Criopreservação de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo: Uma alternativa para lipoenxertia seriada na reconstrução mamária / Cryopreservation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: An alternative to serial fat grafting in breast reconstruction

Introdução: A lipoenxertia é um enxerto autólogo de células do tecido celular subcutâneo, que pode ser utilizada como técnica complementar na reconstrução mamária. Diante disso, a criopreservação de células-tronco mesenquimais provenientes de tecido adiposo (CTDAs) poderia ser uma maneira de realizar a coleta em um tempo cirúrgico e após realizar a lipoenxertia de forma fracionada. O dimetilsulfóxido (DMSO) é um criopreservante utilizado em pesquisas com células, porém é potencialmente tóxico, o que impossibilitaria a utilização de CTDAs criopreservadas na prática clínica. Novos criopreservantes celulares, sem toxicidade, vêm sendo descritos na literatura científica experimental, como as substâncias L-prolina e trealose. Com isso, esse trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade de CTDAs criopreservadas com a combinação de L-prolina e trealose, em um período de até 90 dias. Método: Estudo experimental, no qual foram obtidas amostras de lipoaspirado provenientes de 9 pacientes. A fração celular foi processada e congelada com L-prolina (1,5M) + trealose (0,2M), ou com DMSO + soro fetal bovino (SFB), como controle. Após 30 e 90 dias, as amostras foram descongeladas e a viabilidade celular foi avaliada pela técnica de MTT. Resultados: A análise das CTDAs, após 1 e 3 meses de congelamento, indicou que as amostras tratadas com L-prolina + trealose apresentaram viabilidade semelhante àquelas preservadas com DMSO e SFB (p=0,444). Conclusão: A associação de L-prolina e trealose manteve CTDA viáveis por 30 e 90 dias de congelamento, podendo ser uma alternativa como criopreservante celular sem toxicidade e viabilizando o uso de lipoenxertia seriada.

Introduction: Fat grafting is an autologous graft of cells from subcutaneous tissue, which can be used as a complementary technique in breast reconstruction. Given this, the cryopreservation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) could be a way to collect them in one surgical procedure and after performing fractional fat grafting. Dimethyl sulfoxide (DMSO) is a cryopreservative used in cell research, but it is potentially toxic, which would make it impossible to use cryopreserved ADMSCs in clinical practice. New cellular cryopreservatives, without toxicity, have been described in the experimental scientific literature, such as the substances L-proline and trehalose. Therefore, this work aimed to evaluate the viability of ADMSCs cryopreserved with the combination of L-proline and trehalose over up to 90 days. Method: Experimental study in which lipoaspirate samples were obtained from 9 patients. The cellular fraction was processed and frozen with L-proline (1.5M) + trehalose (0.2M) or with DMSO + fetal bovine serum (FBS) as control. After 30 and 90 days, the samples were thawed, and cell viability was assessed using the MTT technique. Results: The analysis of ADMSCs, after 1 and 3 months of freezing, indicated that samples treated with L-proline + trehalose showed similar viability to those preserved with DMSO and SFB (p=0.444). Conclusion: The association of L-proline and trehalose kept ADMSC viable for 30 and 90 days of freezing, and could be an alternative as a cellular cryopreservative without toxicity and enabling the use of serial fat grafting.

Effect of low-density lipoproteins and trehalose on the quality of cryopreserved bovine semen / Efecto de las lipoproteínas de baja densidad y la trehalosa en la calidad del semen bovino criopreservado / Efeito das lipoproteínas de baixa densidade e trealose na qualidade do sêmen bovino criopreservado

Abstract Background: In artificial insemination, chicken egg yolk is added to bovine semen to protect it during the cryopreservation process, although it contains substances that can affect the microbiological quality and metabolism of sperm. Objective: To evaluate post-thaw quality of bovine cryopreserved semen added with centrifuged and non-centrifuged egg yolk, low-density lipoproteins (LDL), and trehalose (T). Methods: Ten ejaculates from five bulls were cryopreserved under the treatments T1: pure egg yolk (PEY) at 20% v/v, T2: centrifuged egg yolk (CEY) at 20% v/v, T3: LDL at 8% v/v, T4: T at 100 mM, and T5: T at 100 mM plus LDL at 8% v/v (TLDL). Spermatic motility and kinetics, functional membrane integrity (FMI), structural membrane integrity (SMI), sperm vitality (SV) and abnormal morphology (AM) were assessed using the Sperm Class Analyzer (SCA®) system, hypoosmotic test (HOST), SYBR/PI probes, and eosin-nigrosin staining, respectively. A completely randomized design was used. Normal distribution of the variables was validated through the Kolmogórov- Smirnov test. A generalized linear model was used to determine sources of variation. Means were compared using the Tukey test. Results: Inclusion of CEY or LDL had a similar effect on sperm protection, and were superior for motility, kinetics and membrane integrity compared to the other treatments (p<0.05). CEY was superior for progressive motility (p<0.05). The cryoprotective action of LDL was similar to TLDL for motility and kinetics, SMI, SV, and AM (p<0.05). Inclusion of PEY and T resulted in the lowest semen quality (p<0.05). The use of T resulted in a reduction in FMI and SMI (p<0.05). No differences in AM between treatments were found (p>0.05). Conclusions: Egg yolk can be replaced by centrifuged egg yolk or low-density lipoproteins in the freezing extender used for bovine semen used in artificial insemination.

Resumen Antecedentes: la yema de huevo de gallina se agrega al semen bovino usado en inseminación artificial para protegerlo durante el proceso de criopreservación, aunque ésta tiene sustancias que pueden afectar el metabolismo espermatico y la calidad microbiológica del semen. Objetivo: evaluar la calidad post-descongelación del semen bovino criopreservado agregado con yema de huevo centrifugada y no centrifugada, lipoproteínas de baja densidad (LDL) y trehalosa (T). Métodos: diez eyaculados de cinco toros se criopreservaron bajo los tratamientos, T1: yema de huevo pura (PEY) al 20% v/v, T2: yema de huevo centrifugada (CEY) al 20% v/v, T3: LDL al 8% v/v, T4: T a 100 mM, y T5: T a 100 mM más LDL al 8% v/v (TLDL). La movilidad y la cinética espermática, la integridad funcional de la membrana (FMI), la integridad estructural de la membrana (SMI), la vitalidad espermática (SV) y la morfología anormal (AM), se determinaron mediante el sistema Sperm Class Analyzer (SCA®), la prueba hipoosmótica (HOST), las sondas SYBR/PI y la tinción con eosina-nigrosina, respectivamente. Se utilizó un diseño completamente al azar. La normalidad de las variables se validó mediante la prueba de Kolmogórov-Smirnov. Se utilizó un modelo lineal generalizado para determinar las fuentes de variación. Las medias de los tratamientos se compararon mediante la prueba de Tukey. Resultados: CEY y LDL tuvieron un efecto similar en la protección de los espermatozoides, siendo superiores a los demás tratamientos respecto a movilidad, cinética e integridad de la membrana (p<0,05). CEY fue superior para la movilidad progresiva (p<0,05). La acción crioprotectora de LDL fue similar a TLDL para movilidad y cinética, SMI, AM y SV (p<0,05). PEY y T resultaron en la más baja calidad seminal (p<0,05). El uso de T redujo la FMI y la SMI (p<0,05). No se encontraron diferencias en AM entre los tratamientos (p>0,05). Conclusiones: la yema de huevo puede reemplazarse por yema de huevo centrifugada o por lipoproteinas de baja densidad en el diluyente de congelación usado para semen bovino destinado a inseminacion artificial.

Resumo Antecedentes: a gema de ovo de galinha tem sido utilizada com a finalidade de proteger o sêmen bovino durante o processo de criopreservação, embora tenha substâncias que possam afetar o metabolismo dos espermatozóides e a qualidade microbiológica do sêmen utilizado para a inseminação artificial. Objetivo: avaliar a qualidade pós-descongelamento do sêmen bovino criopreservado com gema de ovo centrifugada e não centrifugada, lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e trealose (T). Métodos: dez ejaculados de cinco touros foram criopreservados sob os tratamentos, T1: gema de ovo pura (PEY) 20% v/v, T2: gema de ovo centrifugada (CEY) 20% v/v, T3: LDL 8% v/v, T4: T 100 mM e T5: T 100 mM mais LDL 8% v/v (TLDL). Mobilidade e cinética espermática, integridade funcional da membrana (FMI), integridade estrutural da membrana (SMI), vitalidade espermática (SV) e morfologia anormal (AM) foram determinadas por o sistema Sperm Class Analyzer (SCA®), teste hiposmótico (HOST), coloração com SYBR/PI e eosina-nigrosina, respectivamente. Um design completamente aleatoriedade foi usado. A normalidade das variáveis foi validada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Um modelo linear generalizado foi utilizado para determinar as fontes de variação. As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey. Resultados: T2 (CEY) e T3 (LDL) tiveram efeito similar na proteção espermática, sendo superior aos demais tratamentos para mobilidade, cinética e integridade da membrana (p<0,05). T2 (CEY) foi superior para mobilidade progressiva (p<0,05). A ação crioprotetora de T3 (LDL) foi semelhante à T5 (TLDL) para motilidade e cinética, SMI, SV e AM (p<0,05). T1 (PEY) e T4 (T) tiveram a menor qualidade seminal (p<0,05). O uso de T4 (T) produziu uma redução na SMI e FMI (p<0,05). Não foram encontradas diferenças na AM entre os tratamentos (p>0,05). Conclusões: a gema de ovo pode ser substituída por gema de ovo centrifugada ou lipoproteínas de baixa densidade no diluente de congelamento de sêmen bovino.

Desenvolvimento e avaliação de nova preparação de anfotericina B e/ou cetoconazol em dispersão de bixina, pullulan e trealose / Development and evaluation of novel preparation of amphotericin B and/or ketoconazole in dispersion of bixin, pullulan and trehalose

Muitos pacientes acometidos por infecções fúngicas sucumbem devido a não eficácia dos antibióticos ou por toxicidade dos mesmos. Anfotericina B é um dos antifúngicos mais eficientes do mercado apesar de sua alta toxicidade, tem estrutura poliênica e é um composto insolúvel em água, sendo necessário o uso de adjuvantes e novas tecnologias para preparo de formulações eficazes. Cetoconazol é um composto imidazólico, também com ação antifúngica de grande espectro de ação e difícil solubilização em meio aquouso, porém solúvel somente em baixos valores de pH. Estudos têm demonstrado a utilização de bixina na preparação de dispersões aquosas de compostos insolúveis ou pouco solúveis em água. Bixina é o principal composto das cascas de semente de Bixa orellana (urucum), sendo um carotenoide insolúvel em água, porém, permite preparações na forma de nanodispersões aquosas com incorporação de fármacos apolares ou lipofílicos. O objetivo deste trabalho foi preparar anfotericina B e cetoconazol na forma de nanodispersões a partir de bixina, utilizando pullulan e trealose como adjuvantes e avaliar estabilidade e eficácia antimicrobiana por ensaios físico-químicos e microbiológicos. Pullulan é um polissacarídeo constituído por unidades de maltotriose, com propriedades adesivas e capacidade de formar biofilmes, enquanto trealose é um composto com duas unidades de glicose, com boa estabilidade em faixas de pH de 3 a 10 e capaz de suportar altas temperaturas, como processos de esterilização por calor úmido. Ensaios físico-químicos demonstraram boa manutenção das características das preparações propostas neste projeto, como, por exemplo, diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta das estruturas das nanodispersões de bixina e antifúngicos e também eficácia antimicrobiana frente a Candida albicans ATCC 10231. Os resultados apresentam perspectivas para aprimoramentos de formulações com fármacos pouco solúveis ou insolúveis em água, pesquisa de novos biomateriais e outras aplicações nas áreas farmacêutica e cosmética

Many patients with fungal infections succumb due to ineffectiveness or toxicity of antibiotics. Amphotericin B is one of the most efficient antifungals on the market despite its high toxicity. It presents polyenic structure and is a water-insoluble compound. In this case, it is necessary to use adjuvants and new technologies to prepare effective formulations. Ketoconazole is an imidazolic compound, also with broad spectrum antifungal action and difficult solubilization in aqueous medium but it is soluble at low pH values. Studies have demonstrated the use of bixin in the preparation of aqueous dispersions of insoluble or poorly soluble compounds in water. Bixin is the main compound of Bixa orellana (annatto) seed husks, being a water-insoluble carotenoid, but it allows preparations in the form of aqueous nanodispersions with incorporation of apolar or lipophilic drugs. The objective of this work was to prepare amphotericin B and ketoconazole as nanodispersions from bixin, using pullulan and trehalose as adjuvants and to evaluate them under aspects of stability and efficacy by physicochemical and microbiological assays. Pullulan is a polysaccharide consisting of maltotriose units with adhesive properties and ability to form biofilms, while trehalose is a compound with two glucose units with good stability at pH ranges from 3 to 10 and capable of withstanding high temperatures such as processes of sterilization by moist heat. Physicochemical tests demonstrated good maintenance of the characteristics of the preparations proposed in this project, such as hydrodynamic diameter and zeta potential of bixin and antifungal nanodispersions and also antimicrobial efficacy against Candida albicans ATCC 10231. The results present prospects for improvement. of poorly soluble or water-insoluble drug formulations, research on new biomaterials and other applications in the pharmaceutical and cosmetic fields

Effect of the bioprotectant agent trehalose on corneal epithelial healing after corneal cross-linking for keratoconus / Efeito do agente bioprotetor trealose na cicatrização epitelial da córnea após reticulação corneana para ceratocone

ABSTRACT Purpose: This study aimed to compare the effectiveness of eye drops containing a combination of sodium hyaluronate and trehalose and sodium hyaluronate for the treatment of corneal cross-linking and epithelial healing. Methods: This study included 46 eyes of 23 keratoconus patients who underwent corneal cross-linking on both eyes. Unpreserved trehalose 30 mg/mL and sodium hyaluronate 1.5 mg/mL (Thealoz Duo®; Thea, France) were applied six times a day on one eye of each patient and unpreserved sodium hyaluronate 0.15% (Eye Still®; Teka, Inc., Istanbul) was applied on the other eye. Patients were examined daily until complete re-epithelialization. Postoperative examinations to assess the measured size of epithelial defect were performed using slit-lamp biomicroscopy. Results: The study included 23 patients (13 females and 10 males) with a mean age of 20.9 ± 10.3 years. Corneal epithelial healing time after cross-linking was 2.3 ± 1.2 days for the trehalose and sodium hyaluronate group and 3.8 ± 2.9 days for the sodium hyaluronate group (p=0.03). Conclusion: The application of eye drops containing the combination of trehalose and sodium hyaluronate resulted in faster corneal re-epithelialization following corneal cross-linking than that of eye drops containing sodium hyaluronate alone.

RESUMO Objetivo: Este estudo teve como objetivo comparar a eficácia de colírios contendo uma combinação de hialurônico de sódio e hialuronato de sódio e trealose para o tratamento da cicatrização epitelial em pacientes com cross-linking corneano. Métodos: Este estudo inclui 46 olhos de 23 pacientes com ceratocone, que foram operados com cross-linking corneano em ambos os olhos. Trealose não preservada 30 mg/mL e hialuronato de sódio 1,5 mg/mL (Thealoz Duo®; Thea, França) foram aplicados seis vezes por dia em um olho de cada paciente e hialuronato de sódio não conservado, 0,15% (Eye Still®; Teka, Inc., Istambul) foi aplicada no outro olho. Os pacientes foram examinados diariamente até a completa reepitelização. Exames pós-operatórios para avaliar o tamanho medido do defeito epitelial foram realizados usando biomicroscopia com lâmpada de fenda. Resultados: O estudo incluiu 23 pacientes (13 mulheres e 10 homens) com idade média de 20,9 ± 10,3. O tempo de cicatrização epitelial da córnea após o cross-linking foi de 2,3 ± 1,2 dias para o grupo trealose e hialuronato de sódio e 3,8 ± 2,9 dias para o grupo hialurônico de sódio (p=0,03). Conclusão: A aplicação de gotas para os olhos contendo combinação de trealose e hialuronato de sódio resultou em uma re-epitelização da córnea mais rápida após o cross-linking corneano do que a de gotas contendo hialurônico de sódio apenas.

Sugars in ferns and lycophytes growing on rocky outcrops from southeastern brazilian coast / Açúcares em samambaias e licófitas crescendo sobre afloramento rochoso da costa sudeste brasileira

The extreme conditions in rocky outcrops allow the occurrence of desiccation tolerant species. One strategy of these plants to withstand water shortage is the accumulation of sugars. In this paper, we report sugar levels and profile of three ferns and one lycophyte naturally hydrated growing on rocky outcrops from Southeastern Brazil. Anemia species have higher sugar contents than Doryopteris collina and Selaginella sellowii. The analyzed species have different sugar profiles. The ferns have glucose, fructose and sucrose, and the lycophyte has glucose and trehalose.

Nas condições ambientais extremas dos afloramentos rochosos ocorrem espécies tolerantes à dessecação. Uma das estratégias dessas plantas para resistir à restrição hídrica é o acúmulo de açúcares. No presente estudo, avaliamos a concentração e o perfil de açúcares de três espécies de samambaias e uma licófita, naturalmente hidratadas crescendo sobre afloramentos rochosos no sudeste do Brasil. As espécies de Anemia possuem maior concentração de açúcares em relação a Doryopteris collina e Selaginella sellowii. As espécies analisadas mostraram perfis distintos de açúcares. As samambaias apresentam glicose, frutose e sacarose, enquanto a licófita glicose e trealose.

Avaliação da eficácia de crioprotetores permeantes e não permeantes no descongelamento rápido e lento do sêmen canino / Evaluating the effectiveness of permeating and non-permeating cryoprotectants in fast and slow defrosting of canine semen

The aim of this study was to evaluate the association between cryoprotectants little studied in Brazil such as dimethylformamide and trehalose amid thinner, using protocols of fast and slow defrosting. Three adult Labrador Retrievier male, healthy dogs, weekly submitted to one semen collection during five-weeks period, were used. The base diluent medium used in this study was tris-citrate added with 3% of dimethylformamide + 3% glycerol (D1), 3%  dimethylformamide and trehalose (D2) and 4% glycerol (D3). At defrosting, half of the semen samples from each diluent medium was defrosted by rapid method in water-bath at 75 C for seven minutes, followed by a new immersion at 37 C for 1 minute. The other half of the samples was defrosted by slow method, in water-bath at 37 C for 1 minute. The semen was evaluated for sperm progressive motility and vigor, besides membrane integrity. For this, the semen samples were submitted to either hyposmotic and membrane integrity tests of the plasmatic membrane and acrosome  (fluorescence). The results indicated that the use of glycerol as cryoprotector in TRIS diluter provides greater efficacy in cryopreserving spermatozoa of the canine species, when compared to dimethylformamide associated with trehalose or glycerol.

O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da associação entre crioprotetores ainda pouco estudados no Brasil como a dimetilformamida e a trealose em meio diluidor, por meio de protocolos de descongelamento rápido e lento. Foram utilizados três cães machos, adultos, sadios da raça Labrador do Retrievier, que foram submetidos a uma coleta de sêmen semanal durante o período de cinco semanas. Os três meios diluentes utilizados neste estudo foram: (D1)-tris-citrato, acrescido de 3% de dimetilformamida + 3% de glicerol, (D2)-3% de dimetilformamida e de trealose e (D3)-4% de glicerol. No descongelamento, metade das amostras de cada meio diluente foi descongelada pelo método rápido, em banho-maria a 75 ºC por sete segundos, seguido de nova imersão a 37 ºC por 1 minuto. A outra metade foi descongelada pelo método lento, em banho-maria à 37 ºC por 1 minuto. O sêmen foi avaliado quanto à motilidade progressiva, vigor espermáticos e integridade de membrana. Pra isso, as amostras foram submetidas aos testes hipo-osmótico e de integridade da membrana plasmática e do acrossoma (fluorescência). Os resultados indicam que o uso do glicerol como crioprotetor em diluidor TRIS proporciona maior eficácia na criopreservação dos espermatozoides da espécie canina, quando comparados com a dimetilformamida associada ao glicerol ou trealose.

Avaliação da eficácia de crioprotetores permeantes e não permeantes no descongelamento rápido e lento do sêmen canino / Evaluating the effectiveness of permeating and non-permeating cryoprotectants in fast and slow defrosting of canine semen

The aim of this study was to evaluate the association between cryoprotectants little studied in Brazil such as dimethylformamide and trehalose amid thinner, using protocols of fast and slow defrosting. Three adult Labrador Retrievier male, healthy dogs, weekly submitted to one semen collection during five-weeks period, were used. The base diluent medium used in this study was tris-citrate added with 3% of dimethylformamide + 3% glycerol (D1), 3%  dimethylformamide and trehalose (D2) and 4% glycerol (D3). At defrosting, half of the semen samples from each diluent medium was defrosted by rapid method in water-bath at 75 C for seven minutes, followed by a new immersion at 37 C for 1 minute. The other half of the samples was defrosted by slow method, in water-bath at 37 C for 1 minute. The semen was evaluated for sperm progressive motility and vigor, besides membrane integrity. For this, the semen samples were submitted to either hyposmotic and membrane integrity tests of the plasmatic membrane and acrosome  (fluorescence). The results indicated that the use of glycerol as cryoprotector in TRIS diluter provides greater efficacy in cryopreserving spermatozoa of the canine species, when compared to dimethylformamide associated with trehalose or glycerol.(AU)

O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da associação entre crioprotetores ainda pouco estudados no Brasil como a dimetilformamida e a trealose em meio diluidor, por meio de protocolos de descongelamento rápido e lento. Foram utilizados três cães machos, adultos, sadios da raça Labrador do Retrievier, que foram submetidos a uma coleta de sêmen semanal durante o período de cinco semanas. Os três meios diluentes utilizados neste estudo foram: (D1)-tris-citrato, acrescido de 3% de dimetilformamida + 3% de glicerol, (D2)-3% de dimetilformamida e de trealose e (D3)-4% de glicerol. No descongelamento, metade das amostras de cada meio diluente foi descongelada pelo método rápido, em banho-maria a 75 ºC por sete segundos, seguido de nova imersão a 37 ºC por 1 minuto. A outra metade foi descongelada pelo método lento, em banho-maria à 37 ºC por 1 minuto. O sêmen foi avaliado quanto à motilidade progressiva, vigor espermáticos e integridade de membrana. Pra isso, as amostras foram submetidas aos testes hipo-osmótico e de integridade da membrana plasmática e do acrossoma (fluorescência). Os resultados indicam que o uso do glicerol como crioprotetor em diluidor TRIS proporciona maior eficácia na criopreservação dos espermatozoides da espécie canina, quando comparados com a dimetilformamida associada ao glicerol ou trealose.(AU)

Avaliação da eficácia de crioprotetores permeantes e não permeantes no descongelamento rápido e lento do sêmen canino

The aim of this study was to evaluate the association between cryoprotectants little studied in Brazil such as dimethylformamide and trehalose amid thinner, using protocols of fast and slow defrosting. Three adult Labrador Retrievier male, healthy dogs, weekly submitted to one semen collection during five-weeks period, were used. The base diluent medium used in this study was tris-citrate added with 3% of dimethylformamide + 3% glycerol (D1), 3% dimethylformamide and trehalose (D2) and 4% glycerol (D3). At defrosting, half of the semen samples from each diluent medium was defrosted by rapid method in water-bath at 75 °C for seven minutes, followed by a new immersion at 37 °C for 1 minute. The other half of the samples was defrosted by slow method, in water-bath at 37 °C for 1 minute. The semen was evaluated for sperm progressive motility and vigor, besides membrane integrity. For this, the semen samples were submitted to either hyposmotic and membrane integrity tests of the plasmatic membrane and acrosome (fluorescence). The results indicated that the use of glycerol as cryoprotector in TRIS diluter provides greater efficacy in cryopreserving spermatozoa of the canine species, when compared to dimethylformamide associated with trehalose or glycerol.

O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da associação entre crioprotetores ainda pouco estudados no Brasil como a dimetilformamida e a trealose em meio diluidor, por meio de protocolos de descongelamento rápido e lento. Foram utilizados três cães machos, adultos, sadios da raça Labrador do Retrievier, que foram submetidos a uma coleta de sêmen semanal durante o período de cinco semanas. Os três meios diluentes utilizados neste estudo foram: (D1)-tris-citrato, acrescido de 3% de dimetilformamida + 3% de glicerol, (D2)-3% de dimetilformamida e de trealose e (D3)-4% de glicerol. No descongelamento, metade das amostras de cada meio diluente foi descongelada pelo método rápido, em banho-maria a 75ºC por sete segundos, seguido de nova imersão a 37 ºC por 1 minuto. A outra metade foi descongelada pelo método lento, em banho-maria à 37 ºC por 1 minuto. O sêmen foi avaliado quanto à motilidade progressiva, vigor espermáticos e integridade de membrana. Pra isso, as amostras foram submetidas aos testes hipo-osmótico e de integridade da membrana plasmática e do acrossoma (fluorescência). Os resultados indicam que o uso do glicerol como crioprotetor em diluidor TRIS proporciona maior eficácia na criopreservação dos espermatozoides da espécie canina, quando comparados com a dimetilformamida associada ao glicerol ou trealose.

Avaliação da trealose como crioprotetor de células-tronco hematopoiéticas de sangue de cordão umbilical e placentário / Evaluation of trehalose as a cryoprotectant natural of hematopoietic stem cells from umbilical cord blood and placental

O sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido usado como fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH) para reconstituir a função medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservação das CTH, que permanecem congeladas até uma possível utilização futura. Na criopreservação de CTH, o reagente químico dimetilsulfóxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos tóxicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e à desidratação acumulando dissacarídeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento é a formação de espécie reativas de oxigênio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adição de bioantioxidantes na solução de criopreservação das células é passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adição de antioxidantes na solução de criopreservação das células de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hipótese que a solução de criopreservação contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperação e a viabilidade das células-tronco do SCUP, após a criopreservação. SCUP foi processado e submetido à criopreservação em soluções contendo na primeira fase: soluções com diferentes concentrações de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacarídeos (60mmol/L) e ácido ascórbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: soluções contendo diferentes concentrações de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na célula por meio de lipossomas) e extracelular e soluções contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas...

The umbilical cord blood (UCB) has been used as a source of primitive hematopoietic stem cells (HSC) to reconstitute the hematopoiesis. Most often, it is required the cryopreservation of HSC, which remain frozen in banks for possible future use. For cryopreservation of HSC, the chemical reagent dimethylsulfoxide (DMSO) has been used as a cryoprotectant. Many organisms in nature have a capacity of survive freezing and dehydration by accumulating disaccharides, so the trehalose, has been actively investigated as an alternative cryoprotector, other damage which is very common during freezing is oxygen free radicals formation which decreases the cellular viability after thawing, so the addition of bioantioxidants in the solution of cryopreservation of cells is very important. This study was divided into two phases: first, we evaluated the results obtained with the addition of antioxidants in the solution for cryopreservation of cord blood cells and the second phase: evaluate the hypothesis that the cryopreservation solution containing intracellular and extracellular trehalose improves recovery and viability of cord blood stem cells after cryopreservation. UBC was processed and subjected to cryopreservation solutions containing for the first phase: solutions with different concentrations of DMSO (10%, 5% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (5%, 2.5 %) with a disaccharide (60 mmol/L), ascorbic acid and/or catalase (10mg/mL), and for the second phase: solutions containing different concentrations of DMSO (10% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (2.5%) with intracellular trehalose (trehalose was introduced into the cell by means of liposomes) and solutions containing extra and intracellular trehalose without DMSO, stored for two weeks in N2L, and thawed. The thawed cells were assessed by flow cytometry, MTT and colony forming units (CFU) assays. In the first phase of the study our analysis showed catalase improved the preservation CD34+ and CD123+...

Effect of the trehalose levels on the screening of yeast as probiotic by in vivo and in vitro assays

Probiotics are viable defined microorganisms (bacteria or yeasts) that exert a beneficial effect on the health of the host when ingested in adequate amounts. Screening for such biotherapeutic agents is commonly performed by in vitro assays simulating gastrointestinal environment to determine the ability to survive in the digestive tract. In the present study, the possibility of extrapolation of data obtained in in vitro assays to in vivo conditions was studied using five Saccharomyces cerevisiae strains isolated from Brazilian Atlantic rain forest. Trehalose contents and survival after exposure to a combination of physiological stresses generally found in the gastrointestinal tract of humans were determined for the five yeasts and compared to the behavior of Saccharomyces boulardii, a well-known probiotic. The results were completed with the colonization capacity of the gastrointestinal tract of gnotobiotic mice by these yeast strains. Some results obtained by in vitro assays are not confirmed by in vivo experiments, indicating that the extrapolation cannot be always done.

Probióticos são definidos como microrganismos (bactérias e leveduras) que exercem um efeito benéfico na saúde do hospedeiro quando ingeridos em quantidades adequadas. A seleção desses agentes bioterapêuticos normalmente é feita por testes in vitro simulando o ambiente gastrointestinal que determina a capacidade de sobrevivência no trato digestivo. Neste trabalho, a possibilidade de extrapolação dos dados obtidos nos testes in vitro para as condições in vivo foi estudada utilizando cinco linhagens de Saccharomyces cerevisiae isoladas da floresta Atlântica brasileira. O conteúdo de trealose e a sobrevivência após a exposição a diversos estresses fisiológicos geralmente encontrados no trato gastrointestinal de humanos foram determinados para as cinco linhagens e os resultados comparados com a Saccharomyces boulardii, um probiótico conhecido. Esses resultados foram completados com a capacidade de colonização do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos pelas leveduras. Pelos resultados obtidos, concluimos que os testes in vitro não são confirmados pelos ensaios in vivo, indicando que essa extrapolação não pode sempre ser feita.

Effect of the trehalose levels on the screening of yeast as probiotic by in vivo and in vitro assays

Probiotics are viable defined microorganisms (bacteria or yeasts) that exert a beneficial effect on the health of the host when ingested in adequate amounts. Screening for such biotherapeutic agents is commonly performed by in vitro assays simulating gastrointestinal environment to determine the ability to survive in the digestive tract. In the present study, the possibility of extrapolation of data obtained in in vitro assays to in vivo conditions was studied using five Saccharomyces cerevisiae strains isolated from Brazilian Atlantic rain forest. Trehalose contents and survival after exposure to a combination of physiological stresses generally found in the gastrointestinal tract of humans were determined for the five yeasts and compared to the behavior of Saccharomyces boulardii, a well-known probiotic. The results were completed with the colonization capacity of the gastrointestinal tract of gnotobiotic mice by these yeast strains. Some results obtained by in vitro assays are not confirmed by in vivo experiments, indicating that the extrapolation cannot be always done.

Probióticos são definidos como microrganismos (bactérias e leveduras) que exercem um efeito benéfico na saúde do hospedeiro quando ingeridos em quantidades adequadas. A seleção desses agentes bioterapêuticos normalmente é feita por testes in vitro simulando o ambiente gastrointestinal que determina a capacidade de sobrevivência no trato digestivo. Neste trabalho, a possibilidade de extrapolação dos dados obtidos nos testes in vitro para as condições in vivo foi estudada utilizando cinco linhagens de Saccharomyces cerevisiae isoladas da floresta Atlântica brasileira. O conteúdo de trealose e a sobrevivência após a exposição a diversos estresses fisiológicos geralmente encontrados no trato gastrointestinal de humanos foram determinados para as cinco linhagens e os resultados comparados com a Saccharomyces boulardii, um probiótico conhecido. Esses resultados foram completados com a capacidade de colonização do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos pelas leveduras. Pelos resultados obtidos, concluimos que os testes in vitro não são confirmados pelos ensaios in vivo, indicando que essa extrapolação não pode sempre ser feita.

Mobilization of endogenous glycogen and trehalose of industrial yeasts

The fermentation of yeast reserve carbohydrates, glycogen and trehalose is a procedure to increase protein level of yeast cells and improve ethanol production. This work studied on the degradation kinetics of glycogen and trehalose carried out with two industrial strains of Saccharomyces cerevisiae (PE-2 and SA-1) and the effect of different temperatures (38º, 40º, 42º and 44ºC) on degradation rate. Endogenous fermentation was carried out in a yeast suspension at 20% (w/v) based on wet weight, suspended in fermented media with 3.0 to 4.5 % (v/v) of ethanol. The degradation of the carbohydrate reserves at 40ºC followed first-order kinetics, showing that its rate is mainly dependent on the carbohydrate concentration in the cell. The degradation rate (k) ranged from 0.0387 to 0.0746 h-1. Analyzing other parameters at 40ºC, it was observed that viability and dry and wet yeast biomass were reduced while cell protein, ethanol, glycerol and nitrogen in the medium increased. Glycogen and trehalose degradation at different temperatures (38º, 40º, 42º e 44ºC) showed that at 38ºC the degradation rate was slow and from 42ºC on the degradation of glycogen stopped after few hours of incubation. Thus, from a practical point of view, the best incubation temperature is around 40ºC. The application of the Arrhenius equation showed that activation energy from 40º to 42ºC was 165.90 and 107.94 kcal.ºK-1.mol-1 for trehalose and glycogen respectively for PE-2 strain, and 190.64 and 149.87 kcal.ºK-1.mol-1 respectively for SA-1 strain.

A fermentação dos carboidratos de reserva, glicogênio e trealose é um procedimento para aumentar o nível de proteína das células de leveduras com simultâneo aumento na produção de etanol. Este trabalho estudou a cinética de degradação do glicogênio e trealose em duas linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae (PE-2 e SA-1), bem como o efeito de diferentes temperaturas (38º, 40º, 42º e 44ºC) na velocidade de degradação. A fermentação endógena foi conduzida com suspensão de leveduras a 20% (m/v) em massa úmida, no vinho com 3 a 4,5% (v/v) de etanol. A degradação dos carboidratos de reserva, a 40ºC, seguiu uma cinética de primeira ordem, mostrando que sua taxa é dependente da concentração dos carboidratos na célula. A taxa especifica de degradação (k) variou de 0,0387 a 0,0746 h-1. Em relação a outros parâmetros analisados a 40ºC, foi observado que a viabilidade e biomassa seca e úmida foram reduzidas, enquanto a reserva de proteína celular e etanol, glicerol e nitrogênio no meio aumentaram. A degradação do glicogênio e trealose em diferentes temperaturas (38ºC, 40ºC, 42ºC e 44ºC) mostrou que a 38ºC a taxa de degradação foi a menor, ao passo que a partir de 42ºC ou superior, a degradação do glicogênio não mais progrediu após poucas horas de incubação. Portanto, do ponto de vista prático, a melhor temperatura de incubação é em torno de 40ºC. A aplicação da equação de Arrheniusmostrou que as energias de ativação de 40ºC a 42ºC foram 165,90 e 107,94 kcal.ºK-1.mol-1 para trealose e glicogênio respectivamente para a linhagem PE-2, e 190,64 e 149,87 kcal.ºK-1/mol-1, para a linhagem SA-1 respectivamente.

Trehalose accumulation, invertase activity and physiological characteristics of yeasts isolated from 24 h fermentative cycles during the production of artisanal Brazilian cachaça

Trehalose accumulation, invertase activity and physiological characteristics of 86 yeast isolates from short fermentative cycles during the production of cachaça in three artisanal distilleries of the State of Minas Gerais were studied. Among these isolates, 70% were able to grow at temperatures between 40 and 42ºC. Only Saccharomyces cerevisiae isolates were able to grow over 40ºC. Lower temperatures ( 40ºC) favoured the growth of yeasts such as Candida parapsilosis-like, C. maltosa-like, Kloeckera japonica, S. exiguus and C. bombicola-like. The isolates from all three distilleries were ethanol tolerant, produced invertase, and accumulate trehalose in the presence of glucose. The strains isolated from distillery A presented more resistance to ethanol (around 84.2% of the strains were able to grow in the presence of 12% ethanol) when compared to the ones from distilleries C and B (9.5% and no strain, respectively). The strains of S. cerevisiae isolated from the three distilleries presented a higher capacity to produce invertase and accumulate trehalose in the presence of glucose. Based on the results of thermal and ethanol stress experiments, it was possible to identify strong relationship between intracellular trehalose accumulation and cell viability. The increase in cell viability was even more pronounced when the strains were subjected to a pre-treatment at sublethal temperatures.

As características fisiológicas, acúmulo de trealose e produção de invertase de 86 leveduras isoladas do ciclo fermentativo durante a produção artesanal de cachaça em três destilarias no Estado de Minas Gerais foram estudadas. Destes isolados 70% foram capazes de crescer acima de 40 e 42ºC. Somente os isolados de Saccharomyces cerevisiae foram capazes de crescer acima de 40ºC. Baixas temperaturas ( 40ºC) favoreceram o crescimento de leveduras como Candida parapsilosis-like, C. maltosa-like, Kloeckera japonica, S. exiguus and C. bombicola-like. Os isolados das três destilarias foram tolerantes ao etanol, produziram invertase e acumularam trealose na presença de glicose. As linhagens isoladas da destilaria A apresentaram maior resistência ao etanol (cerca de 84.2% das linhagens foram capazes de crescer na presença de 12% de etanol) quando comparadas àquelas das destilarias B e C (nenhuma linhagem e 9,5%, respectivamente). As linhagens de S. cerevisiae isoladas das três destilarias apresentaram uma alta capacidade para produzir invertase e acumular trealose na presença de glicose. Com base nos resultados dos experimentos de estresse térmico e de etanol, foi possível observar uma forte relação entre acúmulo de trealose intracelular e viabilidade celular. O aumento da viabilidade celular foi mais pronunciado quando as linhagens foram submetidas a um pré-tratamento em temperaturas sub-letais.

Criopreservação de embriões de suínos adicionando trealose aos crioprotetores etilenoglicol ou glicerol

The objectives of this study were to compare (a) the effects of trehalose incorporated to ethylene glycol and (b) the effect of ethylene glycol and glycerol associated to trehalose on the viability of frozen swine embryos. Treatment 1 consisted in 1.5 M ethylene glycol, treatment 2 in 1.5 M ethylene glycol plus 0.25 M trehalose and treatment 3 glycerol 1.5 M with 0.25 M trehalose. The embryos were frozen at expanded blastocyst stage. The rapid freezing method was used, with a cooling rate of 1°C/minute from the room temperature (± 25°C) to seeding (-7°C), and of 0.3°C/minute to -35°C, when the straws were plunged into liquid nitrogen (-196°C). Thawing was carried out in air during 30 seconds and in a water bath at 37°C during 30 seconds. Cryoprotectors were removed by the step-wise method. Embryo viability was observed microscopicaly imediately after thawing and when they reexpanded after being cultured for 18-24h in Medium 199 with 20% bovine foetal serum in 60 mul drops covered with mineral oil and incubated at 37°C in air with 6% CO2. The viability was 17.2%, 37.5% and 42.8% immediately after thawing, and 6.9%, 28.1% e 28.5% after a culture period of 18-24h, for treatments 1, 2 and 3, respectively. The results showed no differences (p>0.05) in viability among treatments when observation was made immediately after thawing. After culturing, viability rate was higher (p 0.05) in ethylene glycol with 0.25 M trehalose than in ethylene glycol only. Ethylene glycol and glycerol associated to trehalose showed no differences to cryoprotect swine embryos.

Os objetivos deste trabalho foram: comparar (a) o efeito da adição de trealose ao crioprotetor etilenoglicol e, (b) o efeito dos crioprotetores etilenoglicol ou glicerol associados à trealose sobre a viabilidade de embriões congelados de suínos . A trealose foi adicionada à solução de congelamento de etilenoglicol 1.5 M nas concentrações de 0.0 M (tratamento 1) e 0.25 M (tratamento 2), e na concentração de 0.25 M (tratamento 3) à solução de congelamento de glicerol 1.5 M. Os embriões foram congelados no estágio de blastocisto expandido. O método de congelamento utilizado foi o rápido, sendo que desde a temperatura ambiente (± 25°C) até a temperatura do "seeding" (-7°C), a velocidade de resfriamento foi de 1°C/minuto. Após o "seeding", foi estabelecido um período de equilíbrio de 10 minutos à -7°C, sendo, a partir de então, adotada a velocidade de resfriamento de 0.3°C/minuto até a temperatura de -35°C. A seguir, as palhetas foram colocadas no nitrogênio líquido (-196°C). O descongelamento foi realizado mediante exposição das palhetas ao ar durante 30 segundos e, posteriormente, em banho-maria à 35°C, durante 30 segundos. A remoção dos crioprotetores foi realizada pelo método em etapas. O critério de viabilidade adotado consistiu na observação da reexpansão da cavidade blastocélica dos embriões, após período de cultivo in vitro de 18-24h. O cultivo foi feito em meio TCM 199 (tissue culture medium), acrescido de 20% de soro fetal bovino, em microgotas de 60 mil, sob óleo mineral em estufa com 6% CO2, 95% de umidade e 37°C. A viabilidade embrionária logo após o descongelamento (0h) foi de 17.2%, 37.5% e 42.8%, para os tratamentos 1, 2 e 3, respectivamente. Após o período de cultivo de 18-24h, a viabilidade embrionária foi de 6.9%, 28.1% e 28.5%, para os tratamentos 1, 2 e 3, respectivamente. Os resultados indicaram que não houve diferença (p>0.05) significativa entre os tratamentos ao descongelamento. Após o cultivo in vitro, verificou-se que a porcentagem de embriões viáveis foi superior (p 0.05) pela adição de trealose na concentração de 0.25 M à solução de congelamento, contendo etilenoglicol. No entanto, não foi detectada diferença significativa entre os crioprotetores etilenoglicol ou glicerol, associados à trealose.

Criopreservação de embriões de suínos adicionando trealose aos crioprotetores etilenoglicol ou glicerol

The objectives of this study were to compare (a) the effects of trehalose incorporated to ethylene glycol and (b) the effect of ethylene glycol and glycerol associated to trehalose on the viability of frozen swine embryos. Treatment 1 consisted in 1.5 M ethylene glycol, treatment 2 in 1.5 M ethylene glycol plus 0.25 M trehalose and treatment 3 glycerol 1.5 M with 0.25 M trehalose. The embryos were frozen at expanded blastocyst stage. The rapid freezing method was used, with a cooling rate of 1°C/minute from the room temperature (± 25°C) to seeding (-7°C), and of 0.3°C/minute to -35°C, when the straws were plunged into liquid nitrogen (-196°C). Thawing was carried out in air during 30 seconds and in a water bath at 37°C during 30 seconds. Cryoprotectors were removed by the step-wise method. Embryo viability was observed microscopicaly imediately after thawing and when they reexpanded after being cultured for 18-24h in Medium 199 with 20% bovine foetal serum in 60 mul drops covered with mineral oil and incubated at 37°C in air with 6% CO2. The viability was 17.2%, 37.5% and 42.8% immediately after thawing, and 6.9%, 28.1% e 28.5% after a culture period of 18-24h, for treatments 1, 2 and 3, respectively. The results showed no differences (p>0.05) in viability among treatments when observation was made immediately after thawing. After culturing, viability rate was higher (p 0.05) in ethylene glycol with 0.25 M trehalose than in ethylene glycol only. Ethylene glycol and glycerol associated to trehalose showed no differences to cryoprotect swine embryos.

Os objetivos deste trabalho foram: comparar (a) o efeito da adição de trealose ao crioprotetor etilenoglicol e, (b) o efeito dos crioprotetores etilenoglicol ou glicerol associados à trealose sobre a viabilidade de embriões congelados de suínos . A trealose foi adicionada à solução de congelamento de etilenoglicol 1.5 M nas concentrações de 0.0 M (tratamento 1) e 0.25 M (tratamento 2), e na concentração de 0.25 M (tratamento 3) à solução de congelamento de glicerol 1.5 M. Os embriões foram congelados no estágio de blastocisto expandido. O método de congelamento utilizado foi o rápido, sendo que desde a temperatura ambiente (± 25°C) até a temperatura do "seeding" (-7°C), a velocidade de resfriamento foi de 1°C/minuto. Após o "seeding", foi estabelecido um período de equilíbrio de 10 minutos à -7°C, sendo, a partir de então, adotada a velocidade de resfriamento de 0.3°C/minuto até a temperatura de -35°C. A seguir, as palhetas foram colocadas no nitrogênio líquido (-196°C). O descongelamento foi realizado mediante exposição das palhetas ao ar durante 30 segundos e, posteriormente, em banho-maria à 35°C, durante 30 segundos. A remoção dos crioprotetores foi realizada pelo método em etapas. O critério de viabilidade adotado consistiu na observação da reexpansão da cavidade blastocélica dos embriões, após período de cultivo in vitro de 18-24h. O cultivo foi feito em meio TCM 199 (tissue culture medium), acrescido de 20% de soro fetal bovino, em microgotas de 60 mil, sob óleo mineral em estufa com 6% CO2, 95% de umidade e 37°C. A viabilidade embrionária logo após o descongelamento (0h) foi de 17.2%, 37.5% e 42.8%, para os tratamentos 1, 2 e 3, respectivamente. Após o período de cultivo de 18-24h, a viabilidade embrionária foi de 6.9%, 28.1% e 28.5%, para os tratamentos 1, 2 e 3, respectivamente. Os resultados indicaram que não houve diferença (p>0.05) significativa entre os tratamentos ao descongelamento. Após o cultivo in vitro, verificou-se que a porcentagem de embriões viáveis foi superior (p 0.05) pela adição de trealose na concentração de 0.25 M à solução de congelamento, contendo etilenoglicol. No entanto, não foi detectada diferença significativa entre os crioprotetores etilenoglicol ou glicerol, associados à trealose.

Efeito da trealose na manutenção da viabilidade de células de leveduras desidratadas por liofilização

To evaluate the influence of the endogenous trehalose and also the use of trehalose as a cryoprotectant medium on the maintenance of yeast cell viability, after the freeze-drying process, strains TA (M-300-A) and SA (strain isolated from Usina Santa Adélia S/A) of the yeast Saccharomyces cerevisiae and the strain IZ-1904 of the yeast Saccharomyces boulardii were tested. After accumulation of endogenous trehalose by heat treatment at 45oC during 2 hours in a potassium citrate buffer (2M pH 4,0 with 2.0% glucose) the yeasts were suspended in one of three cryoprotectant solutions (skimmed milk 10%, sucrose 10% and trehalose 10%), freeze-dried and analysed for their cell viability after 0, 10, 40 and 90 days of storage. Higher viability maintenance after the freeze-drying process occured for all yeasts at the higher endogenous trehalose levels. The solution of skimmed milk 10% was the best cryoprotectant medium for the yeast cells.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência da trealose endógena e também o uso da trealose como crioprotetor, na preservação da viabilidade celular de leveduras de interesse industrial quando submetidas ao processo de liofilização. Foram utilizadas as cepas TA (M-300-A) e SA (cepa isolada da Usina Santa Adélia S/A) da levedura Saccharomyces cerevisiae e a cepa IZ-1904 da levedura Saccharomyces boulardii, as quais passaram por um tratamento de acúmulo da trealose endógena, através de tratamento térmico a 45oC por duas horas em meio tampão citrato de potássio 2M, pH 4,0, acrescido de 2% de glicose, e, a seguir, foram suspensas em cada uma de três soluções crioprotetoras, que foram: leite desnatado a 10%, sacarose a 10% e trealose a 10%. Em seguida as massas de levedura foram liofilizadas e, aos 0, 10, 40 e 90 dias após o processo de liofilização, foram determinadas suas viabilidades. Para todos os crioprotetores, as culturas de levedura que passaram pelo tratamento de acúmulo da trealose endógena apresentaram maior viabilidade após a liofilização do que aquelas que não passaram pelo tratamento. Dentre os crioprotetores testados, a solução de leite desnatado a 10% foi o que proporcionou melhor crioproteção às células de levedura.

EFEITO DA TREALOSE NA MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE DE CÉLULAS DE LEVEDURAS DESIDRATADAS POR LIOFILIZAÇÃO

To evaluate the influence of the endogenous trehalose and also the use of trehalose as a cryoprotectant medium on the maintenance of yeast cell viability, after the freeze-drying process, strains TA (M-300-A) and SA (strain isolated from Usina Santa Adélia S/A) of the yeast Saccharomyces cerevisiae and the strain IZ-1904 of the yeast Saccharomyces boulardii were tested. After accumulation of endogenous trehalose by heat treatment at 45oC during 2 hours in a potassium citrate buffer (2M pH 4,0 with 2.0% glucose) the yeasts were suspended in one of three cryoprotectant solutions (skimmed milk 10%, sucrose 10% and trehalose 10%), freeze-dried and analysed for their cell viability after 0, 10, 40 and 90 days of storage. Higher viability maintenance after the freeze-drying process occured for all yeasts at the higher endogenous trehalose levels. The solution of skimmed milk 10% was the best cryoprotectant medium for the yeast cells.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência da trealose endógena e também o uso da trealose como crioprotetor, na preservação da viabilidade celular de leveduras de interesse industrial quando submetidas ao processo de liofilização. Foram utilizadas as cepas TA (M-300-A) e SA (cepa isolada da Usina Santa Adélia S/A) da levedura Saccharomyces cerevisiae e a cepa IZ-1904 da levedura Saccharomyces boulardii, as quais passaram por um tratamento de acúmulo da trealose endógena, através de tratamento térmico a 45oC por duas horas em meio tampão citrato de potássio 2M, pH 4,0, acrescido de 2% de glicose, e, a seguir, foram suspensas em cada uma de três soluções crioprotetoras, que foram: leite desnatado a 10%, sacarose a 10% e trealose a 10%. Em seguida as massas de levedura foram liofilizadas e, aos 0, 10, 40 e 90 dias após o processo de liofilização, foram determinadas suas viabilidades. Para todos os crioprotetores, as culturas de levedura que passaram pelo tratamento de acúmulo da trealose endógena apresentaram maior viabilidade após a liofilização do que aquelas que não passaram pelo tratamento. Dentre os crioprotetores testados, a solução de leite desnatado a 10% foi o que proporcionou melhor crioproteção às células de levedura.

Efeito da concentração e temperatura de adição de trealose em diluentes para a congelação de sêmen ovino em palhetas

This study was aimed to evaluate the possible effects of the addition of trehalose to extenders developed for freezing ram semen in straws. The effects of addition temperature (30°C and 4°C) and concentration of trehalose (2, 4 and 6%) on INRA and TRIS/FRUTOSE diluents was evaluated. Their effects were studied through motility rate and by acrosome integrity at different incubation times after thawing (0, 2 and 5h). The results do not recommend the inclusion of trehalose in these diluents. However, it would be interesting to learn more about toxicity and interactions between the components of the extenders and trehalose in ram sperm frozen in straws.

A trealose é um dissacarídio com potencial emprego como crioprotetor quando adicionada aos meios para congelamento de sêmen ovino. Este experimento foi realizado para verificar os efeitos da temperatura de adição (30°C e 4°C) e da concentração de trealose (2%, 4% e 6%) sobre o sêmen ovino congelado em palhetas, utilizando como base as formulações INRA e TRIS/FRUTOSE. Os efeitos estudados em ambos experimentos foram medidos através da avaliação da motilidade espermática (MOT) e da integridade de acrossomas (INTA) em diferentes momentos após o descongelamento (0h, 2h e 5h). Os presentes resultados não recomendam a inclusão da trealose visando incrementar a qualidade in vitro do sêmen ovino congelado em palhetas nas concentrações e diluentes testados, porém, sugerem maiores estudos quanto a sua toxidade e possíveis interações com outros constituintes dos diluentes já formulados para o congelamento de sêmen ovino.

Efeito da concentração e temperatura de adição de trealose em diluentes para a congelação de sêmen ovino em palhetas / Effect of the concentration and addition temperature of trehalose in extenders on freezing ram semen in straws

A trealose é um dissacarídio com potencial emprego como crioprotetor quando adicionada aos meios para congelamento de sêmen ovino. Este experimento foi realizado para verificar os efeitos da temperatura de adição (30°C e 4°C) e da concentração de trealose (2 por cento, 4 por cento e 6 por cento) sobre o sêmen ovino congelado em palhetas, utilizando como base as formulações INRA e TRIS/FRUTOSE. Os efeitos estudados em ambos experimentos foram medidos através da avaliação da motilidade espermática (MOT) e da integridade de acrossomas (INTA) em diferentes momentos após o descongelamento (0h, 2h e 5h). Os presentes resultados não recomendam a inclusão da trealose visando incrementar a qualidade in vitro do sêmen ovino congelado em palhetas nas concentrações e diluentes testados, porém, sugerem maiores estudos quanto a sua toxidade e possíveis interações com outros constituintes dos diluentes já formulados para o congelamento de sêmen ovino.

This study was aimed to evaluate the possible effects of the addition of trehalose to extenders developed for freezing ram semen in straws. The effects of addition temperature (30°C and 4°C) and concentration of trehalose (2, 4 and 6 percent) on INRA and TRIS/FRUTOSE diluents was evaluated. Their effects were studied through motility rate and by acrosome integrity at different incubation times after thawing (0, 2 and 5h). The results do not recommend the inclusion of trehalose in these diluents. However, it would be interesting to learn more about toxicity and interactions between the components of the extenders and trehalose in ram sperm frozen in straws.

Efeito da concentração e temperatura de adição de trealose em diluentes para a congelação de sêmen ovino em palhetas

This study was aimed to evaluate the possible effects of the addition of trehalose to extenders developed for freezing ram semen in straws. The effects of addition temperature (30°C and 4°C) and concentration of trehalose (2, 4 and 6%) on INRA and TRIS/FRUTOSE diluents was evaluated. Their effects were studied through motility rate and by acrosome integrity at different incubation times after thawing (0, 2 and 5h). The results do not recommend the inclusion of trehalose in these diluents. However, it would be interesting to learn more about toxicity and interactions between the components of the extenders and trehalose in ram sperm frozen in straws.

A trealose é um dissacarídio com potencial emprego como crioprotetor quando adicionada aos meios para congelamento de sêmen ovino. Este experimento foi realizado para verificar os efeitos da temperatura de adição (30°C e 4°C) e da concentração de trealose (2%, 4% e 6%) sobre o sêmen ovino congelado em palhetas, utilizando como base as formulações INRA e TRIS/FRUTOSE. Os efeitos estudados em ambos experimentos foram medidos através da avaliação da motilidade espermática (MOT) e da integridade de acrossomas (INTA) em diferentes momentos após o descongelamento (0h, 2h e 5h). Os presentes resultados não recomendam a inclusão da trealose visando incrementar a qualidade in vitro do sêmen ovino congelado em palhetas nas concentrações e diluentes testados, porém, sugerem maiores estudos quanto a sua toxidade e possíveis interações com outros constituintes dos diluentes já formulados para o congelamento de sêmen ovino.