados sugerem que os análogos DMAD, DMAM e RI75 apresentam citotoxicidade semelhante ou inferior à curcumina natural e maior atividade biológica, com destaque para o análogo RI75, sendo substâncias com potencial promissor para biomodificações de materiais.

Curcumin, found in the rhizomes of turmeric (Curcuma longa L.), has been widely studied due to its potential health benefits which, among others, include anti inflammatory, antioxidant and healing properties. However, due to their low bioavailability and unfavorable pharmacokinetics, analogous compounds are developed and studied to obtain better biopharmaceutical characteristics and increase biological effects. In this work, we evaluated the activity of curcumin and three of its synthetic analogues (DMAD, DMAM and RI75) on the viability and differentiation of a pre-osteoblastic cell line (MC3T3-E1). The expression of the genes vascular endothelial growth factor (vegf), C-X-C motif chemokine ligand 12 (cxcl12) and runt related transcription factor 2 (runx2) was also evaluated. Cells were stimulated with curcumin and the three analogues using concentrations of 10, 30 or 50 µM. Curcumin and the analogues tested showed no, slight or moderate cellular cytotoxicity compared to the negative control, after 24, 48 and 72 hours, at the concentrations tested. The mineralization activity results for curcumin and the DMAD analogue showed no statistical difference with the control group, while the DMAM and RI75 analogues showed lower mineralization activity. None of the substances showed differential gene expression of cxcl12, an activator of endothelial and inflammatory cells. On the other hand, compared to the control, the curcumin analogue RI75 showed upregulation of runx2 and vegf, both related to tissue repair. The results suggest that the DMAD, DMAM and RI75 analogues present similar or lower cytotoxicity compared to natural curcumin and greater biological activity, especially the RI75 analogue, being, therefore, substances with promising potential for biomodification of materials.

Avaliação da diferenciação das células da medula óssea de camundongos AIRmax e AIRmin tratados com DMBA e/ou crotoxina

The development of leukemic is related to environmental and genetic factors. When exposed to aromatic hydrocarbons (PAH), such as the carcinogen and immunosuppressant 7,12-dimethylbenz(a)anthracene (DMBA), the individuals can develop neoplasias. The objective of the present study was to investigate the modulatory effects of crotoxin under the action of DMBA in the bone marrow of mice of the AIR lines. Crotoxin is the main component of Crotalus durrissus terrificus venom, responsible for high toxicity, and has an immunomodulatory, anti-inflammatory, and analgesic effect with significant therapeutic potential. In this work, we used mice phenotypically selected for maximum (AIRmax) or minimum (AIRmin) acute inflammatory response and that have low (Ahrd) or high (Ahrb1) affinity alleles of the aryl hydrocarbon receptor (AHR), conferring resistance or susceptibility to the risk of developing cancer. Mice were treated intraperitoneally with 50mg/kg DMBA and subcutaneously with 54μg/kg of Crotoxin and after 48 hours, bone marrow cells were obtained for total and differential counts. The results showed that DMBA treatment caused the depletion of immature neutrophil and monocyte bone marrow populations only in AIRmin mice. The administration of crotoxin provided a recovery of these populations in these mice. The results also showed the importance of the polymorphism of the Ahr gene concerning resistance or susceptibility to PAHs, suggesting an inhibition of the cell cycle by DMBA and a reversal of this effect by Crotoxin. Thus, new approaches should be explored to evaluate the DMBA's role in the cell cycle of different cell populations and the role of Crotoxin as a protector action.

O desenvolvimento da leucemia está relacionado a fatores ambientais e genéticos. Quando expostos a hidrocarbonetos aromáticos (HPA), como o carcinogênico e imunossupressor 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA), os indivíduos podem desenvolver neoplasias. O objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos modulatórios da crotoxina sob a ação da DMBA na medula óssea de camundongos da linhagem AIR. A crotoxina é o principal componente do veneno de Crotalus durrissus terrificius, responsável pela alta toxicidade, e tem efeito imunomodulador, anti-inflamatório e analgésico com importante potencial terapêutico. Neste trabalho, foram utilizados camundongos fenotipicamente selecionados para resposta inflamatória aguda máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) e que apresentam alelos de baixa afinidade (Ahrd) ou alta (Ahrb1) ao receptor de hidrocarboneto de aril (AHR), conferindo resistência ou suscetibilidade ao risco de desenvolver câncer. Os camundongos foram tratados por via intraperitoneal com 50mg/kg de DMBA e subcutaneamente com 54μg/kg de Crotoxina e após 48 horas, células da medula óssea foram obtidas para contagens totais e diferenciais. Os resultados mostraram que o tratamento com DMBA causou a depleção de populações imaturas de neutrófilos e monócitos da medula óssea apenas em camundongos AIRmin. A administração de crotoxina proporcionou uma recuperação dessas populações nesses camundongos. Os resultados também mostraram a importância do polimorfismo do gene Ahr em relação à resistência ou suscetibilidade aos HPA, sugerindo uma inibição do ciclo celular pela DMBA e uma reversão desse efeito pela Crotoxina. Assim, novas abordagens devem ser exploradas para avaliar o papel do DMBA no ciclo celular de diferentes populações celulares e o papel da Crotoxina como ação protetora.

Potential effect of hyaluronic acid and triamcinolone acetate, alone or combined, on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells / Efecto potencial del ácido hialurónico y del acetato de triamcinolona solos o combinados sobre la diferenciación condrogénica de células-tronco mesenquimales / Efeito potencial do ácido hialurônico e triancinolona acetonida, isolados e combinados, na diferenciação condrogênica de células-tronco mensenquimais

Abstract Background: Osteoarthritis is a complex degenerative disease with several factors contributing to joint damage. Objective: To compare the potential effect of hyaluronic acid (HA) and triamcinolone acetonide (TA), alone or combined, on the in vitro chondrogenic differentiation process of mesenchymal stem cells (MSCs). Methods: MSCs were divided into four groups: Control, HA, TA, and HA/TA combined. Each treatment group was cultured for 14 days in chondrogenic differentiation medium. The chondrogenic differentiation potential was assessed by histology and immunohistochemistry. Results: The HA and HA/TA-treated MSCs presented histological characteristics similar to native chondrocytes. The extracellular matrix (ECM) of TA-treated MSCs was compact and organized. Glycosaminoglycan staining was intense in Control, moderate in TA, slight in HA/TA, and undetectable in HA. Type II collagen immunoreactivity was high in the TA-treated ECM and MSCs. Conclusions: Histological analysis shows that HA influences morphological development similar to chondrocytes of the MSCs, but with low expression of specific cartilage molecules. The TA promotes formation of a compact and organized ECM.

Resumen Antecedentes: La osteoartritis es una enfermedad degenerativa compleja en la cual varios factores contribuyen al daño articular. Objetivo: Comparar el efecto del ácido hialurónico (HA) y acetónido de triamcinolona (TA), solos o en combinación, en el proceso de diferenciación condrogénica in vitro de células madre mesenquimales (MSCs). Métodos: Las MSCs fueron divididas en cuatro grupos: Control, HA, TA y HA/TA, y cultivadas por 14 días en medio de diferenciación condrogénica para cada tratamiento. El potencial de diferenciación condrogénica fue analizado por medio de histología e inmunohistoquímica. Resultados: Las MSCs tratadas con HA y HA/TA, presentaron características histológicas similares a los condrocitos nativos, y la matriz extracelular (ECM) de MSCs tratadas con TA fue más compacta y organizada. La tinción de glicosaminoglicanos fue intensa en el Control, moderada en TA, ligera en HA/TA, y sin tinción en HA. La inmunoreactividad para colágeno tipo II fue más alta en las MSCs y ECM tratadas con TA. Conclusión: El análisis histológico muestra que el HA influencia un desarrollo morfológico similar a los condrocitos de las MSCs, pero con baja expresión de moléculas específicas de cartílago. La TA promueve la formación de una ECM compacta y organizada.

Resumo Antecedentes: A osteoartrite é uma doença degenerativa complexa, na qual vários fatores contribuem ao dano articular. Objetivo: Comparar o efeito do ácido hialurônico (HA) e Triancinolona acetonida (TA), só ou combinado no processo de diferenciação condrogênica in vitro de células tronco mesenquimais (MSCs). Métodos: MSCs foram divididas em 4 grupos: Controle, HA, TA y HA/TA e cultivadas por 14 dias com meio de diferenciação condrogênica e seus respectivos tratamentos. O potencial de diferenciação condrogênica foi acessado por meio de histologia e imunohistoquímica. Resultados: Histologicamente, MSCs tratadas com HA e HA/TA apresentaram características semelhantes de condrócitos nativos, e a matriz extracelular de MSCs tratadas com TA foi mais compacta e organizada. A coloração para glicosaminoglicanos foi intensa no Controle, moderada no TA, leve no HA/TA e sem coloração com HA. Para os grupos tratamento, a imunoreatividade para colágeno tipo II foi maior nas células e matriz extracelular tratadas com TA. Conclusão: Mediante análise histológica, o HA influenciou o desenvolvimento morfológico semelhante a condrócitos das MSCs, mas com baixa expressão de moléculas específicas de cartilagem. A TA promoveu a formação de uma matriz extracelular compacta e organizada.

Influência da funcionalização do biovidro, preparado pela rota sonoquímica, com o fármaco teriparatida 10% na resposta celular in vitro e in vivo / Influence of bioglass functionalization, prepared by the sonochemistry route, with the 10% therapeutic drug in the cell response in vitro and in vivo

O objetivo neste estudo foi avaliar a influência do biovidro 45S5 funcionalizado com teriparatida 10% na diferenciação e atividade de células mesenquimais, e no reparo ósseo em defeitos críticos realizados em ratas ovariectomizadas. Primeiramente, o biomaterial foi produzido e caracterizado antes e após a funcionalização. Para o estudo in vitro, foram diferenciados osteoblastos obtidos a partir de células mesenquimais, isoladas de fêmures de ratas ovariectomizadas. Após diferenciação, as células foram submetidas ao MEV, MTT, conteúdo de proteína total, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de nódulos de mineralização. No estudo in vivo, foram utilizadas 40 ratas Wistar, as quais foram inicialmente divididas em dois grupos (n=20), grupo submetido à ovariectomia bilateral (OVX) e grupo submetido à cirurgia simulada de ovariectomia (Sham). Após 60 dias destes procedimentos, independente do grupo, todas as ratas foram submetidas à confecção de defeitos ósseos críticos de 5,0 mm, na calvária. No lado direito foram preenchidos com coágulo (controle), enquanto que do lado esquerdo metade dos animais receberam preenchimento no defeito ósseo de biovidro (BG) e a outra metade recebeu como material de preenchimento o biovidro funcionalizado com teriparatida 10% (BGT). Após 2 e 6 semanas, os animais foram eutanasiados (n=10). A caracterização por MEV, espectroscopia de energia dispersiva (EDS), espectroscopia de infravermelho por transformação de Fourier (FTIR) e o potencial Zeta demonstraram que as amostras após a funcionalização apresentaram características morfológicas topográficas e químicas modificadas, indicativas de que a superfície foi quimicamente alterada pelo processo de funcionalização. Na análise in vitro, observou que os grupos experimentais não foram citotóxicos, propiciaram um ambiente adequado à atividade e diferenciação celular, e ainda permitiram o espraiamento celular sobre as amostras. Na análise histológica descritiva os grupos experimentais, demonstraram neoformação óssea na região do defeito em ambos grupos e períodos. Na análise histomorfométrica, somente o grupo biovidro funcionalizado com o fármaco no grupo OVX no período de 6 semanas diferiu estatisticamente dos demais grupos (p<0,05) no período de 2 semanas. Conclui-se que estudos de longo prazo devem ser realizados para fornecer informações adicionais sobre o desempenho biológico da ação sinérgica entre os biovidros e a liberação do fármaco teriparatida(AU)

The objective of this study was to evaluate the influence of the 45S5 bioglass functionalized with 10% teriparatide on the differentiation and activity of mesenchymal cells, and on bone repair in critical defects performed in ovariectomized rats. First, the biomaterial was produced and characterized before and after functionalization. For the in vitro study, osteoblasts obtained from mesenchymal cells, isolated from femurs of ovariectomized rats, were differentiated. After differentiation, the cells were submitted to SEM, MTT, total protein content, alkaline phosphatase activity (ALP), formation of mineralization nodules. In the in vivo study, 40 Wistar rats were used, which were initially divided into two groups (n = 20), a group undergoing bilateral ovariectomy (OVX) and a group undergoing simulated ovariectomy surgery (Sham). After 60 days of these procedures, regardless of the group, all rats were subjected to the making of 5.0 mm critical bone defects at calvaria, which were filled on the right side with a clot (control) and on the left side half of the animals received filling in the bone defect of bioglass (BG) and the other half received as functional filler the bioglass functionalized with 10% teriparatide (BGT). After 2 and 6 weeks, the animals were euthanized. SEM characterization, dispersive energy spectroscopy (EDS), Fourier transformation infrared spectroscopy (FTIR) and analysis of the Zeta potential demonstrated that the samples after functionalization showed modified topographic and chemical morphological characteristics, indicating that the surface was chemically altered by the functionalization process. The experimental groups were not cytotoxic and provided an adequate environment for cell adhesion and differentiation. Additionally, the analysis performed by SEM showed that all samples allowed cell spreading. In the descriptive histological analysis, the experimental groups demonstrated characteristics of bone neoformation with the presence of bone tissue in both periods. In the histomorphometric analysis, only the bioglass group functionalized with the drug in the OVX group differed statistically from the other groups (p <0.05) in both periods. It is concluded that long-term studies must be carried out to provide additional information on the biological performance of the synergistic action between bio-glasses and the release of the drug teriparatide.Concluded that long-term studies should be carried out to provide additional information on the mechanisms necessary to evaluate the biological performance of the synergistic action between bioglasses and the release of the drug teriparatide(AU)

Galectina-3 em pacientes com pericardite constritiva crônica / Galectin-3 Levels in Patients with Chronic Constrictive Pericarditis

FUNDAMENTO: A galectina-3 (Gal-3) é uma molécula pró-inflamatória e pró-fibrótica, envolvida na patogênese da insuficiência cardíaca. O papel da Gal-3 em pacientes com pericardite constritiva crônica (PCC) não está claro. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar os níveis de Gal-3 em pacientes com PCC e correlacioná-los com parâmetros clínicos, funcionais e histológicos. MÉTODOS: Nós avaliamos prospectivamente 25 pacientes sintomáticos com PCC agendados à pericardiectomia e 21 controles sadios. Os pacientes foram submetidos à avaliação clínica, medidas de Gal-3 e peptídeo natriurético do tipo B (BNP), ecocardiografia, ressonância magnética cardíaca e teste cardiopulmonar de exercício (TCPE) no período basal. Seis meses após a pericardiectomia, repetiu-se o TCPE. Um erro alfa < 5% foi considerado estatisticamente significativo, com um intervalo de confiança de 95%. RESULTADOS: Foram incluídos 25 pacientes com idade mediana de 45 anos. A etiologia foi principalmente idiopática (n = 19, 76%), e 14 (56%) apresentaram classe funcional New York Heart Association (NYHA) III/IV. Os valores medianos de BNP e Gal-3 foram 143 (89-209) pg/dL e 14,8 (9,7-17,2) ng/mL, respectivamente. Os níveis de Gal-3 não foram estatisticamente maiores nos pacientes com PCC que em controles (p = 0,22). Não foram encontradas correlações significativas da Gal-3 com BNP, medidas ecocardiográficas e de ressonância magnética cardíaca, e achados histológicos. Após a pericardiectomia, encontrou-se uma correlação estatisticamente significativa entre Gal-3 e medidas do TCPE ­ duração do teste (r = ­0,79; p < 0,001) e tempo de exercício (r = ­0,79; p < 0,001). CONCLUSÕES: Pacientes com PCC apresentaram níveis normais de Gal-3, quando comparados aos indivíduos controles. A Gal-3 não se correlacionou com medidas morfológicas e funcionais antes da pericardiectomia. No entanto, associações entre Gal-3 e intolerância ao exercício após pericardiectomia pode sugerir um papel da Gal-3 na predição de prognóstico após a pericardiectomia.

Megacariopoyesis humana in vitro: determinación de la concentración óptima de trombopoyetina / In vitro human megacaryocytopoiesis: determination of thrombopoietin optimal concentration / Megacariópoiesis humana in vitro: determinação da concentração ótima da trombopoietina

El estudio de la megacariopoyesis humana se ha visto obstaculizado por la relativa escasez de megacariocitos en la médula ósea (0,05-0,2 % de las células medulares), lo que ha llevado a la optimización de protocolos de expansión in vitro a partir de precursores de diversos orígenes (cordón umbilical, médula ósea y sangre periférica con o sin movilización previa). Los cultivos celulares a partir de precursores han permitido la producción y el estudio tanto de megacariocitos así como de proplaquetas y plaquetas Sin embargo, la producción in vitro óptima de megacariocitos que culminen todos los estadios de diferenciación es un reto aún no resuelto. En este trabajo reportamos los hallazgos concernientes a la determinación de las condiciones y concentraciones de trombopoyetina para lograr una óptima relación entre la cantidad de trombopoyetina empleada y el porcentaje y grado de diferenciación megacariocítica en muestras obtenidas de cinco donantes alogénicos aceptados para trasplante de médula ósea.

The study of human megakaryocytopoiesis has been hampered by the relative scarcity of megakaryocytes in bone marrow (0.05-0.2 % of medullary cells), which has led to the optimization of protocols of in vitro expansion of precursors from diverse sources (umbilical cord, bone marrow and peripheral blood with or without previous mobilization). Cell cultures from different precursors have allowed the production and study of megakaryocytes as well as proplatelets and platelets. However, the in vitro production of megakaryocytes that culminate all stages of differentiation is a challenge that has not yet been resolved. In this work we report the findings related to the determination of thrombopoietin treatment conditions and concentrations to achieve an optimal relationship between the amount of thrombopoietin and the percentage and degree of megakaryocytic differentiation in five allogeneic donors that were accepted for bone marrow transplantation.

O estudo da megacariopoiese humana tem sido dificultado pela relativa escassez de megacariócitos na medula óssea (0,05-0,2 % das células medulares), o que levou à otimização dos protocolos de expansão in vitro a partir de precursores de diversas origens (cordão umbilical, medula óssea e sangue periférico com ou sem mobilização prévia). Culturas de células a partir de precursores permitiram a produção e o estudo tanto de megacariócitos e de proplaquetas e plaquetas. No entanto, a produção ótima in vitro de megacariócitos que culminam em todas as fases de diferenciação é um desafio ainda não resolvido. Neste trabalho, relatamos as descobertas relativas à determinação das condições e concentrações de trombopoietina para obter uma relação ótima entre a quantidade de trombopoietina usada e a taxa e o grau de diferenciação megacariocítica em amostras obtidas de cinco doadores alogênicos aceitos para transplante de medula óssea.

Immunophenotyping, plasticity tests and nanotagging of stem cells derived from adipose tissue of wild rodent agouti (Dasyprocta prymnolopha) / Imunofenotipagem, testes de plasticidade e marcação com nanocristais de céluas-tronco derivadas de tecido adiposo em cutias

There is a growing interest in the study of unspecialized mesenchymal stem cells, for there are still some discussions about their in vitro behavior. Regenerative medicine is a science undergoing improvement which develops treatments as cell therapy using somatic stem cells. In several studies, adipose tissue is presented as a source of multipotent adult cells that has several advantages over other tissue sources. This study aimed to characterize and evaluate the tagging of mesenchymal stem cells from the agoutis adipose tissue (Dasyprocta prymonolopha), with fluorescent intracytoplasmic nanocrystals. Fibroblast cells were observed, plastic adherent, with extended self-renewal, ability to form colonies, multipotency by differentiation into three lineages, population CD90 + and CD45 - expression, which issued high red fluorescence after the tagging with fluorescent nanocrystals by different paths and cryopreserved for future use. It is possible to conclude that mesenchymal stem cells from agouti adipose tissue have biological characteristics and in vitro behavior that demonstrate its potential for use in clinical tests.(AU)

Há um interesse crescente no estudo das células estaminais mesenquimais, não especializadas, pois ainda existem algumas discussões sobre seu comportamento in vitro. A medicina regenerativa é uma ciência em fase de crescimento que desenvolve tratamentos como terapia celular utilizando células estaminais somáticas. Em vários estudos, o tecido adiposo é apresentado como uma fonte de células adultas multipotentes que tem várias vantagens em relação a outras fontes de tecido. Este estudo teve como objetivo caracterizar e avaliar a marcação de células estaminais mesenquimais do tecido adiposo de cutias (Dasyprocta prymnolopha) com nanocristais intracitoplasmáticos fluorescentes. Observaram-se células fibroblásticas, aderentes ao plástico, com autorrenovação prolongada, capacidade de formar colônias, diferenciação em três linhagens, população CD90 + e expressão CD45, que emitiram alta fluorescência vermelha após a marcação com nanocristais fluorescentes por diferentes vias, e criopreservadas para uso futuro. É possível concluir que as células estaminais mesenquimais do tecido adiposo de cutias têm características biológicas e comportamentos in vitro que demonstram seu potencial para uso em testes clínicos.(AU)

Immunophenotyping, plasticity tests and nanotagging of stem cells derived from adipose tissue of wild rodent agouti (Dasyprocta prymnolopha) / Imunofenotipagem, testes de plasticidade e marcação com nanocristais de céluas-tronco derivadas de tecido adiposo em cutias

There is a growing interest in the study of unspecialized mesenchymal stem cells, for there are still some discussions about their in vitro behavior. Regenerative medicine is a science undergoing improvement which develops treatments as cell therapy using somatic stem cells. In several studies, adipose tissue is presented as a source of multipotent adult cells that has several advantages over other tissue sources. This study aimed to characterize and evaluate the tagging of mesenchymal stem cells from the agoutis adipose tissue (Dasyprocta prymonolopha), with fluorescent intracytoplasmic nanocrystals. Fibroblast cells were observed, plastic adherent, with extended self-renewal, ability to form colonies, multipotency by differentiation into three lineages, population CD90 + and CD45 - expression, which issued high red fluorescence after the tagging with fluorescent nanocrystals by different paths and cryopreserved for future use. It is possible to conclude that mesenchymal stem cells from agouti adipose tissue have biological characteristics and in vitro behavior that demonstrate its potential for use in clinical tests.(AU)

Há um interesse crescente no estudo das células estaminais mesenquimais, não especializadas, pois ainda existem algumas discussões sobre seu comportamento in vitro. A medicina regenerativa é uma ciência em fase de crescimento que desenvolve tratamentos como terapia celular utilizando células estaminais somáticas. Em vários estudos, o tecido adiposo é apresentado como uma fonte de células adultas multipotentes que tem várias vantagens em relação a outras fontes de tecido. Este estudo teve como objetivo caracterizar e avaliar a marcação de células estaminais mesenquimais do tecido adiposo de cutias (Dasyprocta prymnolopha) com nanocristais intracitoplasmáticos fluorescentes. Observaram-se células fibroblásticas, aderentes ao plástico, com autorrenovação prolongada, capacidade de formar colônias, diferenciação em três linhagens, população CD90 + e expressão CD45, que emitiram alta fluorescência vermelha após a marcação com nanocristais fluorescentes por diferentes vias, e criopreservadas para uso futuro. É possível concluir que as células estaminais mesenquimais do tecido adiposo de cutias têm características biológicas e comportamentos in vitro que demonstram seu potencial para uso em testes clínicos.(AU)

Fluido amniótico, alternativa eficiente para obtenção de células-tronco mesenquimais multipotentes / Amniotic fluid, efficient alternative to obtain multipotent mesenchymal stem cells

Na última década houve um crescente interesse na investigação quanto à presença de células-tronco no fluido amniótico, devido a facilidade de obtenção, isolamento e cultivo in vitro. Além disso, a utilização do fluido como fonte de células-tronco possibilita a obtenção de células com alto grau de indiferenciação e elevada taxa de proliferação in vitro e grande capacidade de diferenciação. Todas estas vantagens tornam o líquido amniótico uma fonte atrativa de células-tronco para utilização em biotecnologias reprodutivas, como a clonagem e transgênese, bem como ensaios clínicos e terapias celulares em animais para posterior utilização em seres humanos. Este artigo apresenta um panorama da pesquisa científica com células-tronco derivadas do fluido amniótico no mundo, a partir de levantamento bibliográfico de artigos científicos de pesquisadores brasileiros e estrangeiros.

In the last decade there has been a growing interest in investigation of presence of stem cells in amniotic fluid due to the ease of obtaining, isolating and in vitro culture. In addition, the use of amniotic fluid as a source of stem cells makes it possible to obtain cells with a high degree of indifferentiation and a high rate of in vitro proliferation and a great capacity for differentiation. All of these advantages make amniotic fluid an attractive source of stem cells for use in reproductive biotechnologies, such as cloning and transgenesis, as well as clinical trials in animals for further use in humans. This article presents a panorama of the scientific research with stem cells derived from amniotic fluid in the world, from a bibliographical survey of scientific articles of Brazilian and foreign researchers.

Fluido amniótico, alternativa eficiente para obtenção de células-tronco mesenquimais multipotentes / Amniotic fluid, efficient alternative to obtain multipotent mesenchymal stem cells

Na última década houve um crescente interesse na investigação quanto à presença de células-tronco no fluido amniótico, devido a facilidade de obtenção, isolamento e cultivo in vitro. Além disso, a utilização do fluido como fonte de células-tronco possibilita a obtenção de células com alto grau de indiferenciação e elevada taxa de proliferação in vitro e grande capacidade de diferenciação. Todas estas vantagens tornam o líquido amniótico uma fonte atrativa de células-tronco para utilização em biotecnologias reprodutivas, como a clonagem e transgênese, bem como ensaios clínicos e terapias celulares em animais para posterior utilização em seres humanos. Este artigo apresenta um panorama da pesquisa científica com células-tronco derivadas do fluido amniótico no mundo, a partir de levantamento bibliográfico de artigos científicos de pesquisadores brasileiros e estrangeiros.(AU)

In the last decade there has been a growing interest in investigation of presence of stem cells in amniotic fluid due to the ease of obtaining, isolating and in vitro culture. In addition, the use of amniotic fluid as a source of stem cells makes it possible to obtain cells with a high degree of indifferentiation and a high rate of in vitro proliferation and a great capacity for differentiation. All of these advantages make amniotic fluid an attractive source of stem cells for use in reproductive biotechnologies, such as cloning and transgenesis, as well as clinical trials in animals for further use in humans. This article presents a panorama of the scientific research with stem cells derived from amniotic fluid in the world, from a bibliographical survey of scientific articles of Brazilian and foreign researchers. (AU)

Expressão gênica e proteica de membros da família HOX no câncer de mama luminal / Gene and protein expression of HOX family members in luminal breast cancer

Os genes homeobox são fatores de transcrição que regulam a expressão de múltiplos genes que influenciam o crescimento celular e fazem a mediação entre o epitélio e o estroma, regulando a diferenciação específica de cada tecido. Sua expressão é comumente desregulada em tumores, e estudos indicam que estes genes atuam como oncogenes, promovendo crescimento celular e invasão, ou como supressores tumorais, devido à sua atuação nos processos de morfogênese. No caso do câncer de mama, alguns genes homeobox tem expressão aumentada e outros, reduzida, e em geral não há ocorrência de mutações. Objetivos: Este trabalho procurou estudar a expressão de membros da família HOX em carcinomas luminais da mama, e correlacionar essa expressão com características clínico-patológicas, sobrevida global e livre de doença; avaliar a correlação entre a expressão de HOXA1 e Receptor de Progesterona; avaliar a correlação da expressão de HOXB7 e de MYC, bem como comparar os resultados da expressão gênica por imunohistoquímica e RT-qPCR. Métodos: Foram selecionados 260 pacientes com Carcinoma Mamário Luminal (CML) diagnosticados entre 2007 e 2010, 29 pacientes com amostras de CML congelados no Biobanco do AC Camargo Cancer Center, todos pareados com as respectivas amostras para imunohistoquímica, e 4 casos de tecido mamário normal congelado oriundos das pacientes doadoras de amostras de tumor congeladas. A expressão gênica foi pesquisada através dos métodos de imunohistoquímica e reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa em tempo real. A técnica imunohistoquímica e os ensaios de expressão gênica foram realizados para os genes HOXA1, HOXA5, HOXA9, HOXB7, HOXB9, HOXB13, HOXC13 e HOXD3. Para a técnica de imunohistoquímica, o número de células positivas foi quantificado para cada marcador através do sistema de morfometria e escaneamento de lâminas Aperio ScanScope XT. A quantificação relativa de expressão gênica, na técnica de RT-qPCR foi realizada utilizando o software Sequence Detection System (Applied Biosystems), e calculada pelo modelo matemático descrito por Pfaffl. Todos os testes estatísticos foram realizados utilizando os softwares Excel (Microsoft 2011) e IBM SPSS, versão 24. Resultados: Houve associação com entre a expressão de HOXB7 e estadiamento patológico T ao diagnóstico (p=0,015) e entre a expressão de HOXC13 e estadiamento N ao diagnóstico (p=0,002; OR=2,61). Aumento da expressão de HOXA9 foi associado com redução da sobrevida global (p=0,031; RR: 2,331, IC95% [1,054-5,157], P=0,037). Não houve associação entre a expressão de HOXA1 e Receptor de Progesterona e/ou entre a expressão de HOXB7 e MYC. A correlação entre a expressão gênica por imunohistoquímica e RT-qPCR foi inexistente, negativa fraca ou positiva muito fraca. Conclusões: Aumento da expressão de HOXB7 é associado com pior estadiamento patológico T ao diagnóstico. Aumento da expressão de HOXC13 é associado com maior ocorrência de metástases linfonodais. Aumento da expressão de HOXA9 reduz a sobrevida global

Homeobox genes are transcription factors that regulate the expression of multiple genes which affect cell growth and make the mediation between the epithelium and the stroma, so regulating the differentiation of each specific tissue. Its expression is commonly deregulated in tumors, and studies indicate that these genes act as oncogenes, promoting cell growth and invasion, or act as tumor suppressors genes, due to its role in morphogenesis processes. In breast cancer, homeobox genes can have their increased or decreased expression, and generally there are no ocurrence of mutations. Objectives: This work aimed to study the expression of HOX family members in luminal carcinomas of the breast and to correlate this expression with clinical-pathological characteristics, global and disease-free survival; to evaluate the correlation between the expression of HOXA1 and Progesterone Receptor; to evaluate the correlation of HOXB7 and MYC expression, as well as to compare the results of the gene expression by immunohistochemistry and RT-qPCR. Methods: We selected 260 patients with Luminal Mammary Carcinoma (CML) diagnosed between 2007 and 2010, 29 patients with frozen CML samples in the AC Camargo Cancer Center Biobank, all paired with the respective samples for immunohistochemistry, and 4 cases of normal breast tissue frozen from donor patients with frozen tumor samples. Gene expression was investigated through the immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction in real time. Immunohistochemical technique and gene expression assays were performed for the genes HOXA1, HOXA5, HOXA9, HOXB7, HOXB9, HOXB13, HOXC13 and HOXD3. For the immunohistochemical technique, the number of positive cells was quantified for each marker through the morphometry and scanning system of Aperio ScanScope XT slides. The relative quantification of gene expression in the RT-qPCR technique was performed using the Sequence Detection System (Applied Biosystems) software, and calculated by the mathematical model described by Pfaffl. Results: There was an association between the expression of HOXB7 and pathological staging T at the diagnosis (p = 0.015) and between the expression of HOXC13 and staging N at diagnosis (p = 0.002, OR = 2.61). Increased expression of HOXA9 was associated with a reduction in overall survival (p = 0.031, RR = 2.331, 95% CI [1.054-5.157], P = 0.037). There was no association between the expression of HOXA1 and Progesterone Receptor and / or between the expression of HOXB7 and MYC. The correlation between the gene expression by immunohistochemistry and RT-qPCR was non-existent, negative negative or very weak positive. Conclusions: Increased expression of HOXB7 is associated with poorer T staging at diagnosis. Increased expression of HOXB13 is associated with increased occurrence of lymph node metastases. Increased expression of HOXA9 reduces overall survival

Estabelecimento de metodologia de diferenciação de células tronco embrionárias de camundongo em células precursoras de oligodendrócitos: uma plataforma para triagem de novas drogas remielinizantes / Establishment of a mouse embryonic stem cell line differentiation methodology into oligodendrocyte precursor cells: a platform for remyelinating drug screening.

The myelin sheath plays a crucial role in nerve function. In the Central Nervous System, the myelin sheath is produced by oligodendrocytes (OL), which are differentiated from oligodendrocyte precursor cells (OPC). Several neurological disorders, including multiple sclerosis, display damage in the myelin sheath and failure in the remyelination. Therefore, researching for new compounds that act in the OPCs differentiation to OLs is a promising strategy to treat demyelinating diseases. In this study, we established a methodology that allows the generation of OPCs in large quantities from two lineages of mouse embryonic stem cells (mESCs; lineages HM-1 and USP-1). Initially, mESCs were induced to differentiate into neural precursors and, later, to OPCs by adding growth factors such as FGF, EGF and PDGF. The characteristic and predominant expression of Olig2, Sox-10, PDGFRα and NG2 observed by immunofluorescence, and the double labeling of PDGFRα and NG2 by flow cytometry, confirmed the OPCs generation from mESCs. Therefore, this study shows an efficient and reproducible methodology for generating OPCs capable of being used in screening assays or in OLs lineage biology studies.

A bainha de mielina desempenha um papel crucial nas funções nervosas. No sistema nervoso central, a bainha de mielina é produzida por oligodendrócitos (OLs), os quais são diferenciados a partir de células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Em várias desordens neurológicas, entre elas, a Esclerose Múltipla, a bainha de mielina é danificada e a remielinização deixa de acontecer. Desse modo, a busca por novos compostos que atuem na diferenciação de OPCs a OLs, é um caminho promissor na terapia de doenças desmielinizantes. Neste estudo, estabelecemos uma metodologia que permitiu gerar OPCs a partir de duas linhagens de células tronco embrionárias de camundongos (mESCs – linhagens USP-1 e HM-1). Inicialmente, as mESCs foram induzidas a diferenciar em precursores neurais e, posteriormente, a OPCs, pela adição de fatores de crescimento como FGFb, EGF e PDGF-AA. A expressão característica e predominante de Olig2, Sox10, PDGFRα e NG2 observada por imunofluorescência e a dupla marcação de PDGFRα e NG2 por citometria de fluxo (com rendimentos de 88,3-87,3%) confirmaram a obtenção de OPCs a partir de mESCs. Estas células podem ser expandidas por 5 passagens adicionais e ainda serem capazes de gerar bilhões de OPC puros. Portanto, o estudo apresenta uma metodologia eficiente e reprodutível que permite a geração de um modelo a ser empregado em triagem de novas drogas ou no estudo da biologia da linhagem de OLs.

Increased expression levels of metalloprotease, tissue inhibitor of metalloprotease, metallothionein, and p63 in ectopic endometrium: an animal experimental study / Aumento nos níveis de expressão de metaloprotease, inibidor tecidual das metaloproteases, metalotioneina e p63 em endométrio ectópico: um estudo experimental animal

Abstract Objective To characterize the patterns of cell differentiation, proliferation, and tissue invasion in eutopic and ectopic endometrium of rabbits with induced endometriotic lesions via a well- known experimental model, 4 and 8 weeks after the endometrial implantation procedure. Methods Twenty-nine female New Zealand rabbits underwent laparotomy for endometriosis induction through the resection of one uterine horn, isolation of the endometrium, and fixation of tissue segment to the pelvic peritoneum. Two groups of animals (one with 14 animals, and the other with15) were sacrificed 4 and 8 weeks after endometriosis induction. The lesion was excised along with the opposite uterine horn for endometrial gland and stroma determination. Immunohistochemical reactions were performed in eutopic and ectopic endometrial tissues for analysis of the following markers: metalloprotease (MMP-9) and tissue inhibitor of metalloprotease (TIMP-2), which are involved in the invasive capacity of the endometrial tissue; and metallothionein (MT) and p63, which are involved in cell differentiation and proliferation. Results The intensity of the immunostaining for MMP9, TIMP-2, MT, and p63 was higher in ectopic endometria than in eutopic endometria. However, when the ectopic lesions were compared at 4 and 8 weeks, no significant difference was observed, with the exception of the marker p63, which was more evident after 8 weeks of evolution of the ectopic endometrial tissue. Conclusion Ectopic endometrial lesions seem to express greater power for cell differentiation and tissue invasion, compared with eutopic endometria, demonstrating a potentially invasive, progressive, and heterogeneous presentation of endometriosis.

Resumo Objetivo Caracterizar o padrão de diferenciação celular, proliferação e invasão tecidual em endométrio eutópico e ectópico de coelhas com lesões de endometriose induzidas por um modelo experimental 4 e 8 semanas após o procedimento de implantação endometrial. Métodos Vinte e nove coelhas fêmeas Nova Zelândia foram submetidas a laparotomia para indução de endometriose através da ressecção de um dos cornos uterinos, isolamento do endométrio e fixação do tecido no peritônio pélvico. Dois grupos de animais (14 animais em um grupo e 15 animais no outro) foram sacrificados 4 e 8 semanas após a indução da endometriose. A lesão foi excisada junto com o corno uterino contralateral para determinação da presença de glândulas e de estroma endometrial. Reações de imunohistoquímica foram realizadas no tecido endometrial eutópico e ectópico para análise dos seguintes marcadores: metaloprotease (MMP9) e inibidor tecidual da metaloprotease 2 (TIMP-2), os quais estão envolvidos na capacidade de invasão do tecido endometrial; e metalotioneina (MT) e p63, os quais estão envolvidos na diferenciação e proliferação celular. Resultados A intensidade da imunomarcação para MMP9, TIMP-2, MT e p63 foi mais alta nos endométrios ectópicos do que nos endométrios eutópicos. Contudo, quando as lesões foram comparadas entre 4 e 8 semanas, nenhuma diferença foi observada, com exceção do marcador p63, o qual foi mais evidente depois de 8 semanas de evolução do tecido endometrial ectópico. Conclusão Lesões endometriais ectópicas parecem expressar maior poder de diferenciação celular e de invasão tecidual comparadas com endométrios eutópicos, demonstrando o potencial de invasão, de progressão e de apresentação heterogênea da endometriose.

Regulation of muscle plasticity and trophism by fatty acids: A short review / Regulação da plasticidade e do trofismo muscular pelos ácidos graxos: uma breve revisão

Summary The skeletal muscle tissue has a remarkable ability to alter its plastic structural and functional properties after a harmful stimulus, regulating the expression of proteins in complex events such as muscle regeneration. In this context, considering that potential therapeutic agents have been widely studied, nutritional strategies have been investigated in order to improve the regenerative capacity of skeletal muscle. There is evidence of the modulatory action of fatty acids, such that oleic and linoleic acids, that are abundant in Western diets, on muscle function and trophism. Thus, fatty acids appear to be potential candidates to promote or impair the recovery of muscle mass and function during regeneration, since they modulate intracellular pathways that regulate myogenesis. This study is the first to describe and discuss the effect of fatty acids on muscle plasticity and trophism, with emphasis on skeletal muscle regeneration and in vitro differentiation of muscle cells.

Resumo O tecido muscular esquelético possui a notável capacidade plástica de alterar suas propriedades estruturais e funcionais após um estímulo lesivo, regulando a expressão de proteínas durante eventos complexos como a regeneração muscular. Nesse contexto, considerando que possíveis agentes terapêuticos vêm sendo amplamente estudados, estratégias nutricionais têm sido investigadas na perspectiva de melhorar a capacidade regenerativa do músculo esquelético. Há evidências da ação modulatória dos ácidos graxos, como os ácidos oleico e linoleico, que são abundantes nas dietas ocidentais, sobre a função muscular e o trofismo. Nesse sentido, os ácidos graxos parecem ser potenciais candidatos para promover ou prejudicar a recuperação da massa e a função muscular durante a regeneração, uma vez que modulam vias intracelulares reguladoras da miogênese. Este trabalho é o primeiro a descrever e discutir o efeito dos ácidos graxos sobre a plasticidade e o trofismo muscular, com ênfase na regeneração do músculo esquelético e na diferenciação de células musculares in vitro.

Avaliação do potencial osteogênico de células estromais da medula óssea de pacientes com escoliose / Evaluation of the osteogenic potential of bone marrow stromal cells isolated from scoliotic patients

Apesar de descrita há muitos anos em pacientes com escoliose idiopática do adolescente (EIA), a relação entre osteopenia e escoliose ainda é pouco compreendida. Mais recentemente, redução da densidade mineral óssea também foi relatada em associação com a escoliose congênita (EC). Estudos in vitro demonstraram que células estromais da medula óssea (BMSC) de pacientes com EIA apresentam diminuição na capacidade de diferenciação osteogênica e essa pode ser uma das razões pelas quais esses pacientes desenvolvem osteopenia e osteoporose. Apesar do relato da diminuição da massa óssea em pacientes com escoliose congênita (EC), não existem dados na literatura sobre a capacidade de diferenciação de BMSC desses pacientes. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial de formação óssea das BMSC de pacientes com EIA e EC, analisar sua frequência na medula óssea, sua capacidade proliferativa e o potencial de diferenciação in vitro e in vivo. BMSC foram isoladas de amostras ósseas de pacientes com EC e EIA, coletadas durante a cirurgia para correção da curvatura da coluna vertebral, e de indivíduos sem escoliose submetidos ao tratamento cirúrgico de fraturas esqueléticas. O teste de eficiência de formação de colônias mostrou frequência reduzida de BMSC isoladas de pacientes com EIA e também maior tempo de duplicação celular em relação às BMSC de pacientes com EC e controles sem escoliose. A avaliação dos marcadores de superfície CD34, CD45, CD73, CD90 e CD146 por citometria de fluxo demonstrou perfil fenotípico similar entre as BMSC dos três grupos (EC, EIA e controle). Quanto ao potencial de diferenciação in vitro, BMSC dos três grupos foram capazes de originar células das linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica. Os ensaios funcionais para avaliar o potencial de formação de tecido ósseo in vivo mostraram que as BMSC de EIA e as BMSC do grupo controle reproduziram a microarquitetura do tecido ósseo, recapitulando o microambiente da medula óssea. Embora os mecanismos celulares e moleculares que contribuem para a perda de massa óssea na EIA e EC ainda não estejam totalmente definidos, nossos resultados favorecem a hipótese de que deficiências quantitativas e qualitativas da população de BMSC possam estar implicadas, respectivamente, com a patogenia da EIA e da EC

Although reported for many years in patients with adolescent idiopathic scoliosis (AIS), the relationship between osteopenia e scoliosis is still poorly understood. Recently, decreased bone mineral density has also been described in congenital scoliosis (CS) patients. In vitro studies have shown that bone marrow stromal cells (BMSC) isolated from patients with EIA present reduced osteogenic differentiation capacity, which may be related to osteopenia. Despite reports of decreased bone mass in patients with congenital scoliosis (CS), there are no data in the literature on the differentiation potential of BMSC of those patients. Thus, the aim of this study was to evaluate the bone forming potential of BMSC of patients with AIS e CS, to analyze their frequency in the bone marrow, its proliferative capacity e the potential for differentiation in vitro e in vivo. BMSC were isolated from EC e EIA bone samples harvested during surgery for spine curvature correction, e from individuals without scoliosis submitted surgical treatment of skeletal trauma. Colony forming efficiency assay showed reduced frequency of BMSC isolated from patients with EIA e also a longer time of cell duplication compared to BMSC of patients with CS e control without scoliosis. The evaluation of the surface markers CD34, CD45, CD73, CD90, e CD146 by flow cytometry demonstrated similar phenotypic profile for BMSC from the three groups (EC, EIA e control). In relation to the potential to differentiate in vitro, BMSC from the three groups differentiated into osteogenic, chondrogenic e adipogenic lineages. Functional assays to evaluate the potential for bone tissue formation in vivo showed that BMSC from AIS e BMSC from control group reproduced the microarchitecture of bone tissue, recapitulating the microenvironment of the bone marrow. Although the cellular e molecular mechanisms contributing to bone mass loss in AIS e CS have not yet been fully established, our results favor the hypothesis that quantitative e qualitative impairment of BMSC population may be, respectively, implicated in the pathogenesis of osteopenia associated with AIS e CS