Quantum biochemical analysis of the TtgR regulator and effectors.

The recent expansion of multidrug-resistant (MDR) pathogens poses significant challenges in treating healthcare-associated infections. Although antibacterial resistance occurs by numerous mechanisms, active efflux of the drugs is a critical concern. A single species of efflux pump can produce a simultaneous resistance to several drugs. One of the best-studied efflux pumps is the TtgABC: a tripartite resistance-nodulation-division (RND) efflux pump implicated in the intrinsic antibiotic resistance in Pseudomonas putida DOT-T1E. The expression of the TtgABC gene is down-regulated by the HTH-type transcriptional repressor TtgR. In this context, by employing quantum chemistry methods based on the Density Functional Theory (DFT) within the Molecular Fragmentation with Conjugate Caps (MFCC) approach, we investigate the coupling profiles of the transcriptional regulator TtgR in complex with quercetin (QUE), a natural polyphenolic flavonoid, tetracycline (TAC), and chloramphenicol (CLM), two broad-spectrum antimicrobial agents. Our quantum biochemical computational results show the: [i] convergence radius, [ii] total binding energy, [iii] relevance (energetically) of the ligands regions, and [iv] most relevant amino acids residues of the TtgR-QUE/TAC/CLM complexes, pointing out distinctions and similarities among them. These findings improve the understanding of the binding mechanism of effectors and facilitate the development of new chemicals targeting TtgR, helping in the battle against the rise of resistance to antimicrobial drugs. These advances are crucial in the ongoing fight against rising antimicrobial drug resistance, providing hope for a future where healthcare-associated infections can be more beneficially treated.

New ethionamide boosters and EthR2: structural and energetic analysis.

Ethionamide (ETH) is a high-profile drug for the treatment of patients with multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis and, in order to produce its inhibitory effects, it needs to be bioactivated by monooxygenase EthA. This process is under the control of the transcriptional repressors EthR and EthR2, so that their inhibition results in the boosting of ethionamide activation. Herein, through crystallographic data and computer simulations, we calculated the interaction binding energies of four inhibitors with improved in vitro potency, namely BDM76060 (PDB ID: 6HS1), BDM72201 (PDB ID: 6HRX), BDM76150 (PDB ID: 6HS2) and BDM72719 (PDB ID: 6HRY), in complexes with the transcriptional repressor EthR2, using density functional theory (DFT) within the molecular fractionation with conjugated caps (MFCC) approach. It was observed that these ligands share the same binding site within a 10.0 Å radius of the EthR2 protein; however, their structural particularities have a significant impact on the global energies of systems. The BDM72201 and BDM72719 components are weakly attached to the binding site, while BDM76060 and BDM76150 components produce stronger bonds, corroborating with experimental studies demonstrating that BDM76060 and BDM76150 are more successful in producing inhibitory effects. BDM76060 and BDM76150 have many functional groups that increase the contact surface with the protein and attract a more significant number of amino acid residues, being able to produce polarities that generate stronger interactions. In the current scenario of a growing number of cases of bacterial resistance, the obtained data can be used to guide clinical trials of these inhibitors and other inhibitors that act on the alternative EthR2 pathway, focusing on improving the activity of ethionamide, its effectiveness, a reduction in the treatment time and exposure to cytotoxic effects.

Insecticide toxicity to the borer Neoleucinodes elegantalis (Guenée) (Lepidoptera: Crambidae): developmental and egg-laying effects.

Neoleucinodes elegantalis (Guenée) (Lepidoptera: Crambidae) is one of the major pests of solanaceous plants in South America. It is considered a great threat by the European and Mediterranean Plant Protection Organization due to the serious economic damage that it causes on tomato farms; therefore, controlling this pest is a challenging task in South America. Controlling N. elegantalis at the egg stage is the best way to prevent it from damaging crops; however, thorough studies about the effectiveness of chemicals on the different life stages of this insect pest are lacking. In this study, the effects of different chemical classes were evaluated on N. elegantalis adults, female oviposition behavior, larvae, eggs, and embryonic development. None of the tested insecticides demonstrated toxicity to the adults; however, the results showed that cartap hydrochloride affects oviposition behavior. Moreover, methomyl and cartap hydrochloride exhibited high toxicity against the eggs and larvae, with higher than 80% of mortality. These insecticides interrupted larval hatching and caused alterations in the chorion layer. Flubendiamide and deltamethrin demonstrated toxicity on N. elegantalis larvae; however, lufenuron, indoxacarb, methoxyfenozide, and chlorantraniliprole demonstrated low toxicity on both eggs and larvae, with lower than 70% of mortality. Fruit treated with cartap hydrochloride had a deterrent effect. The ovicidal activity revealed by methomyl and cartap hydrochloride might provide new approaches regarding insecticide effects on eggs. Methomyl, cartap hydrochloride, flubendiamide, and deltamethrin demonstrated toxicity on larvae. The evaluation of the chorion of the eggshell in this study has clarified the toxic effect of methomyl and cartap hydrochloride on eggs.

Desenvolvimento de embriões de camundongas após manutenção em diferentes soluções de manipulação / Development of mice embryos after maintenance in different manipulation solutions

Avaliou-se a eficácia de duas soluções de manipulação (SM) de embriões de camundongas nos estádios de blastocisto inicial (Bin), mórula compacta grau I (McI) e II (McII), distribuídos aleatoriamente em três tratamentos (T), de acordo com a solução de manutenção. No T1 usou-se PBS modificado (controle); no T2, SME e no T3, SME enriquecida. Os embriões foram mantidos durante quatro horas na solução de manutenção e posteriormente classificados quanto ao estádio de desenvolvimento e à qualidade embrionária. Logo após, foram cultivados em meio TCM 199 e classificados novamente quanto ao estádio de desenvolvimento e à qualidade embrionária. A taxa de desenvolvimento dos embriões após manutenção por quatro horas em solução de manipulação foi menor (P<0,05) nos embriões do controle, comparada à de embriões do SME e SME enriquecida, diferença esta não observada (P>0,05) após o cultivo in vitro. Os embriões McII do T3 tiveram maior desenvolvimento (P<0,05) em relação aos embriões do T1 e T2, indicando o efeito benéfico do enriquecimento da solução SME. Conclui-se que as soluções de manipulação SME e SME enriquecida influenciaram beneficamente o desenvolvimento de embriões.

The effect of embryo manipulation solution followed by in vitro culture in mice embryos was studied. The embryos at early blastocyst (Bin), and compact morula grades I (McI) and II (McII) were randomly assigned into three treatments. T1 used modified PBS (control), T2 used EMS, and T3 used EMS supplemented. In each treatment, the embryos were kept in manipulation solution for four hours. Finishing the manipulation period, the embryos were classified according the development stage and quality. Following, the embryos were cultured in TCM 199. After the culture period, the embryos were evaluated according to quality and development stage. The development rate for Bin, McI, and McII after maintenance for four hours in manipulation solution was lower for control embryo (P>0.05) as compared to EMS and EMS supplemented embryos. After in vitro culture, no differences (P>0.05) on embryo development rate among control, EMS, and EMS supplemented were observed. Moreover, McII from EMS supplemented had a higher development (P<0.05) (93 percent) as compared to control (82.5 percent) and EMS (83.9 percent), suggesting a beneficial effect of EMS supplemented. EMS and EMS supplemented embryos had a positive effect on embryo development, showing higher embryo development than those in PBS solution.

Nova técnica para contagem do número de células de blastocistos / A new technique to count the number of cells of blastocysts

A simplified, fast, and innovative method was developed to count the total cell number in blastocysts. Murine blastocysts (N = 195) were used in this study. They were obtained after 10h culture of initial blastocysts, compact morulae grades I and II recovered from superovulated mouse. After culture, the blastococysts were selected to test the new proposal of counting. The process was done after embryo fixation in a sodium citrate solution, and adherence in glass slide. Following, the coloration was done using a fast panoptic coloration kit. As a result, it was possible to identify the blastomeres and count them in each blastocyst. This method provided a fast and effective analysis of the total cell number when compared with other techniques. Moreover, this new method shows advantages related to the cell visualization, which can be done in more simple equipment like stereoscopic microscope. Other interesting observed point was the long period of time and quality that the coloration stays on slides, considering other techniques.

Cultivo in vitro de ovócitos bovinos em diferentes sistemas: I- efeito na maturaçäo nuclear / In vitro cultivation of bovine oocytes under different conditions: I-Effect on nuclear maturation

Foram utilizados ovócitos com o cumulus compacto, distribuídos em três tratamentos: I - meio de cultivo constituído de meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (20µg/ml) e soro inativado de vaca em estro (10 por cento); II - meio de cultivo acrescido de células da granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml); III - monocamada de células da granulosa em meio de cultivo. As formas foram obtidas em zero, 12, 18, 24 e 30 horas de cultivo in vitro, para exame da configuraçäo cromossômica. Foram utilizados 1251 ovócitos com os seguintes resultados de maturaçäo nuclear, para os tratamentos I, II e III, respectivamente: 12 horas de cultivo, 1 (1,08 por cento), 1 (1,08 por cento) e 2 (2,17 por cento); 18 horas, 70 (76,92 por cento), 50 (56,82 por cento) e 46 (54,12 por cento); 24 horas, 93 (89,42 por cento), 81 (93,10 por cento) e 71 (85,54 por cento); 30 horas, 77 (89,53 por cento), 78 (91,76 por cento) e 63 (90,00 por cento). Os resultados foram elevados e significativos (P<0,01) na taxa de maturaçäo com 18 horas de cultivo, para os ovócitos cultivados segundo o tratamento I. Eles sugerem a fecundaçäo in vitro após 18 horas de cultivo, no caso da maturaçäo em meio sem células da granulosa, diferenciando do tempo usualmente utilizado de 24 horas, quando se utiliza o co-cultivo com células da granulosa

Cultivo in vitro de ovócitos bovinos em diferentes sistemas: II - aspectos ultra-estruturais / In vitro cultivation of bovine oocytes, under different conditions: II - ultrastructural aspects

Para avaliar o efeito de sistemas de cultivo in vitro na ultra-estrutura celular, foram cultivados ovócitos com o cumulus compacto distribuídos em três tratamentos: I - meio de cultivo constituído de meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (20µg/ml) e soro inativado de vaca em estro (10 por cento); II - meio de cultivo acrescido de células da granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml); III - monocamada de células da granulosa em meio de cultivo. As amostras foram obtidas em zero, 12, 18, 24 e 30 horas de cultivo e submetidas aos procedimentos para a análise ultra-estrutural. As características verificadas nos ovócitos foram caracterizadas em cinco configuraçöes (C1 a C5), levando em consideraçäo vários estádios de maturaçäo. Para esta classificaçäo foram consideradas as modificaçöes ultra-estruturais no interior do ovócito, sendo C1 um ovócito sem alteraçäo indicativa de reativaçäo da meiose, C2, C3 e C4 estádios intermediários e C5 um ovócito maduro caracterizado principalmente pela configuraçäo cromossômica em metáfase II e pela distribuiçäo dos grânulos corticais em posiçöes solitárias nas proximidades da membrana citoplasmática. Foram verificados os seguintes resultados, para os tratamentos I, II e III, respectivamente: zero hora (C1 e C2, C1 e C2, C1 e C2), 12 horas (C4, C3 e C3), 18 horas (C5, C4 e C4), 24 horas (C5, C5 e C5) e 30 horas (C5, C5 e C5). No cultivo sem células da granulosa, as características que configuram um ovócito maduro sob aspecto ultra-estrutural já ocorrem com 18 horas de cultivo

Cultivo in vitro de ovócitos bovinos em diferentes sistemas: III - capacidade de desenvolvimento após a fecundaçäo / In vitro cultivation of bovine oocytes under different conditions: III - development after fecundation

Para avaliar o efeito de sistemas de maturaçäo in vitro, na capacidade de desenvolvimento após a fecundaçäo, foram cultivados ovócitos com o cumulus compacto, distribuídos em três tratamentos: I - meio de cultivo constituído de meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (20µg/ml) e soro inativado de vaca em estro (10 por cento); II - meio de cultivo acrescido de células da granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml); III - monocamada de células da granulosa em meio de cultivo. Após 18 horas de maturaçäo no tratamento I e 24 horas nos tratamentos II e III, os ovócitos foram fecundados in vitro, com sêmen congelado. Dezoito horas após o início da inseminaçäo, os zigotos foram cultivados in vitro por sete dias, em monocamada de células da tuba uterina. No sétimo dia, uma amostragem de zigotos foi submetida à hipotonizaçäo e coloraçäo, para avaliar o número de células. Os resultados da taxa de fecundaçäo, da clivagem e do número de células foram 92,96, 59,86 e 87,16; 85,39, 61,43 e 104,00; 79,37, 60,00 e 131,16, para ovócitos maturados pelos tratamentos I, II, III, respectivamente. A análise pelo qui quadrado da taxa de fecundaçäo e de clivados e a análise de variância do número de células näo apresentaram diferenças (P>0,05) entre tratamentos. Os resultados demonstram que näo há diferenças na taxa de fecundaçäo e capacidade de desenvolvimento dos ovócitos, quando a fecundaçäo é realizada com 18 horas no caso de maturaçäo sem células e com 24 horas quando a maturaçäo é realizada em co-cultivo de células da granulosa

Tipos morfológicos de ovócitos bovinos / Morphological types of bovine oocytes

Foram utilizados ovários de vacas abatidas em matadouro para estudar o tipo de envoltório celular em 14.583 ovócitos. Após aspiraçäo dos folículos, os complexos "cumulus-ovócitos" foram lavados e classificados da seguinte maneira: 1-corona radiata intacta e mais de três camadas compactas de células do cumulus oophorus; 2-uma a três camadas de células envolvendo o ovócito; 3-parcialmente recoberto por células da corona radiata e o cumulus oophorus; 4-células do cumulus oophorus apresentando expansäo; 5-desnudo; 6-ovócitos apresentando características que näo configuram em nenhuma classificaçäo anteriormente citada. As freqüências encontradas foram 69,3; 7,8; 6,7; 11,1; 4,7 e 0,3 por cento, para as categorias 1, 2, 3, 4, 5 e 6 respectivamente. Ficou caracterizada a importância de estudos de maturaçäo e fecundaçäo in vitro, com ovócitos apresentando o cumulus compacto, devido à sua elevada incidência em ovários de vacas

Técnica simplificada para desnudamento rápido de ovócitos bovinos / A simplified technic for rapid denudation of bovine oocytes

Foram utilizados ovócitos com cumulus compactos cultivados in vitro, oriundos de 1.854 ovários de vacas abatidas em matadouro. O cultivo foi realizado em meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (20µg/ml) e soro inativado de vaca em estro (10 por cento), acrescido de células da granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml). As amostras foram obtidas em 0, 12, 18, 24 e 30 horas de cultivo, para o procedimento da desnudaçäo. O desnudamento foi realizado através de pipeta automática de 100µl utilizando ponteira com medidas específicas e placa escavada de vidro com capacidade de 1,5ml, onde eram colocados os ovócitos com 1 ml de Meio Talpes. Os movimentos de aspiraçöes e injeçöes do meio com os ovócitos possibilitaram o desnudamento após um período máximo de cinco minutos. Foram desnudados 3.450 ovócitos, sendo 690 para cada tempo de cultivo. Raramente foi verificada a permanência de ovócito näo desnudado totalmente após o uso da técnica

Técnica para avaliaçäo do estádio de maturaçäo nuclear de ovócitos bovinos cultivados in vitro / Technic for evaluating nuclear maturation of bovine oocytes cultured in vitro

Foi desenvolvida uma técnica para avaliaçäo do estádio de maturaçäo nuclear de ovócitos de bovinos, que permitisse clara visualizaçäo das configuraçöes cromossômicas. Após aspiraçäo de folículos oriundos de ovários de vacas abatidas em matadouro, os complexos "cumulus-ovócitos" foram lavados e em seguida classificados em categorias quanto ao tipo de envoltório celular. Ovócitos com cumulus compacto foram cultivados em diferentes tempos, em meio de cultura de tecido (TCM) acrescido de FSH (2µg/ml), soro inativado de vaca em estro (10 por cento) e células de granulosa em suspensäo (2 x 10 elevado a sexta potência/ml). Foram analisadas 1.371 lâminas confeccionadas de ovócitos cultivados por 0, 12, 18, 24 e 30 horas. A técnica permitiu clara visualizaçäo dos bivalentes na metáfase I e dos monovalentes na metáfase II, mantendo ainda a integridade da configuraçäo cromossômica típica na anáfase I e metáfase II, apesar da hipotonizaçäo realizada. Além disso, manteve a disposiçäo dos cromossomos do primeiro corpúsculo polar, quando presente