Comparison of techniques for corneal epithelium cell culture for the collection of conditioned medium / Comparação das técnicas de cultivo de células epiteliais da córnea para a coleta de meio condicionado

ABSTRACT Purposes: To determine the best protocol in obtaining the higher yield of conditioned culture medium to be used for the bone marrow mesenchymal stem cell differentiation into corneal epithelial cells, five techniques for the primary culture of human corneal epithelial cells were evaluated. Methods: The studied culture techniques of corneal epithelial cells were: explants in culture flasks with and without hydrophilic surface treatment, on amniotic membrane, with enzymatic digestion, and by corneal scraping. The conditioned culture medium collected from these cultures was used to differentiate human bone marrow mesenchymal stem cells into corneal epithelial cells, which were characterized using flow cytometry with pan-cytokeratin and the corneal-specific markers, cytokeratin 3 and cytokeratin 12. Results: The culture technique using flasks with hydrophilic surface treatment resulted in the highest yield of conditioned culture medium. Flasks without surface treatment resulted to a very low success rate. Enzymatic digestion and corneal scraping showed contamination with corneal fibroblasts. The culture on amniotic membranes only allowed the collection of culture medium during the 1st cell confluence. The effectiveness of cell differentiation was confirmed by cytometry analysis using the collected conditioned culture medium, as demonstrated by the expressions of cytokeratin 3 (95.3%), cytokeratin 12 (93.4%), and pan-cytokeratin (95.3%). Conclusion: The culture of corneal epithelial cell explants in flasks with hydrophilic surface treatment is the best technique for collecting a higher yield of conditioned culture medium to be used to differentiate mesenchymal stem cells.

RESUMO Objetivos: Foram estudadas cinco técnicas de cultivo primário de células epiteliais de córnea humana para se determinar o melhor protocolo para a obtenção do maior rendimento de meio de cultivo condicionado para ser utilizado na diferenciação de células tronco mesenquimais para células epiteliais de córnea. Métodos: As técnicas de cultivo estudadas foram: explantes em frascos de cultivo com e sem tratamento hidrofílico de superfície, sobre membrana amniótica, com digestão enzimática e por raspado de córnea. O meio de cultivo condicionado foi coletado e as células tronco mesenquimais induzidas a se diferenciarem em células epiteliais da córnea utilizando o meio de cultivo condicionado. As células foram caracterizadas por citometria de fluxo com pan-citoqueratina e com os marcadores específicos da córnea, citoqueratina 3 e citoqueratina 12. Resultados: A técnica utilizando frascos com o tratamento de superfície apresentou o maior rendimento de meio de cultivo condicionado. Os frascos sem tratamento de superfície levaram a uma taxa de sucesso muito baixa. A digestão enzimática e a raspagem da córnea mostraram contaminação das culturas com fibroblastos de córnea. A cultura sobre membranas amnióticas só permitiu a coleta do meio de cultivo condicionado durante a 1ª confluência celular. A análise de citometria de fluxo confirmou o sucesso da diferenciação celular utilizando o meio de cultivo condicionado coletado, demonstrada pela expressão de citoqueratina 3 (95,3%), citoqueratina 12 (93,4%) e pan-citoqueratina (95,3%). Conclusão: O cultivo de explantes de células tronco mesenquimais em frascos com tratamento hidrofílico de superfície é a melhor técnica para a obtenção de um alto rendimento de meio de cultivo condicionado.

First Baby Born in Brazil after Simultaneous Diagnosis through Non-Invasive and Conventional PGT-A / Primeiro bebê nascido no Brasil após diagnóstico simultâneo por PGT-A não-invasivo e convencional

Abstract Non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies (niPGT-A) aiming to assess cell-free embryonic DNA in spent culturemedia is promising, especially because it might overcome the diminished rates of implantation caused by the inadequate performance of trophectoderm (TE) biopsy. Our center is part of the largest study to date assessing the concordance between conventional PGT-A and niPGT-A, and we report here the delivery of the first baby born in Brazil using niPGT-A. The parents of the baby were admitted to our center in 2018. They did not present history of infertility, and they were interested in using in vitro fertilization (IVF) and PGT-A in order to avoid congenital anomalies in the offspring. A total of 11 (3 day-5 and 8 day-6) expanded blastocysts were biopsied, and the spent culture media (culture from day-4 to day-6) from 8 day-6 blastocysts were collected for niPGT-A. Overall, 7 embryos yielded informative results for trophectoderm (TE) and media samples. Among the embryos with informative results, 5 presented concordant diagnosis between conventional PGTA and niPGT-A, and 2 presented discordant diagnosis (1 false-positive and one falsenegative). The Blastocyst 4, diagnosed as 46, XY by both niPGT-A and conventional PGTA, was warmed up and transferred, resulting in the birth of a healthy 3.8 kg boy in February 2020. Based on our results and the recent literature, we believe that the safest current application of niPGT-A would be as a method of embryo selection for patients without an indication for conventional PGT-A. The approximate 80% of reliability of niPGT-A in the diagnosis of ploidy is superior to predictions provided by other noninvasive approaches like morphology and morphokinetics selection.

Resumo Abordagens para o teste genético pré-implantacional não-invasivo para aneuploidias (non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploidies, niPGT-A, em inglês) com o objetivo de avaliar o DNA embrionário livre são promissoras, especialmente porque estas podem reverter as menores taxas de implantação causadas por inadequada biópsia de trofectoderma (TE). Nesse contexto, nosso centro é parte do maior estudo atual que avalia as taxas de concordância entre PGT-A convencional e niPGT-A, e relatamos aqui o nascimento do primeiro bebê brasileiro após niPGT-A. Os pais do bebê foram admitidos no nosso centro em 2018. Eles não apresentavam histórico de infertilidade, e estavam interessados em utilizar os tratamentos de fertilização in vitro (FIV) e PGT-A para evitar anomalias congênitas na progênie.Umtotal de 11 blastocistos expandidos (3 do dia-5 e 8 do dia-6) foram submetidos a biópsia, e os meios de cultivo condicionados (cultivo do dia-4 ao dia-6) de 8 blastocistos do dia-6 foram coletados para niPGT-A. No total, resultados informativos para as amostras de TE e dos meios foram obtidos para sete embriões. Entre os embriões com resultado informativo, 5 apresentaram diagnóstico concordante entre PGT-A convencional e niPGT-A, e 2 apresentaram diagnóstico discordante (1 falso positivo e 1 falso negativo). O Blastocisto 4, diagnosticado como 46, XY por ambos niPGT-A e PGT-A convencional, foi desvitrificado e transferido, o que resultou no nascimento de ummenino saudável, que pesava 3,8 kg, em fevereiro de 2020. Com base em nossos resultados e literatura contemporânea, acreditamos que a aplicação atualmais segura do niPGT-A seria como método de seleção embrionária para pacientes sem indicação ao PGT-A convencional. A confiabilidade aproximada de 80% do niPGT-A para determinação da ploidia ainda é superior àquela obtida com abordagens não invasivas, como seleção morfológica ou morfocinética.

Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.(AU)

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.(AU)

Influência do hepes na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro / Influence of hepes on in vitro maturation of canine oocytes in different stages of the estrous cycle

Diferentemente de outras espécies domésticas, a maturação in vitro (MIV) de oócitos caninos apresenta sucesso limitado. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do HEPES na maturação in vitro de oócitos caninos obtidos de cadelas em diestro e anestro. Os ovários foram coletados, isolados assepticamente e transportados refrigerados a uma temperatura de 4 ºC. Os complexos cumulus-oócito (CCOs), provenientes das duas fases do ciclo estral, foram submetidos a dois tratamentos: meio TCM-199 com adição de 25 mM de HEPES (GT) e meio sem suplementação (GC). Depois de 72 horas de maturação, os CCOs foram desnudados, fixados e corados com HOESCHT 33342 para avaliação da maturação nuclear. Os oócitos obtidos da fase de anestro e diestro do GT demonstraram, em relação ao grupo GC, maior frequência de oócitos nos estágios de M-II (p<0,01). Comparando-se os diferentes status reprodutivos, observou-se que os oócitos obtidos da fase de diestro apresentaram índices maiores de QVG e M-II. Nossos resultados demonstraram que o HEPES preserva a viabilidade e morfologia oocitária, indispensáveis para a aquisição da competência meiótica, potencializando as taxas de M-II, e que os oócitos obtidos da fase de diestro estão mais aptos a completarem a maturação oocitária.

Unlike other domestic animals, in vitro maturation (IVM) of canine oocytes still has limited success. The aim of this study was to evaluate the effect of HEPES on the in vitro maturation of dog oocytes in anestrus and diestrus. Ovaries were collected, aseptically isolated and transported refrigerated at a temperature of 4ºC. Cumulus-oocyte complexe (COCs) from the two phases of estrous cycle were subjected to two treatments: medium TCM-199 with addition of 25 mM HEPES (TG) and medium without supplementation (CG). After 72 h of maturation, COCs were denuded, fixed and stained with Hoechst 33342 to assess nuclear maturation. The oocytes obtained from the anestrus and diestrus phases of the TG showed a higher frequency of oocytes in metaphase II (M-II) (p <0.01) stage.Comparing the different reproductive status, it was observed that the oocytes obtained from the diestrus phase presented higher rates of GVBD (germinal vesicle breakdown) and M-II. Our results showed that HEPES preserves the viability and oocyte morphology essential for the acquisition of meiotic competence, increasing the M-II rates and that the oocytes obtained from the diestrus phase are better able to complete oocyte maturation.

Use of natural antioxidants in in vitro mammalian embryo production / Uso de antioxidantes naturais na produção in vitro de embriões de mamíferos

In vitro embryo production (IVEP) contributes to the quantitative and qualitative aspects of animal reproduction. Nevertheless, inherent technical factors such as oxidative stress can negatively influence the result and this can impair cell metabolism, thus decreasing the rates of in vitro development, and necessitating the supplementation of culture medium with antioxidants. In this context, compounds of natural origin with this property have been highlighted because of the positive results obtained at different stages of IVEP. Thus, this review aims to present the results obtained by using natural antioxidants to minimize the effects of oxidative stress on gametes and embryos. A variety of natural isolated substances and mixtures (essential oils and extracts) have been studied for supplementation of IVEP media, at stages of in vitro maturation, sperm capacitation, in vitro fertilization, and in vitro development of embryos in different mammalian species. Generally, beneficial effects are observed according to the concentration used, thus demonstrating the potential of several natural antioxidants. Therefore, the main challenges in using these compounds as antioxidants during IVEP include proving their efficiency against free radicals and determining the best concentration at each stage. In addition, understanding the mechanisms of action of such antioxidants is crucial...(AU)

A produção in vitro de embriões (PIVE) contribui para os aspectos quantitativos e qualitativos da reprodução animal. Contudo, fatores inerentes da técnica, como o estresse oxidativo, podem influenciar negativamente o resultado e isso pode prejudicar o metabolismo celular, diminuindo assim as taxas de desenvolvimento in vitro, e exigindo a suplementação do meio de cultivo com antioxidantes. Neste contexto, os compostos de origem natural com essa propriedade têm se destacado devido aos resultados positivos obtidos em diferentes estágios da PIVE. Assim, esta revisão pretende apresentar os resultados obtidos usando antioxidantes naturais para minimizar os efeitos do estresse oxidativo em gametas e embriões. Uma variedade de substâncias isoladas e de misturas naturais (óleos essenciais e extratos) tem sido estudada para a suplementação de meios de PIVE, nas etapas de maturação in vitro, capacitação espermática, fecundação in vitro e desenvolvimento in vitro de embriões em diferentes espécies de mamíferos. Geralmente, os efeitos benéficos são observados de acordo com a concentração utilizada, demostrando assim o potencial positivo de vários antioxidantes naturais. Portanto, os principais desafios para o uso desses compostos como antioxidantes durante a PIVE incluem provar sua eficiência contra os radicais livres e determinar a melhor concentração em cada etapa. Além disso...(AU)

Use of natural antioxidants in in vitro mammalian embryo production / Uso de antioxidantes naturais na produção in vitro de embriões de mamíferos

In vitro embryo production (IVEP) contributes to the quantitative and qualitative aspects of animal reproduction. Nevertheless, inherent technical factors such as oxidative stress can negatively influence the result and this can impair cell metabolism, thus decreasing the rates of in vitro development, and necessitating the supplementation of culture medium with antioxidants. In this context, compounds of natural origin with this property have been highlighted because of the positive results obtained at different stages of IVEP. Thus, this review aims to present the results obtained by using natural antioxidants to minimize the effects of oxidative stress on gametes and embryos. A variety of natural isolated substances and mixtures (essential oils and extracts) have been studied for supplementation of IVEP media, at stages of in vitro maturation, sperm capacitation, in vitro fertilization, and in vitro development of embryos in different mammalian species. Generally, beneficial effects are observed according to the concentration used, thus demonstrating the potential of several natural antioxidants. Therefore, the main challenges in using these compounds as antioxidants during IVEP include proving their efficiency against free radicals and determining the best concentration at each stage. In addition, understanding the mechanisms of action of such antioxidants is crucial...

A produção in vitro de embriões (PIVE) contribui para os aspectos quantitativos e qualitativos da reprodução animal. Contudo, fatores inerentes da técnica, como o estresse oxidativo, podem influenciar negativamente o resultado e isso pode prejudicar o metabolismo celular, diminuindo assim as taxas de desenvolvimento in vitro, e exigindo a suplementação do meio de cultivo com antioxidantes. Neste contexto, os compostos de origem natural com essa propriedade têm se destacado devido aos resultados positivos obtidos em diferentes estágios da PIVE. Assim, esta revisão pretende apresentar os resultados obtidos usando antioxidantes naturais para minimizar os efeitos do estresse oxidativo em gametas e embriões. Uma variedade de substâncias isoladas e de misturas naturais (óleos essenciais e extratos) tem sido estudada para a suplementação de meios de PIVE, nas etapas de maturação in vitro, capacitação espermática, fecundação in vitro e desenvolvimento in vitro de embriões em diferentes espécies de mamíferos. Geralmente, os efeitos benéficos são observados de acordo com a concentração utilizada, demostrando assim o potencial positivo de vários antioxidantes naturais. Portanto, os principais desafios para o uso desses compostos como antioxidantes durante a PIVE incluem provar sua eficiência contra os radicais livres e determinar a melhor concentração em cada etapa. Além disso...

Use of natural antioxidants in in vitro mammalian embryo production / Uso de antioxidantes naturais na produção in vitro de embriões de mamíferos

In vitro embryo production (IVEP) contributes to the quantitative and qualitative aspects of animal reproduction. Nevertheless, inherent technical factors such as oxidative stress can negatively influence the result and this can impair cell metabolism, thus decreasing the rates of in vitro development, and necessitating the supplementation of culture medium with antioxidants. In this context, compounds of natural origin with this property have been highlighted because of the positive results obtained at different stages of IVEP. Thus, this review aims to present the results obtained by using natural antioxidants to minimize the effects of oxidative stress on gametes and embryos. A variety of natural isolated substances and mixtures (essential oils and extracts) have been studied for supplementation of IVEP media, at stages of in vitro maturation, sperm capacitation, in vitro fertilization, and in vitro development of embryos in different mammalian species. Generally, beneficial effects are observed according to the concentration used, thus demonstrating the potential of several natural antioxidants. Therefore, the main challenges in using these compounds as antioxidants during IVEP include proving their efficiency against free radicals and determining the best concentration at each stage. In addition, understanding the mechanisms of action of such antioxidants is crucial to est

A produção in vitro de embriões (PIVE) contribui para os aspectos quantitativos e qualitativos da reprodução animal. Contudo, fatores inerentes da técnica, como o estresse oxidativo, podem influenciar negativamente o resultado e isso pode prejudicar o metabolismo celular, diminuindo assim as taxas de desenvolvimento in vitro, e exigindo a suplementação do meio de cultivo com antioxidantes. Neste contexto, os compostos de origem natural com essa propriedade têm se destacado devido aos resultados positivos obtidos em diferentes estágios da PIVE. Assim, esta revisão pretende apresentar os resultados obtidos usando antioxidantes naturais para minimizar os efeitos do estresse oxidativo em gametas e embriões. Uma variedade de substâncias isoladas e de misturas naturais (óleos essenciais e extratos) tem sido estudada para a suplementação de meios de PIVE, nas etapas de maturação in vitro, capacitação espermática, fecundação in vitro e desenvolvimento in vitro de embriões em diferentes espécies de mamíferos. Geralmente, os efeitos benéficos são observados de acordo com a concentração utilizada, demostrando assim o potencial positivo de vários antioxidantes naturais. Portanto, os principais desafios para o uso desses compostos como antioxidantes durante a PIVE incluem provar sua eficiência contra os radicais livres e determinar a melhor concentração em

In vitro culture of somatic cells derived from ear tissue of collared peccary (Pecari tajacu Linnaeus, 1758) in medium with different requirements / Cultivo in vitro de células somáticas derivadas de tecido auricular de cateto (Pecari tajacu Linnaeus, 1758) em meio com diferentes requerimentos

The maintenance of metabolic activities during the in vitro culture of somatic cells of wild animals, especially collared peccary (Pecari tajacu), is an interesting step in conservation of these cells for the use in nuclear transfer. In this context, it is necessary to optimize the culture conditions of somatic cells by the establishment of appropriate supplementation to the media. Therefore, this study aimed to analyze the composition of the culture means of somatic cell derived from ear tissue of collared peccaries, evaluating concentrations of fetal bovine serum (FBS; 10% vs. 20%) and epidermal growth factor (EGF; 5ng/mL vs. 10ng/mL). Tissues were submitted to primary culture and subcultures for 40 days and cells were analyzed for morphology, adhesion, subconfluence, and proliferative activity to develop the growth curve and to determine the population doubling time (PDT), viability, and functional/metabolic activity. No difference was observed between the concentrations of FBS for several parameters, except for viability [FBS10: 85.6% vs. FBS20: 98.2%], PDT [FBS10: 155.4h vs. 77.2h], and functional/metabolic assay [FBS10: 0.57-0.55 vs. FBS20: 0.82-0.99 (D5-D7)]. For the EGF in culture, no difference was observed in the evaluated parameters. In all experiments, the growth curves were typical S-shape and the cells passed through a lag, logarithmic, and plateau phase. In conclusion, 20% FBS is suitable for the recovery of somatic cells; nevertheless, EGF does not improve the quality of growing these cells. To our knowledge, this is the first study culturing somatic cells of collared peccaries.(AU)

A manutenção das atividades metabólicas durante o cultivo in vitro de células somáticas de animais silvestres, especialmente cateto (Pecari tajacu), é uma etapa interessante na conservação dessas células para o uso na transferência nuclear. Nesse contexto, é necessário aperfeiçoar as condições de cultivo de células somáticas pelo estabelecimento de suplementações apropriadas aos meios. Portanto, este estudo objetivou analisar a composição dos meios de cultivo de células somáticas derivadas de tecido auricular de catetos, avaliando concentrações de soro fetal bovino (SFB; 10% vs. 20%) e fator de crescimento epidermal (EGF; 5 ng/mL vs. 10 ng/mL). Para tanto, tecidos foram submetidos ao cultivo primário e subcultivos por 40 dias e células foram analisadas por morfologia, adesão, subconfluência, e atividade proliferativa pelo desenvolvimento da curva de crescimento e determinação do time de duplicação da população (PDT), viabilidade, e atividade funcional/metabólica. Nenhuma diferença foi observada entre as concentrações de SFB para os vários parâmetros, exceto para viabilidade [SFB10: 85,6% vs. SFB20: 98,2%], PDT [SFB10: 155,4 h vs. 77,2 h], e atividade funcional/metabólica [SFB10: 0,57-0,55 vs. SFB20: 0,82-0,99 (D5-D7)]. Para o EGF em cultivo, nenhuma diferença foi observada nos parâmetros avaliados. Em todos os experimentos, as curvas de crescimento foram típicas de forma S e as células passaram por uma fase lag, logarítmica e platô. Em conclusão, 20% de SFB é adequado para a recuperação de células somáticas; contudo, EGF não melhora a qualidade de crescimento dessas células. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro estudo cultivando células somáticas de catetos.(AU)

In vitro culture of somatic cells derived from ear tissue of collared peccary (Pecari tajacu Linnaeus, 1758) in medium with different requirements / Cultivo in vitro de células somáticas derivadas de tecido auricular de cateto (Pecari tajacu Linnaeus, 1758) em meio com diferentes requerimentos

The maintenance of metabolic activities during the in vitro culture of somatic cells of wild animals, especially collared peccary (Pecari tajacu), is an interesting step in conservation of these cells for the use in nuclear transfer. In this context, it is necessary to optimize the culture conditions of somatic cells by the establishment of appropriate supplementation to the media. Therefore, this study aimed to analyze the composition of the culture means of somatic cell derived from ear tissue of collared peccaries, evaluating concentrations of fetal bovine serum (FBS; 10% vs. 20%) and epidermal growth factor (EGF; 5ng/mL vs. 10ng/mL). Tissues were submitted to primary culture and subcultures for 40 days and cells were analyzed for morphology, adhesion, subconfluence, and proliferative activity to develop the growth curve and to determine the population doubling time (PDT), viability, and functional/metabolic activity. No difference was observed between the concentrations of FBS for several parameters, except for viability [FBS10: 85.6% vs. FBS20: 98.2%], PDT [FBS10: 155.4h vs. 77.2h], and functional/metabolic assay [FBS10: 0.57-0.55 vs. FBS20: 0.82-0.99 (D5-D7)]. For the EGF in culture, no difference was observed in the evaluated parameters. In all experiments, the growth curves were typical S-shape and the cells passed through a lag, logarithmic, and plateau phase. In conclusion, 20% FBS is suitable for the recovery of somatic cells; nevertheless, EGF does not improve the quality of growing these cells. To our knowledge, this is the first study culturing somatic cells of collared peccaries.(AU)

A manutenção das atividades metabólicas durante o cultivo in vitro de células somáticas de animais silvestres, especialmente cateto (Pecari tajacu), é uma etapa interessante na conservação dessas células para o uso na transferência nuclear. Nesse contexto, é necessário aperfeiçoar as condições de cultivo de células somáticas pelo estabelecimento de suplementações apropriadas aos meios. Portanto, este estudo objetivou analisar a composição dos meios de cultivo de células somáticas derivadas de tecido auricular de catetos, avaliando concentrações de soro fetal bovino (SFB; 10% vs. 20%) e fator de crescimento epidermal (EGF; 5 ng/mL vs. 10 ng/mL). Para tanto, tecidos foram submetidos ao cultivo primário e subcultivos por 40 dias e células foram analisadas por morfologia, adesão, subconfluência, e atividade proliferativa pelo desenvolvimento da curva de crescimento e determinação do time de duplicação da população (PDT), viabilidade, e atividade funcional/metabólica. Nenhuma diferença foi observada entre as concentrações de SFB para os vários parâmetros, exceto para viabilidade [SFB10: 85,6% vs. SFB20: 98,2%], PDT [SFB10: 155,4 h vs. 77,2 h], e atividade funcional/metabólica [SFB10: 0,57-0,55 vs. SFB20: 0,82-0,99 (D5-D7)]. Para o EGF em cultivo, nenhuma diferença foi observada nos parâmetros avaliados. Em todos os experimentos, as curvas de crescimento foram típicas de forma S e as células passaram por uma fase lag, logarítmica e platô. Em conclusão, 20% de SFB é adequado para a recuperação de células somáticas; contudo, EGF não melhora a qualidade de crescimento dessas células. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro estudo cultivando células somáticas de catetos.(AU)

Efeito do tamanho da semente, subtrato ambiente na produção de mudas de Copernicia Hospita Martius / Effect of seed size, substrate, and environment on the production of Copernicia hospita Martius seedlings

A carnaúba hospedeira faz parte de um grupo de plantas da família Arecaceae, de relevante importância social e econômica para as regiões tropicais. Neste trabalho, objetivou-se determinar a influência do tamanho da semente, tipo de substrato e do ambiente na produção de mudas de carnaúba hospedeira (Copernicia hospita Martius). As sementes de diferentes tamanhos (pequena, média, grande e mistura) foram semeadas em substratos constituídos de areia vermelha + bagana de carnaúba + húmus (2,5:2,5:1 em volume) e solo + arisco + composto orgânico Polefértil (2:2:1 em volume) e cultivadas em ambientes distintos (pleno sol e casa de vegetação). As variáveis analisadas foram: comprimento do limbo foliar principal, área foliar, diâmetro do coleto, comprimento da maior raiz e massa da matéria seca da parte aérea e radicular. O tamanho da semente exerceu efeito significativo sobre todas as variáveis. O substrato influenciou, significativamente, o comprimento do limbo e da maior raiz e área foliar. Quanto ao ambiente, as únicas variáveis não afetadas por esse fator foram as produções de matéria seca, tanto da parte aérea como radicular. Para a produção de mudas de C. hospita recomenda-se a utilização de sementes grandes, semeadas no substrato constituído de areia vermelha + bagana de carnaúba + húmus, em cultivo a pleno sol.

The 'Hostess' Carnauba belongs to a group of plants from the Arecaceae family, which is of relevant social and economic importance for tropical areas in Brazil. The objective of this research was to study the effect of the size of the seed , substrate, and environment on the production of seedlings of 'Hostess' Carnauba (Copernicia hospita Martius). Seeds of different sizes (small, medium, large, and a mixture of different sizes) were planted in different substrates composed of red sand + carnauba straw + humus (2,5:2,5:1 in volume) and soil + dark sand + organic compost Polefértil (2:2:1 in volume), and cultivated in different environments (outdoors and indoors). The analyzed variables were: leaf length , leaf area, stem diameter, length of the longest root, and dry matter of the above and below ground parts. The size of the seed greatly affected all of the studied variables. Substrate type significantly affected leaf length, length of the longest root, and leaf area. The only variables not affected by the environment were of the dry matter from above and below ground parts. Thus, the results suggest that large seeds should be recommended for the production of C. hospita seedlings, and should be planted in a subtract composed of red sand + carnauba straw + humus for unshaded outdoor cultivation.