Bioprospection and characterization of the amylolytic activity by filamentous fungi from Brazilian Atlantic Forest / Bioprospecção e caracterização da atividade amilolítica de fungos filamentosos da Mata Atlântica Brasileira

Abstract Filamentous fungi are widely diverse and ubiquitous organisms. Such biodiversity is barely known, making room for a great potential still to be discovered, especially in tropical environments - which are favorable to growth and species variety. Filamentous fungi are extensively applied to the production of industrial enzymes, such as the amylases. This class of enzymes acts in the hydrolysis of starch to glucose or maltooligosaccharides. In this work twenty-five filamentous fungi were isolated from samples of decomposing material collected in the Brazilian Atlantic Forest. The two best amylase producers were identified as Aspergillus brasiliensis and Rhizopus oryzae. Both are mesophilic, they grow well in organic nitrogen-rich media produce great amounts of glucoamylases. The enzymes of A. brasiliensis and R. oryzae are different, possibly because of their phylogenetical distance. The best amylase production of A. brasiliensis occurred during 120 hours with initial pH of 7.5; it had a better activity in the pH range of 3.5-5.0 and at 60-75°C. Both fungal glucoamylase had wide pH stability (3-8) and were activated by Mn2+. R. oryzae best production occurred in 96 hours and at pH 6.5. Its amylases had a greater activity in the pH range of 4.0-5.5 and temperature at 50-65ºC. The most significant difference between the enzymes produced by both fungi is the resistance to thermal denaturation: A. brasiliensis glucoamylase had a T50 of 60 minutes at 70ºC. The R. oryzae glucoamylase only had a residual activity when incubated at 50°C with a 12 min T50.

Resumo Fungos filamentosos são organismos amplamente diversificados e ubíquos. Esta biodiversidade ainda é pouco caracterizada, desta forma, há um grande potencial a ser descoberto, sobretudo em biomas tropicais, que favorecem o crescimento e diversificação de espécies. Fungos filamentosos são extensivamente utilizados para a produção industrial de enzimas, como as amilases. Esta classe de enzimas atua na hidrólise do amido em glicose ou maltooligossacarídeos. Neste trabalho 25 cepas de fungos filamentosos foram isoladas a partir de amostras de material em decomposição coletados na Mata Atlântica Brasileira. As duas cepas que produziram mais amilases foram identificadas como Aspergillus brasiliensis e Rhizopus oryzae. Ambos os fungos são mesofílicos, crescem bem em meio de cultivo rico em nitrogênio orgânico, e produziram grande quantidade de glucoamilase. As enzimas de A. brasiliensis e R. oryzae possuem características distintas, possivelmente devido à distância filogenética das espécies. A produção de amilase mais expressiva de A. brasiliensis ocorreu em 120 horas de cultivo e pH inicial de 7,5; possui maior atividade em temperaturas entre 60-75ºC e pH entre 3,5-5,0. Ambas glucoamilases fúngicas obtiveram ampla estabilidade de pH (3-8) e foram ativadas por Mn2+. A melhor produção de R. oryzae ocorreu em 96 horas de cultivo e pH 6,5. Suas amilases são mais ativas na faixa de pH de 4,0-5,5 e temperatura entre 50-60ºC. A diferença mais significativa dentre as enzimas produzidas pelos fungos selecionados é a resistência à desnaturação térmica, tendo a glucoamilase de A. brasiliensis um T50 de 60 minutos a 70ºC, já a glucoamilase de R. oryzae somente obteve atividade residual quando incubada a 50°C, com um T50 de apenas 12 minutos.

Ligninases production by Basidiomycetes strains on lignocellulosic agricultural residues and their application in the decolorization of synthetic dyes / Produção de ligninases por linhagens de fungos Basidiomicetos usando resíduos agrícolas lignocelulósicos e aplicação das enzimas na descoloração de corantes sintéticos

Wood rotting Basidiomycetes collected in the ôEstação Ecológica do Noroeste Paulistaõ, São José do Rio Preto, São Paulo State, Brazil, concerning Aphyllophorales order and identified as Coriolopsis byrsina SXS16, Lentinus strigellus SXS355, Lentinus sp SXS48, Picnoporus sanguineus SXS 43 and Phellinus rimosus SXS47 were tested for ligninases production by solid state fermentation (SSF) using wheat branor rice straw as culture media. C. byrsina produced the highest laccase (200 U mL-1) and Lentinus sp produced the highest activities of manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP) (7 and 8 U mL-1, respectively), when cultivated on wheat bran. The effect of N addition on enzyme production was studied in medium containing rice straw and the data showed an increase of 3 up to 4-fold in the laccase production compared to that obtained in SSF on wheat bran. The laccases presented optimum pH at 3.0-3.5 and were stable at neutral pH values. Optimum pH for MnP and LiP activities was at 3.5 and between 4.5 and 6.0, respectively. All the strains produced laccase with optimum activities between 55-60ºC while the peroxidases presented maximum activity at temperatures of 30 to 55ºC. The crude enzymes promoted decolorization of chemically different dyes with around 70% of decolorization of RBBR and cybacron blue 3GA in 6h oftreatment. The data indicated that enzymes from these basidiomycetes strains are able to decolorize synthetic dyes.

Fungos decompositores de madeira, do grupo Basidiomicetes, coletados na ôEstação Ecológica do NoroestePaulistaõ, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil, pertencentes a ordem Aphyllophorales e identificados como Coriolopsis byrsina SXS16, Lentinus strigellus SXS355, Lentinus sp. SXS48,Picnoporus sanguineus SXS 43 e Phellinus rimosus SXS47 foram estudados para a produção de ligninases por FES (fermentação em estado sólido) usando farelo de trigo ou palha de arroz como meio de cultura. A espécie C. byrsina produziu a maior quantidade de lacase (200 U mL-1) enquanto que Lentinus sp. foi o melhor produtor de manganês peroxidase (MnP) e lignina peroxidase (LiP) (7 e 8 U mL-1, respectivamente), quando cultivados em meio composto por farelo de trigo. A avaliação do efeito da suplementação de nitrogênio do substrato sólido lignocelulósico (palha de arroz) indicou um aumento de 3 a 4 vezes na produção de lacase. A caracterização das enzimasmostrou que as lacases apresentaram atividade ótima em pH 3,0-3,5 e foram estáveis em pH de neutro a alcalino. O pH ótimo para atividade de MnP e LiP foi de 3,5 e entre 4,5 e 6,0, respectivamente. Todas as linhagens produziram lacase com atividade ótima a 55-60ºC, enquanto as peroxidases apresentaram atividades máximas entre temperaturas de 30 e 55ºC. A aplicaçãodas soluções enzimáticas brutas, obtidas pelo cultivo das linhagens em meio de farelo de trigo, em testes de descoloração de corantes sintéticos de diferentes grupos químicos levou amais 70% de perda de cor dos corantes RBBR e de cybacron blue 3GA, em 6h de tratamento. Os dados obtidos indicaramque as soluções enzimáticas contendo ligninases produzidas pelas linhagens de basidiomicetos estudadas promoveram adescoloração de corantes sintéticos.

Ligninases production by Basidiomycetes strains on lignocellulosic agricultural residues and their application in the decolorization of synthetic dyes.

Wood rotting Basidiomycetes collected in the "Estação Ecológica do Noroeste Paulista", São José do Rio Preto, São Paulo State, Brazil, concerning Aphyllophorales order and identified as Coriolopsis byrsina SXS16, Lentinus strigellus SXS355, Lentinus sp SXS48, Picnoporus sanguineus SXS 43 and Phellinus rimosus SXS47 were tested for ligninases production by solid state fermentation (SSF) using wheat bran or rice straw as culture media. C. byrsina produced the highest laccase (200 U mL(-1)) and Lentinus sp produced the highest activities of manganese peroxidase (MnP) and lignin peroxidase (LiP) (7 and 8 U mL(-1), respectively), when cultivated on wheat bran. The effect of N addition on enzyme production was studied in medium containing rice straw and the data showed an increase of 3 up to 4-fold in the laccase production compared to that obtained in SSF on wheat bran. The laccases presented optimum pH at 3.0-3.5 and were stable at neutral pH values. Optimum pH for MnP and LiP activities was at 3.5 and between 4.5 and 6.0, respectively. All the strains produced laccase with optimum activities between 55-60ºC while the peroxidases presented maximum activity at temperatures of 30 to 55ºC. The crude enzymes promoted decolorization of chemically different dyes with around 70% of decolorization of RBBR and cybacron blue 3GA in 6h of treatment. The data indicated that enzymes from these basidiomycetes strains are able to decolorize synthetic dyes.