Proteus mirabilis biofilm expansion microscopy yields over 4-fold magnification for super-resolution of biofilm structure and subcellular DNA organization.

Bacterial biofilms form when bacteria attach to surfaces and generate an extracellular matrix that embeds and stabilizes a growing community. Detailed visualization and quantitative analysis of biofilm architecture by optical microscopy are limited by the law of diffraction. Expansion Microscopy (ExM) is a novel Super-Resolution technique where specimens are physically enlarged by a factor of ∼4, prior to observation by conventional fluorescence microscopy. ExM requires homogenization of rigid constituents of biological components by enzymatic digestion. We developed an ExM approach capable of expanding 48-h old Proteus mirabilis biofilms 4.3-fold (termed PmbExM), close to the theoretic maximum expansion factor without gross shape distortions. Our protocol, based on lytic and glycoside-hydrolase enzymatic treatments, degrades rigid components in bacteria and extracellular matrix. Our results prove PmbExM to be a versatile and easy-to-use Super-Resolution approach for enabling studies of P. mirabilis biofilm architecture, assembly, and even intracellular features, such as DNA organization.

Inhibitory effect of proteinase K against dermatophyte biofilms: an alternative for increasing the antifungal effects of terbinafine and griseofulvin.

This study aimed to evaluate the effect of proteinase K on mature biofilms of dermatophytes, by assays of metabolic activity and biomass. In addition, the proteinase K-terbinafine and proteinase K-griseofulvin interactions against these biofilms were investigated by the checkerboard assay and scanning electron and confocal microscopy. The biofilms exposed to 32 µg ml-1 of proteinase K had lower metabolic activity and biomass, by 39% and 38%, respectively. Drug interactions were synergistic, with proteinase K reducing the minimum inhibitory concentration of antifungals against dermatophyte biofilms at a concentration of 32 µg ml-1 combined with 128-256 µg ml-1 of terbinafine and griseofulvin. Microscopic images showed a reduction in biofilms exposed to proteinase K, proteinase K-terbinafine and proteinase K-griseofulvin combinations. These findings demonstrate that proteinase K has activity against biofilms of dermatophytes, and the interactions of proteinase K with terbinafine and griseofulvin improve the activity of drugs against mature dermatophyte biofilms.

The role of enzymes in the angiogenic activity of Hancornia speciosa latex

The Hancornia speciosa latex has shown angiogenic activity. Angiogenesis plays a major role in wound healing, and materials that stimulate this process could be used to develop drugs. This study aimed to explain the role of proteins in the H. speciosa serum fraction latex in angiogenesis. Hence, this material was treated with proteinase K and the proteins were inactivated. After protein inactivation, angiogenic activity was assessed with the chick chorioallantoic membrane assay. The result showed that the proteins in the serum fraction are responsible for angiogenic activity. Then, the total protein content in the serum fraction and its enzymatic activity were investigated. The low protein content observed in the H. speciosa serum fraction latex suggests that this biomaterial could be used to develop new drugs with a hypoallergenic response. Despite the low protein content, there was a significant enzymatic activity of at least three enzymes in the serum fraction latex: ß-1,3 glucanase, ß-glucosidase, and proteases. These enzymes seem to influence the healing process, assisting debridement, extracellular matrix remodeling, and collagen deposition, and decreasing the chances of contamination by microorganisms. In conclusion, the enzymes in the H. speciosa serum latex are associated with the angiogenic activity of this biomaterial and may be used to assist the wound healing process.

Evaluation of eight protocols for genomic DNA extraction of Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes) / Avaliação de oito protocolos na extração de DNA genômico de Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.(AU)

Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.(AU)

Evaluation of eight protocols for genomic DNA extraction of Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes) / Avaliação de oito protocolos na extração de DNA genômico de Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

Abstract The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.

Resumo Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

Conformational changes during the reaction cycle of plasma membrane Ca2+-ATPase in the autoinhibited and activated states.

Plasma membrane Ca2+-ATPase (PMCA) transports Ca2+ by a reaction cycle including phosphorylated intermediates. Calmodulin binding to the C-terminal tail disrupts autoinhibitory interactions, activating the pump. To assess the conformational changes during the reaction cycle, we studied the structure of different PMCA states using a fluorescent probe, hydrophobic photolabeling, controlled proteolysis and Ca2+-ATPase activity. Our results show that calmodulin binds to E2P-like states, and during dephosphorylation, the hydrophobicity in the nucleotide-binding pocket decreases and the Ca2+ binding site becomes inaccessible to the extracellular medium. Autoinhibitory interactions are disrupted in E1Ca and in the E2P ground state whereas they are stabilized in the E2·Pi product state. Finally, we propose a model that describes the conformational changes during the Ca2+ transport of PMCA.

Evaluation of eight protocols for genomic DNA extraction of Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

Abstract The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.

Resumo Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

A comparative study of four DNA extraction protocols from adductor muscle in golden mussel (Limnoperna fortunei) / Estudo comparativo de quatro protocolos de extração de DNA do músculo adutor em mexilhão dourado (Limnoperna fortunei)

The golden mussel, Limnoperna fortunei, is a mollusk native to Southeast Asia and a highly invasive species in South American countries such as Brazil, Uruguay, and Argentina. In order to better understand the biological behavior of the species and develop alternative control methods, genetic studies involving the optimization of DNA isolation procedures are of utmost importance.The objective of the present study was to develop a simple, reproducible, free of contaminants, and cheap protocol to extract DNA from L. fortunei using the adductor muscle of the mussel as the source. Four DNA extraction protocols were compared: extraction with SDS and proteinase K (P1); extraction with SDS, proteinase K and phenol (P2); TRIzol extraction (P3); and NaCl, SDS and RNase extraction (P4). DNA concentration (ng μL-1) and purity (at 260/280 nm) were measured using a spectrophotometer. DNA purity and amplification were verified by electrophoresis and PCR, respectively. P1 resulted in samples with low DNA concentrations or without any DNA, as revealed by the quantification and purity analysis; P2 had low efficiency, given the absence of DNA in most of the samples subjected to electrophoresis. On the other hand, P3 showed contamination with proteins, as indicated by an absorbance of <1.8 and by the low-quality electrophoresis results. Finally, P4 resulted in well-defined bands, absorbance between 1.8 and 2.0, and successful amplification by PCR. In conclusion, the extraction protocol P4 is a practical, fast, free of contaminants, and efficient method for the isolation of L. fortunei DNA.(AU)

O mexilhão dourado, Limnoperna fortunei é um molusco originário do sudeste da Ásia, altamente invasor em países Sul-Americanos como Brasil, Uruguai e Argentina. Para compreender melhor o comportamento biológico da espécie e criar alternativas de controle é indispensável a realização de estudos genéticos, onde a otimização dos procedimentos de isolamento do DNA é fundamental.O objetivo desse estudo foi obter um protocolo simples, reproduzível, não contaminante e barato para a extração do DNA de L. fortunei. Foram comparados quatro protocolos experimentais de extração de DNA, utilizando como material biológico o músculo abdutor: extração por SDS e proteinase K (P1), extração por SDS, proteinase K e fenol (P2), extração por Trizol (P3) e extração por NaCl (P4). A quantificação (ng μL-1) e a pureza (260/280 nm) do DNA foram obtidas por espectrofotometria. A integridade e a amplificação do DNA foram verificadas através de eletroforese e PCR, respectivamente. P1 demonstrou baixas concentrações e ausência de DNA nas amostras, identificado pela quantificação e teste de integridade. P2 apresentou baixa eficácia, visualizada pela ausência de DNA na maioria das amostras na eletroforese. Por outro lado, P3 exibiu sinais de contaminação por proteínas, identificado pela razão de absorbância <1.8 e pela baixa qualidade da eletroforese. Finalmente, P4 mostrou um padrão na formação das bandas, absorbância entre 1,8 2,0 e sucesso na amplificação pela PCR. Conclui-se que o protocolo de extração P4 mostrou-se como um método prático, rápido, não contaminante e eficiente para obtenção do DNA de L. fortunei.(AU)

A comparative study of four DNA extraction protocols from adductor muscle in golden mussel (Limnoperna fortunei) / Estudo comparativo de quatro protocolos de extração de DNA do músculo adutor em mexilhão dourado (Limnoperna fortunei)

The golden mussel, Limnoperna fortunei, is a mollusk native to Southeast Asia and a highly invasive species in South American countries such as Brazil, Uruguay, and Argentina. In order to better understand the biological behavior of the species and develop alternative control methods, genetic studies involving the optimization of DNA isolation procedures are of utmost importance.The objective of the present study was to develop a simple, reproducible, free of contaminants, and cheap protocol to extract DNA from L. fortunei using the adductor muscle of the mussel as the source. Four DNA extraction protocols were compared: extraction with SDS and proteinase K (P1); extraction with SDS, proteinase K and phenol (P2); TRIzol extraction (P3); and NaCl, SDS and RNase extraction (P4). DNA concentration (ng μL-1) and purity (at 260/280 nm) were measured using a spectrophotometer. DNA purity and amplification were verified by electrophoresis and PCR, respectively. P1 resulted in samples with low DNA concentrations or without any DNA, as revealed by the quantification and purity analysis; P2 had low efficiency, given the absence of DNA in most of the samples subjected to electrophoresis. On the other hand, P3 showed contamination with proteins, as indicated by an absorbance of <1.8 and by the low-quality electrophoresis results. Finally, P4 resulted in well-defined bands, absorbance between 1.8 and 2.0, and successful amplification by PCR. In conclusion, the extraction protocol P4 is a practical, fast, free of contaminants, and efficient method for the isolation of L. fortunei DNA.

O mexilhão dourado, Limnoperna fortunei é um molusco originário do sudeste da Ásia, altamente invasor em países Sul-Americanos como Brasil, Uruguai e Argentina. Para compreender melhor o comportamento biológico da espécie e criar alternativas de controle é indispensável a realização de estudos genéticos, onde a otimização dos procedimentos de isolamento do DNA é fundamental.O objetivo desse estudo foi obter um protocolo simples, reproduzível, não contaminante e barato para a extração do DNA de L. fortunei. Foram comparados quatro protocolos experimentais de extração de DNA, utilizando como material biológico o músculo abdutor: extração por SDS e proteinase K (P1), extração por SDS, proteinase K e fenol (P2), extração por Trizol (P3) e extração por NaCl (P4). A quantificação (ng μL-1) e a pureza (260/280 nm) do DNA foram obtidas por espectrofotometria. A integridade e a amplificação do DNA foram verificadas através de eletroforese e PCR, respectivamente. P1 demonstrou baixas concentrações e ausência de DNA nas amostras, identificado pela quantificação e teste de integridade. P2 apresentou baixa eficácia, visualizada pela ausência de DNA na maioria das amostras na eletroforese. Por outro lado, P3 exibiu sinais de contaminação por proteínas, identificado pela razão de absorbância <1.8 e pela baixa qualidade da eletroforese. Finalmente, P4 mostrou um padrão na formação das bandas, absorbância entre 1,8 – 2,0 e sucesso na amplificação pela PCR. Conclui-se que o protocolo de extração P4 mostrou-se como um método prático, rápido, não contaminante e eficiente para obtenção do DNA de L. fortunei.

Three-dimensional morphology of rigid structures as a tool for taxonomic studies of Dactylogyridae (Monogenea).

Dactylogyridae is overwhelmingly the most abundant and diverse taxon among monogeneans in continental waters of South America. Their small body size requires considerable sampling effort and training for collecting and identifying the worms from the gills, skin, nasal cavities, and other microhabitats. Indeed, diagnostic characteristics as sclerites and male copulatory complex are generally less than 100-µm long and are essential for taxonomic description and identification of species. Here, a combination of simple and routine methods for three-dimensional morphological studies on hard structures is proposed for dactylogirids: SDS treatment for clarification of specimens and enzymatic digestion with proteinase K for freeing sclerotized structures, followed by laser confocal microscopy. This method is applicable to fresh or fixed specimens and does not require staining or dehydration. Indeed, stable autofluorescence emission is detectable at 500-530 nm for bars, anchors, and male copulatory complex when excited by argon laser. Advantages of this protocol over previous methodologies for taking laser confocal images are discussed. Open access software for image processing was used for three-dimensional reconstruction of sclerotized structures generating models and full 360° rotation videos.

Evaluation of eight protocols for genomic DNA extraction of Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

Abstract The principle and the techniques applied in DNA extraction play a pivotal role in the obtention of a purified genetic material. The present study investigates the efficiency of eight protocols in the DNA extraction of Hypostomus commersoni, an essential component of South American freshwater ichthyofauna. The quality of samples was assessed through spectrophotometry, gel electrophoresis, and PCR-RAPD markers amplification. The efficiency of DNA extraction was influenced both by the method applied and the target-tissue of choice. Higher concentrations and yield of DNA were obtained from ocular tissue, with a positive spectrum of incubation in lysis buffer for up to 36 hours after sample collection, using fresh tissues and in the presence of a high concentration of Proteinase K (20 mg.ml-1). In these conditions, samples were successfully amplified. To date, there is no record of description for the parameters analyzed in this work, neither the description of RAPD markers for the species H. commersoni.

Resumo Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

Evaluación de un método de extracción y purificación de DNA a partir de tejido muscular fijado en formaldehido de cadáveres no identificados / Evaluation of a method of extracting and purifying DNA from muscle tissue fixed in formaldehyde unidentified bodies / Avaliação de um método de extracção e purificação de ADN a partir de tecido muscular fixado em formaldeído corpos não identificados

La obtención de DNA humano en buena cantidad y alta pureza a partir de tejido muscular fijado en Formaldehido no tamponado es de suma importancia en la amplificación por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para su aplicación en estudios de identificación y filiación genética. En este estudio se evaluó la eficiencia del Kit QIAampR DNA FFPE TISSUE y una modificación del mismo basado en lavados con PBS y el tiempo de digestión con proteinasa K, frente a la cantidad y calidad de este ácido nucléico. Las diferencias fueron significativas entre los tiempos de acción con la proteinasa K (PK) en relación a la cantidad y en la pureza producto de los lavados del tejido muscular previa extracción. Estos resultados proporcionan una pauta para el diseño de experimentos de acuerdo con el efecto de la fijación, optimizando recursos humanos e insumos.

Obtaining human DNA in large quantity and high purity from muscle tissue fixed in formaldehyde unbuffered is of utmost importance in amplification by Chain Reaction (PCR) for application in identification studies and genetic affiliation. In this study, the efficiency of DNA FFPE TISSUE QIAampR Kit and a modification thereof based washes with PBS and the time of digestion with proteinase K, compared to the amount and quality of the nucleic acid were evaluated. Differences were significant between the exposure times with proteinase K (PK) in relation to the quantity and purity of the product prior washings muscle tissue extraction. These results provide a guideline for the design of experiments according to the effect of fixing, optimizing human resources and inputs.

A obtenção de DNA humano em grande quantidade e de alta pureza a partir de tecido muscular fixado em formol não tamponado é de extrema importância para a amplificação por Reacção em Cadeia (PCR), para sua aplicação em estudos de identificação e filiação genética. Neste estudo, a eficácia do kit QIAampR DNA FFPE TISSUE e uma modificação do processo por lavagens com PBS e o tempo de digestão com proteinase K, em comparação com a quantidade e a qualidade do ácido nucléico desta base. As diferenças foram significativas entre os tempos de exposição com proteinase K em relação à quantidade e pureza produto das lavagens do tecido muscular extraída previamente. Estes resultados fornecem uma diretriz para o desenho de experimentos de acordo com o efeito de fixação, otimizando recursos humanos e insumos.