RESUMO
Recently, a cytotoxin named vacuolating cytotoxic factor (VCF) in Aeromonas sobria and Aeromonas veronii biovar sobria was described. We have now purified this factor using ion metallic affinity chromatography. The VCF is a nonhemolytic enterotoxin that acts as a serine protease. The toxin can be partially neutralized by serum antiaerolysin and it induced not only cytoplasmatic vacuole formation, but also mitochondrial disorders that must be signaling the apoptotic pathways, leading to Vero (African green monkey kidney) cell death. These results suggest that the VCF is a virulence factor of these bacteria, participating in the processes of human disease provoked by preformed toxins in food and infection.
Assuntos
Aeromonas/patogenicidade , Apoptose , Toxinas Bacterianas/isolamento & purificação , Toxinas Bacterianas/toxicidade , Enterotoxinas/isolamento & purificação , Enterotoxinas/toxicidade , Animais , Anticorpos Antibacterianos/imunologia , Antitoxinas/imunologia , Chlorocebus aethiops , Citoplasma/patologia , Histocitoquímica , Humanos , Mitocôndrias/patologia , Serina Endopeptidases/isolamento & purificação , Serina Endopeptidases/toxicidade , Vacúolos , Células VeroRESUMO
In this study, an efficient expression system, based on the pET32Xa/LIC vector, for producing a Xylella fastidiosa virulence-associated protein D, found to have a strong similarity to Riemerella anatipestifer and Actinobacillus actinomycetencomitans VapD protein, is presented. The protein has a molecular mass of 17.637 Da and a calculated pI of 5.49. The selected XFa0052 gene was cloned in the pET32Xa/LIC vector and the plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) strain at 37 degrees C, with an induction time of 2 h and 1 mM IPTG concentration. The protein present in the soluble fraction was purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC), and had its identity determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and N-terminal sequencing. The purified protein was found as a single band on SDS-PAGE and its correct folding was verified by circular dichroism spectroscopy.
Assuntos
Proteínas de Bactérias/fisiologia , Bioquímica/métodos , Glicoproteínas de Membrana/fisiologia , Xylella/metabolismo , Xylella/patogenicidade , Sequência de Aminoácidos , Proteínas de Bactérias/química , Sequência de Bases , Cromatografia , Dicroísmo Circular , Clonagem Molecular , Eletroforese em Gel de Poliacrilamida , Escherichia coli/metabolismo , Vetores Genéticos , Isopropiltiogalactosídeo/química , Espectrometria de Massas , Glicoproteínas de Membrana/química , Dados de Sequência Molecular , Fases de Leitura Aberta , Plasmídeos/metabolismo , Reação em Cadeia da Polimerase , Estrutura Terciária de Proteína , Proteínas Recombinantes de Fusão/química , Homologia de Sequência do Ácido Nucleico , Espectrometria de Massas por Ionização e Dessorção a Laser Assistida por Matriz , Fatores de TempoRESUMO
The H-NS protein is one of the major constituents of the nucleoid structure that has been implicated in the DNA packaging and in the global regulation of gene expression. The study of this transcriptional regulator is an effort to fight Xylella fastidiosa, a citrus pathogen responsible for a range of economically important plant diseases, including the citrus variegated chlorosis (CVC). The putative H-NS ORF was cloned into a pET32-Xa/LIC vector in order to overexpress it coupled with fusion tags in Escherichia coli BL21(DE3). The expressed recombinant protein was purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and its identity verified by mass spectrometry (MALDI-TOF). Final purification was performed by cation-exchange chromatography (SP Sepharose Fast Flow) and the purified protein was found as a single band on SDS-PAGE. The folding and its DNA binding activity were verified by circular dichroism and fluorescence spectroscopy, respectively.
Assuntos
Proteínas de Bactérias/biossíntese , Proteínas de Bactérias/isolamento & purificação , Proteínas de Ligação a DNA/biossíntese , Proteínas de Ligação a DNA/isolamento & purificação , Xylella/química , Sequência de Aminoácidos , Proteínas de Bactérias/química , Proteínas de Bactérias/genética , Dicroísmo Circular , Proteínas de Ligação a DNA/química , Proteínas de Ligação a DNA/genética , Escherichia coli , Fator Xa/genética , Fator Xa/metabolismo , Fluorescência , Vetores Genéticos/genética , Espectrometria de Massas , Dados de Sequência Molecular , Proteínas Recombinantes de Fusão/química , Proteínas Recombinantes de Fusão/genética , Proteínas Recombinantes de Fusão/isolamento & purificação , Alinhamento de SequênciaRESUMO
O fator hemaglutinante (HAF) foi extraido e purificado a partir de amostra de Escherichia coli de aderencia difusa (DAEC), pertencente ao sorogrupo 0128 de E. coli enteropatogenica classica (EPEC). O peso molecular do HAF foi estimado em 18.000 Da usando SDS-PAGE de 66.000 Da empregando Sephadex G 100, o que sugere a estrutura do HAF consistir de 3 a 4 subunidades. O emprego da tecnica "gold immunolabeling" com antissoro especifico anti-HAF revelou que este valor nao e uma estrutura do tipo fimbria na superficie da bacteria...
