Congelação de espermatozoides recuperados do epidídimo de cão (Canis familiares) / Spermatozoa freezing recovered from dog epididymis (Canis familiares)

O presente estudo tem como objetivo avaliar o espermatozoide recuperado do epidídimo congelado/descongelado em diferentes diluidores. O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal do Setor Palotina no período de julho de 2017 a julho de 2019. Um mínimo de 40 CTE (complexo testículo epidídimo) de cães foi obtido de animais orquiectomizados. A recuperação dos espermatozoides da cauda do epidídimo foi realizada pela técnica de flutuação e submetida ao teste de swin-up para remoção dos resíduos celulares e espermatozoides inviáveis. Após a avaliação da concentração e motilidade, os espermatozoides foram diluidos pelo método “One Step” em Tris gema e/ou citrato gema e logo envazados em palhetas de 0,25mL numa concentração de 25 x 106 de espermatozoides viáveis. Logo as mesmas permaneceram em estabilização por 2 horas a temperatura de 5°C. Após foram colocadas em vapor de nitrogênio por 15 minutos, e por fim, mergulhadas no nitrogênio líquido e armazenadas em botijão criobiológico. A descongelação foi realizada em banho maria a 37°C por um minuto, e após avaliou-se a motilidade e vigor em microscopia de Contraste de Fase 100x. Para avaliação da viabilidade espermática, foi utilizada a coloração vital Azul de Tripan/Giemsa. Na análise do sêmen descongelado, o diluente Tris-gema foi estatisticamente superior ao Citratogema nas variáveis motilidade, vigor e morfologia de espermatozoides epididimarios de cão. O presente estudo, mostra que é possível recuperar e preservar espermatozoides provenientes do epidídimo de canídeos utilizando meio crioprotetor a base de tris-gema.(AU)

The present study aims to evaluate sperm recovered from frozen / thawed epididymis in different extenders. The experiment was carried out in Animal Reproduction Laboratory at the Veterinary Hospital at the Palotina Sector from July 2017 to July 2019. A minimum of 40 ETC (epididymis testis complex) from dogs was obtained from orchiectomized animals. Epididymis tail sperm retrieval was performed by flotation technique and then submitted to the swin-up test to remove the unfeasible sperm and cellular waste. After evaluation of concentration and motility, the sperm were diluted by the “One Step” method in Tris yolk and / or citrate yolk and then packed in previously identified 0.25mL straws at a concentration of 25 x 106 viable sperm. Soon they remained in stabilization for 2 hours at 5 ° C. After that they were placed in nitrogen vapor for 15 minutes, and finally, dipped in liquid nitrogen and stored in cryogenic cylinder. The thawing was performed in a 37 ° C water bath for one minute, and then motility and vigor were evaluated by x100 magnification Phase Contrast microscopy. For sperm viability evaluation, the Tripan Blue/Giemsa vital stain was used. In the analysis of thawed semen, Tris-yolk extender was statistically superior to Yolk Citrate in the motility, vigor and morphology of dog epididymis sperm variables. The present study shows that it is possible to recovery and preserve sperm from the canid epididymis using tris-yolk cryoprotectant extender.(AU)

Congelação de espermatozoides recuperados do epidídimo de cão (Canis familiares) / Spermatozoa freezing recovered from dog epididymis (Canis familiares)

O presente estudo tem como objetivo avaliar o espermatozoide recuperado do epidídimo congelado/descongelado em diferentes diluidores. O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal do Setor Palotina no período de julho de 2017 a julho de 2019. Um mínimo de 40 CTE (complexo testículo epidídimo) de cães foi obtido de animais orquiectomizados. A recuperação dos espermatozoides da cauda do epidídimo foi realizada pela técnica de flutuação e submetida ao teste de swin-up para remoção dos resíduos celulares e espermatozoides inviáveis. Após a avaliação da concentração e motilidade, os espermatozoides foram diluidos pelo método “One Step” em Tris gema e/ou citrato gema e logo envazados em palhetas de 0,25mL numa concentração de 25 x 106 de espermatozoides viáveis. Logo as mesmas permaneceram em estabilização por 2 horas a temperatura de 5°C. Após foram colocadas em vapor de nitrogênio por 15 minutos, e por fim, mergulhadas no nitrogênio líquido e armazenadas em botijão criobiológico. A descongelação foi realizada em banho maria a 37°C por um minuto, e após avaliou-se a motilidade e vigor em microscopia de Contraste de Fase 100x. Para avaliação da viabilidade espermática, foi utilizada a coloração vital Azul de Tripan/Giemsa. Na análise do sêmen descongelado, o diluente Tris-gema foi estatisticamente superior ao Citratogema nas variáveis motilidade, vigor e morfologia de espermatozoides epididimarios de cão. O presente estudo, mostra que é possível recuperar e preservar espermatozoides provenientes do epidídimo de canídeos utilizando meio crioprotetor a base de tris-gema.

The present study aims to evaluate sperm recovered from frozen / thawed epididymis in different extenders. The experiment was carried out in Animal Reproduction Laboratory at the Veterinary Hospital at the Palotina Sector from July 2017 to July 2019. A minimum of 40 ETC (epididymis testis complex) from dogs was obtained from orchiectomized animals. Epididymis tail sperm retrieval was performed by flotation technique and then submitted to the swin-up test to remove the unfeasible sperm and cellular waste. After evaluation of concentration and motility, the sperm were diluted by the “One Step” method in Tris yolk and / or citrate yolk and then packed in previously identified 0.25mL straws at a concentration of 25 x 106 viable sperm. Soon they remained in stabilization for 2 hours at 5 ° C. After that they were placed in nitrogen vapor for 15 minutes, and finally, dipped in liquid nitrogen and stored in cryogenic cylinder. The thawing was performed in a 37 ° C water bath for one minute, and then motility and vigor were evaluated by x100 magnification Phase Contrast microscopy. For sperm viability evaluation, the Tripan Blue/Giemsa vital stain was used. In the analysis of thawed semen, Tris-yolk extender was statistically superior to Yolk Citrate in the motility, vigor and morphology of dog epididymis sperm variables. The present study shows that it is possible to recovery and preserve sperm from the canid epididymis using tris-yolk cryoprotectant extender.

Influencia do tempo da coleta à diluição sobre a viabilidade do sêmen ovino descongelado / Influence of time between the collection and dilution on the thawed sheep semen viability

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tempo após a coleta à diluição sobre o espermatozoide de carneiro, visando à integridade das membranas plasmática e acrossomal e da motilidade espermática após descongelamento. Foram utilizados sete Carneiros das raças Ille de France com idade média de três anos. As coletas de sêmen foram realizadas com uso de vagina artificial uma vez por semana, perfazendo 3 coletas por animal, totalizando 21 ejaculados. O diluidor usado foi Tris-gema. Imediatamente após a colheita o ejaculado foi dividido em quatro alíquotas iguais, sendo a primeira diluída em tempo 0 (T0), a segunda 5 minutos (T5), a terceira dez minutos (T10) e a quarta 15 minutos (T15) após a primeira respectivamente a 35ºC em banho maria numa concentração de aproximadamente 200x106 sptz/mL. Após a diluição empregando o método “OneStep”, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5mL previamente identificadas, na concentração de 100x106 sptz/palhetas. Mantidas por 2h a 5ºC, em seguida, foram expostas ao vapor de nitrogênio líquido por 15 min. Decorrido esse tempo, as palhetas foram armazenadas em botijão com nitrogênio líquido a -196 ºC. A viabilidade das membranas plasmática e acrossomal foram avaliadas pela coloração supravital tripan blue-giemsa hiposmótica (TBGH). Não houve variação significativa dos parâmetros seminais nos diferentes intervalos de tempo (P>0,05) na diluição. No sêmen descongelado houve diferença significativa na motilidade entre T0 e T15. (P<0,009) e na integridade da membrana plasmática entre T0 a 10 (P<0,02), e T15 (P<0,009), com redução significativa nos mesmos tempos para o acrossoma (P<0,01) e (P<0,006) respectivamente. Conclui-se que quanto mais breve a exposição do sêmen ovino ao meio diluidor, menor será o dano ao espermatozoide. (AU)

The aim of this study was to evaluate the effect of time after semen collection until dilution on sheep spermatozoa, aiming to the integrity of plasmatic and acrosome membranes and semen motility after thawing. Seven ram Ille de France breeds three years old were used. The semen collections were collected using an artificial vagina once a week, 3 ejaculates per animal. The extender used was Tris-yolk. Immediately after collection the ejaculate was divided into four equal aliquots, diluted in the first time 0 (T0), the second, 5 minutes (T5), the third, ten minutes (T10) and fourth, 15 minutes (T15) being respectively after the first at 35 º C in a water bath at a concentration of approximately 200x106 sperm / ml. After dilution, employing the "One Step" method, the semen was packaged in 0.5 mL straws, previously identified and the concentration of 100x106 sperm / straws. Maintained for 2 h at 5 ° C, then, were exposed to nitrogen vapor for 15 min. After this time, the straws were stored in liquid nitrogen cylinder at -196 °C. The viability of plasmatic and acrosome membranes were evaluated by hyposmotic trypan blue-Giemsa staining (HTBG). There was no significant variation of seminal parameters in different time intervals (P> 0.05) in dilution. In thawed semen was detected significant difference in motility between times T0 and T15 (P <0.009) and plasma membrane integrity between T0 to T10 (P <0.02), and T15 (P <0.009), with significant reductions at the same times for the acrosome (P <0.01) and (P<0.006) respectively. We conclude that the faster dilution of semen after collection, fewer injuries occur to the sperm. (AU)

Influencia do tempo da coleta à diluição sobre a viabilidade do sêmen ovino descongelado / Influence of time between the collection and dilution on the thawed sheep semen viability

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tempo após a coleta à diluição sobre o espermatozoide de carneiro, visando à integridade das membranas plasmática e acrossomal e da motilidade espermática após descongelamento. Foram utilizados sete Carneiros das raças Ille de France com idade média de três anos. As coletas de sêmen foram realizadas com uso de vagina artificial uma vez por semana, perfazendo 3 coletas por animal, totalizando 21 ejaculados. O diluidor usado foi Tris-gema. Imediatamente após a colheita o ejaculado foi dividido em quatro alíquotas iguais, sendo a primeira diluída em tempo 0 (T0), a segunda 5 minutos (T5), a terceira dez minutos (T10) e a quarta 15 minutos (T15) após a primeira respectivamente a 35ºC em banho maria numa concentração de aproximadamente 200x106 sptz/mL. Após a diluição empregando o método “OneStep”, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5mL previamente identificadas, na concentração de 100x106 sptz/palhetas. Mantidas por 2h a 5ºC, em seguida, foram expostas ao vapor de nitrogênio líquido por 15 min. Decorrido esse tempo, as palhetas foram armazenadas em botijão com nitrogênio líquido a -196 ºC. A viabilidade das membranas plasmática e acrossomal foram avaliadas pela coloração supravital tripan blue-giemsa hiposmótica (TBGH). Não houve variação significativa dos parâmetros seminais nos diferentes intervalos de tempo (P>0,05) na diluição. No sêmen descongelado houve diferença significativa na motilidade entre T0 e T15. (P<0,009) e na integridade da membrana plasmática entre T0 a 10 (P<0,02), e T15 (P<0,009), com redução significativa nos mesmos tempos para o acrossoma (P<0,01) e (P<0,006) respectivamente. Conclui-se que quanto mais breve a exposição do sêmen ovino ao meio diluidor, menor será o dano ao espermatozoide.

The aim of this study was to evaluate the effect of time after semen collection until dilution on sheep spermatozoa, aiming to the integrity of plasmatic and acrosome membranes and semen motility after thawing. Seven ram Ille de France breeds three years old were used. The semen collections were collected using an artificial vagina once a week, 3 ejaculates per animal. The extender used was Tris-yolk. Immediately after collection the ejaculate was divided into four equal aliquots, diluted in the first time 0 (T0), the second, 5 minutes (T5), the third, ten minutes (T10) and fourth, 15 minutes (T15) being respectively after the first at 35 º C in a water bath at a concentration of approximately 200x106 sperm / ml. After dilution, employing the "One Step" method, the semen was packaged in 0.5 mL straws, previously identified and the concentration of 100x106 sperm / straws. Maintained for 2 h at 5 ° C, then, were exposed to nitrogen vapor for 15 min. After this time, the straws were stored in liquid nitrogen cylinder at -196 °C. The viability of plasmatic and acrosome membranes were evaluated by hyposmotic trypan blue-Giemsa staining (HTBG). There was no significant variation of seminal parameters in different time intervals (P> 0.05) in dilution. In thawed semen was detected significant difference in motility between times T0 and T15 (P <0.009) and plasma membrane integrity between T0 to T10 (P <0.02), and T15 (P <0.009), with significant reductions at the same times for the acrosome (P <0.01) and (P<0.006) respectively. We conclude that the faster dilution of semen after collection, fewer injuries occur to the sperm.