RESUMO
An expansion of the polyglutamine (polyQ) tract within the deubiquitinase ataxin-3 protein is believed to play a role in a neurodegenerative disorder. Ataxin-3 contains a Josephin catalytic domain and a polyQ tract that renders it intrinsically prone to aggregate, and thus full-length protein is difficult to characterize structurally by high-resolution methods. We established a robust protocol for expression and purification of wild-type and expanded ataxin-3, presenting 19Q and 74Q, respectively. Both proteins are monodisperse as assessed by analytical size exclusion chromatography. Initial biophysical characterization was performed, with apparent transition melting temperature of expanded ataxin-3 lower than the wild-type counterpart. We further characterize the molecular envelope of wild-type and expanded polyQ tract in ataxin-3 using small angle X-ray scattering (SAXS). Characterization of protein-protein interactions between ataxin-3 and newly identified binding partners will benefit from our protocol.
Assuntos
Ataxina-3/química , Doença de Machado-Joseph/genética , Peptídeos/química , Proteínas Recombinantes/química , Proteínas Repressoras/química , Ataxina-3/biossíntese , Ataxina-3/genética , Ataxina-3/isolamento & purificação , Cromatografia em Gel/métodos , Clonagem Molecular , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Vetores Genéticos/metabolismo , Humanos , Leucócitos Mononucleares/metabolismo , Leucócitos Mononucleares/patologia , Doença de Machado-Joseph/metabolismo , Doença de Machado-Joseph/patologia , Modelos Moleculares , Peptídeos/metabolismo , Domínios Proteicos , Dobramento de Proteína , Estrutura Secundária de Proteína , Proteínas Recombinantes/biossíntese , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/isolamento & purificação , Proteínas Repressoras/biossíntese , Proteínas Repressoras/genética , Proteínas Repressoras/isolamento & purificação , Espalhamento a Baixo Ângulo , Difração de Raios XRESUMO
Seqüências do banco de dados SUCEST foram analisadas baseado em suas identidades com genes relacionados que codificam enzimas chalcone sintase (CHS). A seqüência da proteína CHS de sorgo (gi-12229613), foi usada para a busca de seqüências no banco de dados do SUCEST, que foram mais similares à CHS. Baseado na similaridade das seqüências de aminoácidos deduzidas, quatorze conjuntos formados por 121 seqüências, foram divididos em dois grupos. O primeiro grupo é mais similar à CHS de sorgo (EC 2.3.1.74) e apresenta a seqüência consenso do sítio ativo de chalcone e stilbene sintase. Análises da expressäo gênica, baseada no número de seqüências de uma dada biblioteca presente em cada grupo, indicaram que neste caso, a maioria das seqüências säo de bibliotecas preparadas de raiz e flores de cana-de-açúcar. O segundo grupo é mais similar à seqüência de aminoácidos deduzida de uma proteína, näo caracterizada, induzida por patógeno (PIl, gi-9855801-) do banco de dados de EST de Sorghum bicolor. Estas duas seqüências de proteínas säo 90 por cento idênticas e tem duas mudanças de aminoácidos no consenso padräo de chalcone e stilbene sintase, e conservam o resíduo de cisteína na posiçäo do sítio ativo. Esta EST näo foi associada a chalcone sintase antes, e apresenta diferenças na seqüência consenso da CHS previamente descrita de sorgo. A maioria das seqüências do segundo grupo säo de bibliotecas de cana-de-açúcar preparadas de raiz e plantas infectadas com Herbaspirillum rubrisubalbicans e Gluconacetobacter diazotroficans. Os resultados indicam que nós identificamos uma chalcone sintase, tal como a encontrada no banco de cDNA de sorgo em uma biblioteca induzida por patógeno, expressa em plantas de cana-de-açúcar, e que ambas as proteínas säo novos membros da super família chalcone e stilbene sintase.
