Immune adjuvant effect of V. cholerae O1 derived Proteoliposome coadministered by intranasal route with Vi polysaccharide from Salmonella Typhi.

The proteoliposome derived from Vibrio cholerae O1 (PLc) is a nanoscaled structure obtained by a detergent extraction process. Intranasal (i.n) administration of PLc was immunogenic at mucosal and systemic level vs. V. cholerae; however the adjuvant potential of this structure for non-cholera antigens has not been proven yet. The aim of this work was to evaluate the effect of coadministering PLc with the Vi polysaccharide antigen (Poli Vi) of S. Typhi by the i.n route. The results showed that Poli Vi coadministered with PLc (PLc+Poli Vi) induce a higher IgA response in saliva (p<0.01) and faeces (p<0.01) than Poli Vi administered alone. Likewise, the IgG response in sera was higher in animals immunised with PLc+Poli Vi (p<0.01). Furthermore, IgG induced in sera of mice immunised with PLc+Poli Vi was similar (p>0.05) to that induced in a group of mice immunised by the parenteral route with the Cuban anti-typhoid vaccine vax-TyVi, although this vaccine did not induce a mucosal response. In conclusion, this work demonstrates that PLc can be used as a mucosal adjuvant to potentiate the immune response against a polysaccharide antigen like Poli Vi.

Cochleates derived from Vibrio cholerae O1 proteoliposomes: the impact of structure transformation on mucosal immunisation.

Cochleates are phospholipid-calcium precipitates derived from the interaction of anionic lipid vesicles with divalent cations. Proteoliposomes from bacteria may also be used as a source of negatively charged components, to induce calcium-cochleate formation. In this study, proteoliposomes from V. cholerae O1 (PLc) (sized 160.7±1.6 nm) were transformed into larger (16.3±4.6 µm) cochleate-like structures (named Adjuvant Finlay Cochleate 2, AFCo2) and evaluated by electron microscopy (EM). Measurements from transmission EM (TEM) showed the structures had a similar size to that previously reported using light microscopy, while observations from scanning electron microscopy (SEM) indicated that the structures were multilayered and of cochleate-like formation. The edges of the AFCo2 structures appeared to have spaces that allowed penetration of negative stain or Ovalbumin labeled with Texas Red (OVA-TR) observed by epi-fluorescence microscopy. In addition, freeze fracture electron microscopy confirmed that the AFCo2 structures consisted of multiple overlapping layers, which corresponds to previous descriptions of cochleates. TEM also showed that small vesicles co-existed with the larger cochleate structures, and in vitro treatment with a calcium chelator caused the AFCo2 to unfold and reassemble into small proteoliposome-like structures. Using OVA as a model antigen, we demonstrated the potential loading capacity of a heterologous antigen and in vivo studies showed that with simple admixing and administration via intragastric and intranasal routes AFCo2 provided enhanced adjuvant properties compared with PLc.

Intranasal administration of proteoliposome-derived cochleates from Vibrio cholerae O1 induce mucosal and systemic immune responses in mice.

Conservative estimates place the death toll from cholera at more than 100,000 persons each year. A particulate mucosal vaccine strategy combining antigens and immune stimulator molecules from Vibrio cholerae to overcome this problem is described. Proteoliposomes extracted from V. cholerae O1 were transformed into cochleates (AFCo2, Adjuvant Finlay cochleate 2) through a calcium inducible rotary dialysis method. Light microscopy was carried out and tubules of 16.25+/-4.57 microm in length were observed. Western blots were performed to verify the immunochemical properties of the main AFCo2 incorporated antigens, revealing full recognition of the outer membrane protein U (OmpU), lipopolysaccharide (LPS), and mannose-sensitive hemagglutinin (MSHA) antigens. AFCo2 were administered by the intranasal route using a two or three dose schedule and the immune response against V. cholerae antigens was assessed. Three AFCo2 doses were required to induce significant (p<0.05), antigen specific IgA in saliva (1.34+/-0.135) and feces (0.60+/-0.089). While, two or three doses of AFCo2 or proteoliposomes induce similar specific IgG and vibriocidal activity responses in sera. These results show for the first time that AFCo2 can be obtained from V. cholerae O1 proteoliposomes and have the potential to protect against the pathogen when administered intranasally.

A proteoliposome based formulation administered by the nasal route produces vibriocidal antibodies against El Tor Ogawa Vibrio cholerae O1 in BALB/c mice.

A vaccine candidate against the enteric pathogen Vibrio cholerae was developed based on a proteoliposome (PL) formulation using a wild type strain C7258, V. cholerae O1, El Tor Ogawa as part of strategy to develop a combined formulation against enteric diseases preventable by the stimulation of the mucosal immune system. A detergent extraction method was applied to obtain the PL. Scanning electron microscopy and molecular exclusion chromatography showed the presence of two PL populations. Photon correlation spectroscopy studies were then carried out to evaluate the size (169.27+/-3.85nm), polydispersity (0.410) and zeta potential (-23.28+/-1.21mV) of the PL. SDS-PAGE and Western blot analysis revealed the presence of lipopolysaccharide (LPS), mannose-sensitive haemagglutinin (MSHA) and a range of outer membrane proteins, including OmpU. BALB/c mice were immunized intranasally with two doses of PL containing 25mug of LPS each 28 days apart. The mice showed high anti-LPS IgG titres (3.36+/-0.235) and vibriocidal antibodies (3.70+/-0.23) after two weeks from last dose. These results show for the first time that PL can be obtained from V. cholerae O1 and when administer by intranasal route has the potential to protect against this pathogen.

Consideraciones sobre el empleo de antisueros somáticos en la clasificación por serotipos de cepas de Pseudomonas aeruginosa / Considerations about somatic antisera uses in classifying Pseudomonas aeruginosa strains by serotypes

El lipopolisacárido (LPS) de bacterias gramnegativas se emplea en el desarrollo de candidatos vacunales, como antígeno expuesto en la preparación o formando parte de esta para aumentar su poder inmunogénico. Sin embargo, esta estructura química de la membrana externa puede ser también utilizada para clasificar bacterias. Según el LPS, presente en la membrana externa bacteriana, Pseudomonas aeruginosa se puede clasificar en 20 tipos somáticos diferentes, clasificación muy útil para estudios epidemiológicos. P aeruginosa expone sus LPS en la membrana de forma estable, pero ocurren cambios en el fenotipo del LPS bacteriano durante la infección, sucesos que dificultan su clasificación. En estos momentos, los estudios que se desarrollan en el Instituto Finlay necesitan del empleo de tecnologías modernas de clasificación y del diagnóstico molecular para poder establecer patrones más precisos deexpresión de los LPS por métodos que junto a los ya existentes permitan diferenciar cepas bacterianas de la misma especie en cualquier tipo de infección(AU)

Lipopolysaccharides (LPS) of gramnegative bacteria are used for developing vaccine candidates as a complete exposed antigen in the preparation or as essential part of vaccines to improve its immunogenic power. Nevertheless, this outer membrane structure can also be used in bacterial classification according to the LPS chemical structure in outer membrane structure. Twenty different LPS have been reported as somatic antigens useful in P aeruginosa strains classification in epidemiologicalstudies. Current studies of Finlay Institute need the introduction of up-dated classification technologies and molecular diagnosis tools to establish more accurate epidemiological standards to improve the reports about the presence of new strains at theinfection site(AU)

Evaluación en animales del efecto protector de una inmunoglobulina anti Pseudomonas aeruginosa para uso terapéutico / Evaluation in animals of the protective effect of an anti Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa constituye uno de los agentes patógenos oportunistas de mayor frecuencia de aislamiento en los diversos procesos infecciosos, por lo que es reconocido como un gran problema de salud a nivel mundial. Al no existir un fármaco de alta efectividad ni vacunas disponibles contra esta bacteria, se emplea una terapia con inmunoglobulinas polivalentes comerciales que de forma combinada con los antibióticos contribuyen a eliminar la infección, aunque los preparados disponibles en el mercado no contienen concentraciones suficientemente elevadas de anticuerpos específicos contra este microorganismo. En este trabajo se llevó a cabo la evaluación en un modelo animal de una inmunoglobulina anti-Pseudomonas aeruginosa para uso terapéutico mediante un ensayo de reto con una cepa virulenta. Se evaluó dosis y vía de administración de la misma, así como el valor profiláctico o terapéutico de los anticuerpos. Esta gammaglobulina resultó ser protectora en animales mostrando una sobreviviencia cercana a un 75 por ciento en comparación con el grupo control no protegido y además se logra eliminar el estado de portador en los individuos infectados(AU)

Evaluación de la respuesta de anticuerpos hacia antígenos de Pseudomonas aeruginosa / Evaluation of antibodies response to Pseudomonas aeruginosa antigens

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno extracelular que genera una respuesta de anticuerpos específicos con utilidad para el diagnóstico y vacunas. En el presente estudio nos propusimos evaluar en suero humano los niveles de anticuerpos contra antígenos relevantes de P aeruginosa. Realizamos la determinación de anticuerpos IgG contra tres exoenzimas, consideradas como factores de virulencia de mayor importancia en infecciones. Este resultado dio paso a la evaluación del reconocimiento de IgG e IgA hacia antígenos de la envoltura celular bacteriana por ELISA de células enteras. Todos los sueros evaluados mostraron títulos de IgG e IgA superiores a los individuos sanos, con excepción de dos muestras de pacientes que no mostraron alto título. Este ensayopermitió analizar el nivel de reconocimiento hacia los antígenos más expuestos de la bacteria que incluyen principalmente LPS y proteínas de membrana externa. Se encontró diferencias entre los valores de densidad óptica a 450 nm de individuos sanos y enfermos. El método usado permitió seleccionar dos sueros de pacientes de diferentes tipos de infecciones que fueron comparados por Western blot. Se observó que aunque los sueros tenían reacción hacia distintos serotipos de P aeruginosa, la intensidad del reconocimiento variaba según el tipo de infección(AU)

Caracterización fenotípica y serológica de aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa / Phenotypical and Serological Characterizations of Pseudomonas aeruginosa Clinical Isolates

Generalmente, Pseudomona. aeruginosa es considerada un patógeno oportunista. Bajo ciertas condiciones esta bacteria puede infectar diferentes tipos de heridas, particularmente quemaduras, pero también el tracto urinario y respiratorio. Esta bacteria se asocia con neumonía, endocarditis, meningitis y algunas cepas producen grandes cantidades de polisacárido extracelular, las que se asocian a casos de fibrosis quística. El objetivo de este estudio fue caracterizar cepas clínicas aisladas de pacientes con diferentes patologías con el fin de seleccionar cepas a partir de las cuales obtener antígenos candidatos a una vacuna por subunidades. Los serotipos de mayor frecuencia encontrados fueron el O1, O4, O6, O9 y O11 y se halló una relación entre el serotipo O9 y los casos de fibrosis quística. También se evaluó la virulencia de las mismas mediante el ensayo de siembra en rojo congo. El 72(por ciento) de las 18 cepas evaluadas produjeron colonias blancas en más del 50(por ciento del total de colonias, lo que indica que la mayoría de nuestras cepas son virulentas, ya que este ensayo es una medida indirecta de la capacidad de producir alginato, el cual es considerado un importante factor de virulencia(AU)