A Protocol to Perform Systemic Lipopolysacharide (LPS) Challenge in Rats / Protocolo para realizar reto sistémico con lipopolisacárido (LPS) en ratas

Abstract 19. Lipopolysaccharide (LPS) is a component of the outer membrane of Gram-negative bacteria. In animals, intraperitoneal administration of LPS, stimulates innate immunity and the production of proinflammatory cytokines. LPS provides an inflammatory stimulus that activates the neuroimmune and neuroendocrine systems resulting in a set of responses termed sickness behavior. The purpose of this protocol is to describe step-by-step the preparation and procedure of application of intraperitoneal injection of LPS in rats, as a guide for those researchers that want to use this assay to mount an inflammatory response. LPS intraperitoneal challenge in rats has been widely used to evaluate antiinflammatory reagents and to address basic scientific questions.

Resumen 23. El lipopolisacárido (LPS) es un componente de la membrana externa de las bacterias Gram negativas. En animales, la administración intraperitoneal de LPS estimula la inmunidad innata y la producción de citoquinas proinflamatorias. El LPS proporciona un estímulo inflamatorio que activa el sistema neuroinmunológico y el sistema neuroendocrino, lo que da como resultado un conjunto de respuestas denominadas conductas de enfermedad. El propósito de este protocolo es describir paso a paso la preparación y el procedimiento de aplicación de la inyección intraperitoneal de LPS en ratas, como una guía para aquellos investigadores que desean utilizar este método para estimular una respuesta inflamatoria en el animal. La estimulación con LPS en ratas, aplicada intraperitonealmente, se ha utilizado ampliamente para evaluar reactivos antiinflamatorios y para abordar preguntas básicas de investigación científica.

Acrocomia crispa fruits lipid extract prevents LPS-induced acute lung injury in mice / Extracto lipídico de los frutos de Acrocomia crispa previene el daño pulmonar agudo inducido por LPS en ratones

The aim of this study was to evaluate the effects of single oral doses of D-005 (a lipid extract obtained from the fruit oil of Acrocomia crispa) on LPS-induced acute lung injury (ALI) in mice. D-005 batch composition was: lauric (35.8%), oleic (28.4%), myristic (14.2%), palmitic (8.9%), stearic (3.3%), capric (1.9%), caprylic (1.2%), and palmitoleic (0.05%) acids, for a total content of fatty acids of 93.7%. D-005 (200 mg/kg) significantly reduced lung edema (LE) (≈ 28% inhibition) and Lung Weight/Body Weight ratio (LW/BW) (75.8% inhibition). D-005 (25, 50, 100 and 200 mg/kg) produced a significant reduction of Histological score (59.9, 56.1, 53.5 and 73.3% inhibition, respectively). Dexamethasone, as the reference drug, was effective in this experimental model. In conclusion, pretreatment with single oral doses of D-005 significantly prevented the LPS-induced ALI in mice.

El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de dosis orales únicas de D-005 (extracto lipídico obtenido del aceite de frutos de Acrocomia crispa) sobre el daño pulmonar agudo (DPA) inducido por LPS en ratones. La composición del lote de D-005 fue: ácido láurico (35.8%), oleico (28.4%), mirístico (14.2%), palmítico (8.9%), esteárico (3.3%), cáprico (1.9%), caprílico (1.2%) y palmitoleico (0.05%), con un contenido total de ácidos grasos de 93.7%. D-005 (200 mg/kg) redujo significativamente el edema pulmonar (EP) (≈ 28% de inhibición) y la relación peso pulmón/peso corporal (PP/PC) (75.8% de inhibición). D-005 (25, 50, 100 y 200 mg/kg) produjo una reducción significativa de la puntuación histológica (59.9, 56.1, 53.5 y 73.3% de inhibición, respectivamente). La dexametasona, fármaco de referencia, fue efectiva en este modelo experimental. En conclusión, el pretratamiento con dosis orales únicas de D-005 previno significativamente el DPA inducido por LPS en ratones.

Distribution and expression of visfatin-positive cells in the spleen of lipopolysaccharide-stimulated piglets / Distribución y expresión de células visfatin positivas en el bazo de lechones estimulados con lipopolisacáridos

The histological changes in the spleen and the immunohistochemical expression of visfatin in lipopolysaccharide-stimulated piglets are reported to examine the relation between visfatin and inflammation. The results are as follows: (1) After LPS treated, the spleen displayed thicker capsules and trabecula, the thinner periarterial lymphatic sheath, and the more expandable splenic sinusoid, with an increase in the number of splenic nodules, lymphocytes, ellipsoids of the marginal zone, red blood cells and macrophagocytes. (2) Visfatin-positive cells were mainly distributed in the red pulp of the spleen, with less in splenic nodules and periarterial lymphatic sheath. In the LPS-treated group, the signal intensity and quantity of the visfatin-positive cells were significantly higher in the red pulp and the ellipsoids of the spleen (P<0.01), whereas lower in the periarterial lymphatic sheath. These results indicate that LPS stimulation induces inflammation, causing the histological changes of the piglet spleen and activating humoral immune response. Moreover, variation of visfatin in the spleen suggests that lymphocytes and macrophages are the potent source of visfatin which participates in the humoral immune response in the inflammation.

Se presentan los cambios histológicos en el bazo y la expresión inmunohistoquímica de visfatin en lechones estimulados mediante lipopolisacáridos (LPS) con el objetivo de estudiar la relación entre visfatin e inflamación. Los resultados fueron los siguientes: (1) Después del tratamiento por LPS se observaron en el bazo cápsulas más gruesas y trabéculas, una vaina linfática periarterial más delgada, y más sinusoides esplénicos expandible, con un aumento en el número de nódulos esplénicos, linfocitos, elipsoides de la zona marginal, como también un aumento de las células rojas de la sangre y los macrofagocitos. (2) Las células visfatina-positivas se distribuyeron principalmente en la pulpa roja del bazo, con una cantidad menor en los nódulos esplénicos y la vaina linfática periarterial. En el grupo tratado con LPS, la intensidad de la señal y número de células positivas fueron significativamente mayor en la pulpa roja y los elipsoides del bazo (P<0,01), mientras que estas fueron menores en la vaina linfática periarterial. Estos resultados indican que la estimulación con LPS induce la inflamación provocando cambios histológicos del bazo de los lechones y la activación de la respuesta inmune humoral. Por otra parte, la variación de visfatin en el bazo sugiere que los linfocitos y los macrófagos son una fuente potente de visfatin en la respuesta inmune humoral de la inflamación.

Papel protector de las lipoproteínas de alta densidad en sepsis: aspectos básicos e implicancias clínicas / Protective role of high density lipoproteins in sepsis: basic issues and clinical implications

High density lipoproteins (HDL) are responsible of reverse cholesterol transport and play an important antiatherogenic role. In recent years, several studies suggest that HDL have additional functions, including a possible anti-inflammatory activity in infectious conditions. Furthermore, available evidence indicates that the presence of lipopolysaccharide (LPS) within the circulation during infectious states induced by gram-negative bacteria may be involved in the decrease in HDL cholesterol levels and changes in lipoprotein composition, which have been associated with a higher mortality due to sepsis in animal models and in humans. In this article, we review this subject and also discuss possible mechanisms that explain the positive impact achieved by native HDL, reconstituted HDL, or HDL apolipoprotein peptides on the inflammatory response and mortality in models of endotoxemia. In this regard, it has been proposed that one of the mechanisms by which HDL protect against sepsis may be mediated by its binding ability and/or neutralizing capacity on LPS, avoiding an excessive response of the immune system. Thus, increasing blood levels of HDL and/or parenteral HDL administration may represent a new anti-inflammatory tool for managing septic states in humans.

Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) son responsables del transporte reverso de colesterol y ejercen un importante papel anti-aterogénico. En los últimos años, diversos estudios indican que las HDL también tendrían otras funciones críticas, incluyendo una posible actividad anti-inflamatoria durante estados infecciosos. Además, la evidencia disponible sugiere que la presencia de lipopolisacárido (LPS) en la circulación durante estados infecciosos inducidos por bacterias gramnegativas podría estar involucrado en la disminución del colesterol HDL y los cambios en composición de esta clase lipoproteínas, lo cual se asociaría con una mayor tasa de mortalidad por sepsis en modelos animales y en humanos. En este trabajo, se revisan los antecedentes mencionados y además se discuten posibles mecanismos que explican la disminución de la respuesta inflamatoria y de la mortalidad que se logran en modelos de endotoxemia tratados con HDL o preparaciones similares. En este sentido, se ha propuesto que uno de los mecanismos protectores de las HDL estaría mediado por su capacidad de unión y/o neutralización del LPS, evitando una respuesta exacerbada del sistema inmune. De esta manera, el aumento de los niveles sanguíneos de HDL y/o su administración parenteral podrían constituir nuevas herramientas anti-inflamatorias para el manejo de estados sépticos en humanos.

Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli has detrimental effects on the intestinal morphology of weaned pigs / El lipopolisacárido (LPS) de E. coli deteriora los parámetros morfológicos intestinales de cerdos posdestete / O lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli afeta negativamente os parâmetros intestinais dos suínos apos desmame

Early weaning predisposes the pig intestine to structural and functional alterations, due to the increase in E. coli populations. These bacteria use the lipopolysaccharide (LPS) derived from their cell wall as an important pathogenic factor. Little is known about the effects of LPS on the intestinal morphology. Such knowledge could be helpful in understanding the pathogenesis of post-weaning enteritis, which is needed to design therapeutic strategies. Objective: this study aimed to evaluate the effects of the oral intake of LPSon the morphology of intestinal villi and glands of weaned pigs. Methods: the study used 52 pigs weaned at 21 days. The animals were fed a basal diet added with four levels of LPS (0.0, 0.3, 0.5 and 1.0 µg/mg of food) for 10 days. Pigs were sequentially slaughtered on days 1, 5, 7 and 10 after weaning, and samples of small intestine were taken to evaluate morphological parameters by computerized image analysis. The statistical design used was randomized blocks in a 4x4 factorial arrangement. Results: results showed that LPS decreases the height and area of intestinal villi, and increases the width of the villi and the depth and width of the intestinal glands. These effects probably contribute to a decreased intestinal nutrient absorption and increase co-infection with other pathogens, thus leading to the post-weaning diarrhea syndrome. Conclusions: this study stresses the usefulness of computerized morphometric analysis to evaluate the effect of LPS on intestinal morphology, so it may be used in future studies to investigate the pathophysiology of the causative agents of enteritis and to evaluate therapeutic strategies.

El destete precoz de los cerdos predispone al desarrollo de alteraciones estructurales y funcionales en el intestino y a enteritis causadas por la bacteria Escherichia coli; la cual utiliza el LPS de su pared como uno de sus principales factores patogénicos. Debido a que se conoce poco sobre los efectos del LPS sobre los parámetros morfológicos intestinales, y a que ese conocimiento es necesario para comprender la patogenia de las enteritis postdestete y para diseñar estrategias terapéuticas. Objetivo: se realizó este estudio con el objetivo de evaluar el efecto de la administración de LPS de E. coli sobre la morfología de las vellosidades y las glándulas intestinales en cerdos recién destetados. Métodos: El estudio experimental se realizó con 52 cerdos destetados a los 21 días de edad. Los animales fueron alimentados con una dieta basal adicionada con cuatro niveles de LPS (0.0, 0.3, 0.5 y 1.0 µg/mg de alimento) durante 10 días. Los cerdos se sacrificaron escalonadamente los días 1, 5, 7 y 10 posdestete y se tomaron muestras de intestino delgado para determinar algunos parámetros morfológicos mediante análisis computarizado de imágenes. El diseño estadístico empleado fue bloques al azar en un arreglo factorial 4x4. Resultados: como resultados se obtuvo que el LPS disminuye la altura y el área de las vellosidades y aumenta su ancho, así como la profundidad y ancho de las glándulas intestinales. Estos efectos probablemente disminuyen la absorción intestinal de nutrientes, incrementan la co-infección con otros agentes patógenos y la presentación del síndrome de diarrea posdestete. Conclusiones: Este estudio muestra la utilidad del análisis morfométrico computarizado para evaluar el efecto del LPS sobre los parámetros morfológicos intestinales, por lo que podría utilizarse en futuros estudios para investigar la fisiopatología de los agentes causantes de enteritis y para evaluar estrategias terapéuticas.

O desmame precoce dos suínos predispõe o desenvolvimento de alterações estruturais e funcionais no intestino e à enterite causada pela bactéria Escherichia coli, que usa o LPS da parede como um dos principais fatores patogênicos. Devido a que pouco se sabe sobre os efeitos do LPS sobre os parâmetros morfológicos intestinais, e que esse conhecimento é necessário para compreender a patogênese da enterite pós-desmame e projetar estratégias terapéuticas. Objetivo: este estudo foi realizado para avaliar o efeito administração de LPS de E. coli sobre a morfologia das vilosidades e glândulas intestinais em suínos desmamados. Métodos: o estudo experimental foi realizado com 52 leitões desmamados aos 21 dias de idade. Os animais foram alimentados com uma dieta basal suplementada com quatro níveis de LPS (0.0, 0.3, 0.5 e 1.0 µg/mg de alimento) durante 10 dias. Os suínos foram abatidos em escalonadamente aos 1, 5, 7 e 10 dias pós-desmame e foram tomadas amostras do intestino delgado para determinar alguns parâmetros morfológicos através da análise computacional de imagens. O delineamento estatístico utilizado foi em blocos casualizados em um arranjo fatorial 4x4. Resultados: o resultado foi que LPS diminuiu a altura e a área das vilosidades e aumenta sua largura e profundidade e amplitude das glândulas intestinais. Estes efeitos podem diminuir a absorção intestinal de nutrientes, aumento de co-infecção com outros patógenos ea apresentação do pós-desmame síndrome diarréica. Conclusões: este estudo mostra a utilidade da análise morfométrica computadorizada para avaliar o efeito do LPS sobre parâmetros morfológicos intestinais, de modo que poderiam ser utilizados em futuros estudos para pesquisar a fisiopatologia da enterite agentes causadores e avaliar estratégias terapêuticas.

CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN in vivo E in vitro DEL LIPOPOLISACÁRIDO DE Aeromonas hydrophila / In Vitro/In Vivo Characterization And Evaluation Of Aeromonas hydrophila Lipopolysacharides (LPS)

A partir de una cepa de A. hydrophila aislada de un brote de enfermedad septicémica en Tilapia nilótica (Piaractus brachypomusoreochromis niloticus), se obtuvieron extractos de lipopolisacárido (LPS) crudo (29,5 mg/ml) y semipurificado (106,5 mg/ml) mediante la técnica fenol-agua caliente descrita por Westphal, Jann (1965). La presencia de proteína fue del 2,3% para el extracto crudo y de 0,1% para el semipurificado; la concentración de polisacáridos osciló entre el 15 y 26%. En electroforesis (SDS-PAGE) se observaron bandas de 14 Kd correspondientes al oligosacárido central y al lípido A del LPS. Tres ratones de 25-35 g fueron inoculados intraperitonealmente con 25 mg/Kg de LPS cru-do, a partir de la primera hora todos los animales mostraron erizamiento, taquipnea e inapetencia; microscópicamente se detectó congestión hepática y pulmonar, hemorragias pulmonares y renales, marginación leucocitaria en hígado y pulmón con predominio de polimorfo-nucleares neutrófilos (PMN) en todos los animales, mostrando un mayor efecto que el control inoculado con LPS de E. coli (Sigma®) a la misma concentración. In vitro el LPS crudo a concentración de 10, 20 y 30 µg/ml indujo proliferación de células mono-nucleares murinas (2 x 10 5 en 200 µl de medio DMEM) por incorporación de timidina tritiada; tanto el LPS control (E. coli), como el LPS crudo de A. hydrophila mostraron cuentas por minuto (CPM ) ascendentes de manera dosis dependiente, el LPS de A. hydrophila desencadeno una proliferación muy similar a la inducida por el control.

Aeromonas hydrophila isolated from a septicemic disease outbreak in tilapia (Piaractus brachypomusoreochromis niloticus) was used to prepare crude (29.5 mg/ml) and semipurified (106.5 mg/ml) lipopolysacharide extracts (LPS) based on the phenol-hot water protocol (Westphal and Jann, 1965). Protein contents were 2.3% and 0.1% for the crude and the semipurified extracts, respectively, while the polysacharides ranged from 15 to 26%. SDS-PAGE showed 14 Kd bands for the central oligosacharide and lipid A of the LPS. Mice (n=3) (25 ~ 35 g) that were intraperitoneally injected (25 mg crude LPS) showed after the first hour bristled fur, tachypnea and loss of appetite. Congestion (liver, lung), hemorrhages (kidney, lung), leukocytes margination -mainly PMN neutrophils-(liver, lung) were the most remarkable microscopic features. These effects were more evident than those found in controls injected with E. coli LPS (Sigma®). Crude LPS at 10, 20 and 30 mg/ml induced In vitro proliferation of murine mononuclear cells (2 x 105 in 200 ml DMEM) by use of tritiated thymidine. Both the crude A. hydrophila and the control E. coli LPS extracts showed dosed-dependent increasing counts per minute. The A. hydrophila LPS elicited a proliferation very similar to the one induced by the control.

Purificación de lipopolisacárido de Neisseria meningitidis a partir de unafracción colateral del proceso de producción de VA-MENGOC-BC® / Purification of Neisseria meningitidis lipopolysaccharide starting from a collateral fraction of the process of the antimeningococcal vaccine, VA-MENGOC-BC production process

El trabajo tuvo como objetivo purificar lipopolisacáridos (LPS) de Neisseria meningitidis a partir de una fraccióncolateral del proceso de producción de la vacuna antimeningocócica VA-MENGOC-BC®, el sobrenadante que seobtiene del paso de ultracentrifugación durante el proceso de extracción de las proteínas de la membrana externa delmeningococo. La purificación se realizó mediante precipitación con etanol al 80 por ciento, extracción de las proteínas con fenol al 90 porciento entre 65-70 ºC y ultracentrifugación fraccionada a 105,000 g. Se obtuvieron tres lotes de LPS, en total 1,069 g, con un contenido de proteínas, ácidos nucleicos y ácido sálico respecto al LPS de 0,5 por ciento, 0,3 por ciento y 2,2 por ciento (m/m),respectivamente. La evaluación por cromatografía mostró una alta integridad molecular, con valores de constante de distribución reproducibles (0,36-0,38) y una posible asociación del ácido siálico al LPS. Se apreció homogeneidad en el perfil electroforético de los tres lotes y alta actividad endotóxica. El LPS purificado fue identificado fundamentalmente como del inmunotipo L3,7,9. El procedimiento de purificación empleado permite aprovechar una fracción colateral del proceso de producción de la vacuna, es escalable, no incluye métodos cromatográficos, y posibilita la obtención de gran cantidad de LPS de Neisseria meningitidis, no disponible en el mercado, con elevada pureza y alta actividad endotóxica(AU)

The work aimed at purifying lipopolysaccharides (LPS) of Neisseria meningitidis from a collateral fraction of the antimeningococcal BC vaccine, VAMENGOC-BC®. production process, the supernatant obtained from the ultra centrifugation stage during the proteins extraction process of the meningococcus outer membrane. The purification was carried out by precipitation 80 percent ethanol, protein extraction with 90 percent phenol from 65-70 ºC and fractional ultra centrifugation at 105.000 g. Three lots of LPS were obtained, in total 1.069 g, with a content of proteins, nucleic acids and sialic acid in respect to the LPS of 0.5 percent, 0.3 percent and 2.2percent (m/m) respectively. The assessment by chromatography showed a high molecular integrity. with constant valves of reproducible distribution (Kd 0.36 0.38) and a possible sialic acid association to the LPS. Homogeneitywas observed in the electrophoretic profile of the three lots and a high endotoxic activity. The purified LPS was mainly identified as the inmunotype L3,7,9. The purification procedure used allows making use of a collateral fraction of the vaccine production process, it is scalable, it does not include chromatographic methods and makes easy the obtainment of large quantityof LPS of Neisseria meningitidis, wihich it is non available on the market, with high purity and high endotoxic activity(AU)

Dolor y malestar: un ejemplo experimental de interacción neuro-inmune / Pain and sickness: an experimental example of neuro-immune interaction

Bajo la definición de malestar general se agrupan una constelación de signos y síntomas tales como fiebre, disminución de la actividad, pérdida del apetito, disminución de la libido, trastornos del sueño y modificaciones en el umbral del dolor, entre otros. Estas manifestaciones son necesarias para hacer frente a procesos infecciosos y son iniciadas por el sistema inmunitario y controladas por el sistema nervioso, por lo que representan un ejemplo ideal de interacción entre ambos componentes. En el presente estudio se analizaron los cambios conductuales inducidos en el umbral del dolor luego de la administración i.p. de lipopolisacárido (LPS), una endotoxina que forma parte de la pared de bacterias gram negativas. Adicionalmente, se determinaron los cambios que ocurren en los patrones de descarga de dos poblaciones de neuronas de la formación reticular bulbar, las células “off” y “on”, luego de la administración de la endotoxina. Estas células aparentemente constituyen los brazos ejecutores del sistema de modulación endógena del dolor. Los resultados obtenidos indican que dependiendo de la dosis de LPS empleada (100 o 200 μg/kg) se pueden activar diferentes mecanismos de modulación, que a su vez parecen depender de las dos poblaciones de neuronas bulbares. La dosis de 100 μg/kg de LPS produjo antinocicepción, la cual estuvo asociada a incrementos en la actividad de las células “off” y a la disminución de la actividad de las “on”. La dosis de 200 μg/kg de LPS produjo hiperalgesia, la cual se acompañó de una disminución de la actividad de las celulas off”y un aumento en la actividad de las células on.

The definition of sickness/illness behavior involves a constellation of signs and symptoms such as fever, decrease of physical activity, anorexia, decrease of libido, insomnia and changes of the pain threshold, among others. These manifestations are necessary to face infectious processes and are apparently initiated and controlled by the immune and the nervous system, so that they represent an ideal example of interaction between both components. In the present study the behavioral changes in the pain threshold induced by the i.p. administration of lipopolysaccharide, an endotoxin derived from gram-negative bacterial cell walls, were analyzed. Additionally, changes in the discharge pattern of two neuronal populations of the medullary reticular formation, the off- and on-cells, which apparently act as the executory arm of the endogenous pain modulatory system were determined after endotoxin administration. The results indicate that depending on the LPS dose (100 or 200 μg/kg) different modulatory mechanisms might be activated, which in turn seem to be the consequence of the activation of the two different classes of medullary neurons. Antinociception was produced after administration of 100 μg/kg of LPS. That was associated to an increase of the off-cell firing and a reduction of the on-cell activity. Hyperalgesia was produced after administration of 200 μg/kg of LPS. That effect was accompanied by an inhibition of the off-cell activity and an increase of the on-cell firing. These findings suggest that changes of the pain threshold that occur during sickness/illness involve the differential participation of the two control options of the endogenous pain modulatory system and of specialized mechanisms of communication between the immune and the nervous system.