Conditioned medium: a new alternative for cryopreservation of equine umbilical cord mesenchymal stem cells.

Cryopreservation is a feasible alternative to maintaining several cell lines, particularly for immediate therapeutic use, transportation of samples, and implementation of new in vitro studies. This work parts from the hypothesis that the medium of cryopreservation composed by 90% of conditioned medium (CM) supports cryopreservation of equine umbilical cord intervascular matrix mesenchymal stem cells (UCIM-MSCs), allowing the maintenance of the biological properties for the establishment of cell banks intended for therapeutic use and in vitro studies. Thus, we evaluated the viability, apoptosis/necrosis rates, immunophenotypic profile (IP), chromosomal stability, clonicity, and differentiation potential of UCIM-MSCs cryopreserved with four different mediums (with FBS: M1, M3, M4 and without FBS: M2). After 3 months of cryopreservation, samples were thawed and analyzed. The potential of differentiation in the mesodermal lineages, clonicity, and the chromosomal stability were maintained after cryopreservation of UCIM-MSCs with medium containing FBS. Changes (P < 0.05) at IP for some markers were observed at cells cryopreserved with medium M1-M3. Only the UCIM-MSCs cryopreserved with the CM (M4) had similar viability post-thaw (P = 0.23) when compared with fresh cells. We proved the hypothesis that the medium of cryopreservation containing CM supports the cryopreservation of UCIM-MSCs, at the experimental conditions, being the medium that better maintains the biological characteristics observed at fresh cells. Thus, future studies of UCIM-MSCs secretome should be conducted to better understand the beneficial and protective effects of the CM during the freezing process.

Feasibility and safety of intrathecal transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in horses.

BACKGROUND: Recent studies have demonstrated numerous biological properties of mesenchymal stem cells and their potential application in treating complex diseases or injuries to tissues that have difficulty regenerating, such as those affecting the central and peripheral nervous system. Thus, therapies that use mesenchymal stem cells are promising because of their high capacity for self-regeneration, their low immunogenicity, and their paracrine, anti-inflammatory, immunomodulatory, anti-apoptotic and neuroprotective effects. In this context, the purpose of this study was to evaluate the feasibility and safety of intrathecal transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in horses, for future application in the treatment of neurological diseases. RESULTS: During the neurological evaluations, no clinical signs were observed that were related to brain and/or spinal cord injury of the animals from the control group or the treated group. The hematological and cerebrospinal fluid results from day 1 and day 6 showed no significant differences (P > 0.05) between the treated group and the control group. Additionally, analysis of the expression of matrix metalloproteinase (MMP) -2 and -9 in the cerebrospinal fluid revealed only the presence of pro-MMP-2 (latent), with no significant difference (P > 0.05) between the studied groups. CONCLUSIONS: The results of the present study support the hypothesis of the feasibility and safety of intrathecal transplantation of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells, indicating that it is a promising pathway for cell delivery for the treatment of neurological disorders in horses.

Crucial surviving aspects for vitrified in vitro-produced bovine embryos.

The objective of the present study was to correlate some parameters (cleavage, blastocyst production, quality degree score, total cell number, fresh apoptosis and lipid content) with embryo survival after cryopreservation. A total of 1727 in vitro-produced bovine blastocysts were used to establish the parameters (mean ± standard error of the mean (SEM)) for cleavage (85.6 ± 0.8), blastocyst production (39.9 ± 1.4), quality degree score (1.6 ± 0.1), total cell number (140.1 ± 2.9), fresh apoptosis (20.8 ± 1.1) and lipid content (21.3 ± 0.8 droplets). On the same way 1316 blastocysts were vitrified for the determination of post-cryopreservation embryo survival (49.4 ± 1.9). Fresh apoptosis rate and total lipid droplets value were correlated (P < 0.05) with embryo survival after cryopreservation (r = 0.91 and r = 0.59; respectively). However, cleavage, blastocyst production, quality degree score and total cell number were not correlated (P > 0.05) with embryo cryotolerance (r = 0.23, r = 0.38, r = 0.22 and r = 0.28; respectively). Therefore, the increased lipid content was moderately correlated with apoptosis in vitrified blastocysts. On the other hand, increased apoptosis in fresh blastocysts was strongly correlated with apoptosis in vitrified blastocysts, which indicated that the apoptosis rate in fresh embryos was a better parameter than the lipid content to predict post-vitrification embryo survival.

CONSIDERAÇÕES A RESPEITO DO PÓS-PARTO EM BOVINOS.

O puerpério é conhecido como o período que se inicia após o parto e persiste até o restabelecimento da condição de um animal não gestante. Compreendem na liberação dos restos placentários, involução uterina e mecanismos tais como contração uterina e digestão enzimática contribuem para a correta execução desses processos. Sua duração é variável e dependente de vários fatores tais como escore de condição corporal (ECC), produção leiteira, nutrição, condição uterina, entre outros. Tem-se também que para o estabelecimento de nova prenhez, é necessário que ocorra o retorno à ciclicidade por meio do crescimento, maturação e ovulação de um folículo e oócito sadios. Tal fato pode ser afetado pela presença do bezerro, amamentação e ECC em bovinos de corte e balanço energético, escore corporal, parição, estação do ano e doenças em bovinos de leite. Adicionalmente, é de extrema importância a característica do útero para o restabelecimento do estado reprodutivo fisiológico. Doenças uterinas podem afetar na liberação de substâncias que podem ser responsáveis pelo encurtamento ou prolongamento dos ciclos ovarianos, o que pode ocasionar perdas econômicas pelo fato de não atingir-se o desejável de produção de 1 bezerro/vaca/ano.

ASPECTOS ULTRAESTRUTURAIS DOS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITO DE MAMÍFEROS DOMÉSTICOS

Nos mamíferos domésticos, a competência oocitária para suportar os subseqüentes estadios de desenvolvimento, que envolve os processos de fertilização e embriogênese inicial, depende não apenas da correta segregação cromossômica que caracteriza a maturação nuclear, mas principalmente, das modificações morfológicas e funcionais ao longo da oogênese e maturação citoplasmática. Qualquer distúrbio no padrão de desenvolvimento e migração das organelas citoplasmáticas assim como no processo de transcrição gênica, síntese proteica e expansão das células do cumulus resultará em menor potencial de desenvolvimento oocitário. Deste modo, dada a relevância do tema, esta revisão visa elucidar os principais aspectos ultraestruturais dos complexos cumulus-oócitos de mamíferos com ênfase aos eventos biológicos que ocorrem ao longo da maturação oocitária.

Aspectos ultraestruturais dos complexos cumulus-oócito de mamíferos domésticos

Nos mamíferos domésticos, a competência oocitária para suportar os subseqüentes estadios de desenvolvimento, que envolve os processos de fertilização e embriogênese inicial, depende não apenas da correta segregação cromossômica que caracteriza a maturação nuclear, mas principalmente, das modificações morfológicas e funcionais ao longo da oogênese e maturação citoplasmática. Qualquer distúrbio no padrão de desenvolvimento e migração das organelas citoplasmáticas assim como no processo de transcrição gênica, síntese proteica e expansão das células do cumulus resultará em menor potencial de desenvolvimento oocitário. Deste modo, dada a relevância do tema, esta revisão visa elucidar os principais aspectos ultraestruturais dos complexos cumulus-oócitos de mamíferos com ênfase aos eventos biológicos que ocorrem ao longo da maturação oocitária.

ANEUPLOIDIA DAS CÉLULAS DA GLIA PROVENIENTES DA CULTURA DE MEDULA ESPINHAL DE EQUINO NEONATO

O objetivo desta comunicação é relatar a ocorrência de aneuploidia em células da glia provenientes do cultivo da medula espinhal de um equino neonato. As células foram mantidas em cultivo até a sexta passagem e caracterizadas pela técnica de imunocitoquimica previamente à análise citogenética. A análise do cariótipo revelou perda ou ganho de um ou mais cromossomos nas células gliais analisadas, quando comparado ao cariótipo normal para espécie equina. A ocorrência de aneuploidia pode ser considerada um achado normal em células jovens, bem como um sinal de enfermidade severa. Desta forma, outros estudos citogenéticos devem ser realizados para elucidar se a elevada ocorrência de aneulpoidia observadas em células da glia no sistema nervoso de neonato equino é achado fisiológico ou patológico.

APLICAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO GUIADA POR ULTRASSOM EM LESÃO DO NERVO RADIAL EM CÃO - RELATO DE CASO

As células-tronco mesenquimais (CTMs)  são células  indiferenciadas que podem ser isoladas de diferentes tecidos, mas primariamente do estroma da medula óssea, e dão origem a tecidos conjuntivos, como ossos, cartilagens, gordura, bem como o sistema vascular e hematopoiético(1,3,4). Descobertas científicas têm demonstrado o potencial de aplicação terapêutico das  CTMs em enfermidades complexas ou lesões de difícil reparação, como as do sistema nervoso, em virtude das suas propriedades  regenerativas, antiinflamatórias e imunomoduladoras (3,4). Entretanto, é importante ressaltar que algumas dificuldades ainda são encontradas para o implante das CTMs no sistema nervoso central e periférico, particularmente em relação a forma de aplicação das células no foco de lesão. Sendo assim, a aplicação  guiada das CTMs com ultrassom se mostra uma alternativa viável para o sistema nervoso periférico, visto que é de fácil aplicação e baixo custo relativo(6). O ultrassom é eficiente na identificação de alterações dos nervos periféricos, para guiar procedimentos como biópsias e mais recentemente na Medicina Veterinária, para auxiliar na terapia celular (2,5). Nesse sentido, o objetivo deste trabalho é relatar um caso bem sucedido de implante de CTMs guiado com ultrassom para o tratamento de lesão de nervo radial em um cão.

Aplicação de células tronco guiada por ultrassom em lesão do nervo radial em cão - relato de caso

As células-tronco mesenquimais (CTMs)  são células  indiferenciadas que podem ser isoladas de diferentes tecidos, mas primariamente do estroma da medula óssea, e dão origem a tecidos conjuntivos, como ossos, cartilagens, gordura, bem como o sistema vascular e hematopoiético(1,3,4). Descobertas científicas têm demonstrado o potencial de aplicação terapêutico das  CTMs em enfermidades complexas ou lesões de difícil reparação, como as do sistema nervoso, em virtude das suas propriedades  regenerativas, antiinflamatórias e imunomoduladoras (3,4). Entretanto, é importante ressaltar que algumas dificuldades ainda são encontradas para o implante das CTMs no sistema nervoso central e periférico, particularmente em relação a forma de aplicação das células no foco de lesão. Sendo assim, a aplicação  guiada das CTMs com ultrassom se mostra uma alternativa viável para o sistema nervoso periférico, visto que é de fácil aplicação e baixo custo relativo(6). O ultrassom é eficiente na identificação de alterações dos nervos periféricos, para guiar procedimentos como biópsias e mais recentemente na Medicina Veterinária, para auxiliar na terapia celular (2,5). Nesse sentido, o objetivo deste trabalho é relatar um caso bem sucedido de implante de CTMs guiado com ultrassom para o tratamento de lesão de nervo radial em um cão.

ASPECTOS BIOQUÍMICOS E ULTRAESTRUTURAIS DA MATURAÇÃO OOCITÁRIA

A maturação oocitária consiste numa etapa crucial e limitante para a produção de embriões in vitro, uma vez que o potencial de desenvolvimento oocitário e embrionário está diretamente relacionado à adequada maturação citoplasmática e nuclear. O bloqueio, reinício e progressão das divisões meióticas assim como as modificações moleculares e estruturais são fundamentais para que o oócito possa finalizar o processo de maturação, sofrer a fertilização, e sustentar os estádios iniciais do desenvolvimento embrionário. Estes eventos envolvem uma complexa interação entre segundo mensageiros, proteínas quinases e fosfatases, que ainda não está totalmente esclarecida. A maturação oocitária in vitro, no entanto, difere em determinados aspectos do observado in vivo. Deste modo, o esclarecimento dos mecanismos de ação das diversas moléculas envolvidas na regulação do processo de maturação oocitária é fundamental para o progresso científico e biotecnológico.Palavras-chave: oócito, maturação, meiose, in vivo, in vitro BIOCHEMICAL AND ULTRASTRUCTURAL ASPECTS OF OOCYTE MATURATION ABSTRACT The oocyte maturation is a crucial and limiting step for the in vitro embryo production, since the development potential of oocytes and embryos is directly related to proper nuclear and cytoplasmic maturation. The arrest, resumption and progression of meiotic divisions as well as molecular and structura

Aspectos bioquímicos e ultraestruturais da maturação oocitária

A maturação oocitária consiste numa etapa crucial e limitante para a produção de embriões in vitro, uma vez que o potencial de desenvolvimento oocitário e embrionário está diretamente relacionado à adequada maturação citoplasmática e nuclear. O bloqueio, reinício e progressão das divisões meióticas assim como as modificações moleculares e estruturais são fundamentais para que o oócito possa finalizar o processo de maturação, sofrer a fertilização, e sustentar os estádios iniciais do desenvolvimento embrionário. Estes eventos envolvem uma complexa interação entre segundo mensageiros, proteínas quinases e fosfatases, que ainda não está totalmente esclarecida. A maturação oocitária in vitro, no entanto, difere em determinados aspectos do observado in vivo. Deste modo, o esclarecimento dos mecanismos de ação das diversas moléculas envolvidas na regulação do processo de maturação oocitária é fundamental para o progresso científico e biotecnológico.Palavras-chave: oócito, maturação, meiose, in vivo, in vitro BIOCHEMICAL AND ULTRASTRUCTURAL ASPECTS OF OOCYTE MATURATION ABSTRACT The oocyte maturation is a crucial and limiting step for the in vitro embryo production, since the development potential of oocytes and embryos is directly related to proper nuclear and cytoplasmic maturation. The arrest, resumption and progression of meiotic divisions as well as molecular and structura

In vivo and in vitro evaluation of an Acetobacter xylinum synthesized microbial cellulose membrane intended for guided tissue repair.

BACKGROUND: Barrier materials as cellulose membranes are used for guided tissue repair. However, it is essential that the surrounding tissues accept the device. The present study histologically evaluated tissue reaction to a microbial cellulose membrane after subcutaneous implantation in mice. Furthermore, the interaction between mesenchymal stem cells and the biomaterial was studied in vitro to evaluate its ability to act as cellular scaffold for tissue engineering. METHODS: Twenty-five Swiss Albino mice were used. A 10 x 10 mm cellulose membrane obtained through biosynthesis using Acetobacter xylinum bacteria was implanted into the lumbar subcutaneous tissue of each mouse. The mice were euthanatized at seven, 15, 30, 60, and 90 days, and the membrane and surrounding tissues were collected and examined by histology. RESULTS: A mild inflammatory response without foreign body reaction was observed until 30 days post-surgery around the implanted membrane. Polarized microscopy revealed that the membrane remained intact at all evaluation points. Scanning electron microscopy of the cellulose membrane surface showed absence of pores. The in vitro evaluation of the interaction between cells and biomaterial was performed through viability staining analysis of the cells over the biomaterial, which showed that 95% of the mesenchymal stem cells aggregating to the cellulose membrane were alive and that 5% were necrotic. Scanning electron microscopy showed mesenchymal stem cells with normal morphology and attached to the cellulose membrane surface. CONCLUSION: The microbial cellulose membrane evaluated was found to be nonresorbable, induced a mild inflammatory response and may prove useful as a scaffold for mesenchymal stem cells.

SPERMATIC MORPHOLOGY ALTERATIONS IN BEEF BULLS SUPPLEMENTED OR NOT WITH ZINC IN MINERAL SALT / ALTERAÇÕES NA MORFOLOGIA ESPERMÁTICA EM TOUROS DE CORTE COM E SEM SUPLEMENTAÇÃO DE ZINCO NA MISTURA MINERAL

Seminal characteristics of bulls without Zn in the mineral supplementation (ZN-0, n=4, 0mg/Zn/kg/dia) were compared with bulls contemporary with appropriate mineral supplementation (ZN-60FI, n=4, 60mg/Zn/kg/dia). The semen was evaluated biweekly, between 17 and 29 months of age. The prevalence of abnormal chromatin and morphometric profile (length, superior and inferior width (µm) and area (µm2) of the sperm head were included in the analysis. ZN-0 bulls presented reduction of normal sperms in relation to ZN-60FI (63.3 ±2.88 x 74.5 ±2.83%), higher abnormal chromatin (16.7 ±2.05 x 9.3 ±0.81%) and abnormal intermediate piece (9.3 ±0.81 x 3.2 ±0.80%), respectively. Abnormalities of intermediate piece were characterized by irregularities in the mitochondrial organization and rupture of the external dense fibers in electronic microscopy. The area of head sperm of ZN-60 bulls was lower (25.0 ±3.8 x 27.9 ±4.6, p

rebanho sem Zn na suplementação mineral (ZN-0, n=4, 0mg/Zn/kg/dia) foram comparadas com as de touros contemporâneos criados com suplementação adequada (ZN-60FI, n=4, 60mg/Zn/kg/dia). O sêmen foi colhido quinzenalmente, entre 17 e 29 meses de idade. Incluíram-se no exame a análise da cromatina espermática e o perfil morfométrico da cabeça espermática, com base no comprimento, largura superior e inferior (µm) e área (µm2). Os touros do ZN-0 apresentaram redução de espermatozoides normais em relação ao ZN-60FI (62,4 ±2,88% x 74,5 ±2,83), sendo que a prevalência de anormalidades de cromatina (16,7 ±2,05%) e de defeitos de peça intermediária (9,3 ±0,81%) foi superior aos do ZN-60FI (9,5 ±2,03 e 3,2 ±0,80, respectivamente). A microscopia eletrônica de transmissão mostrou irregularidades mitocondriais e ruptura dos feixes de fibras densas externas.  Nos touros do ZN-60FI, a área da cabeça espermática foi proporcionalmente inferior a do ZN-0. Conclui-se que touros criados e mantidos a campo, provenientes de rebanhos com deficiência na suplementação de Zn, estão sujeitos à redução da qualidade seminal, por apresentarem maior frequência de anormalidades morfológicas, na cromatina, e nos padrões morfométricos da cabeça espermática com predomínio de lesões na estrutura mitocondrial e nos feixes de fibras densas na peça intermediária.PALAVRAS-CHAVES: Bovino, cromatina, morfometria espermáti

Spermatic morphology alterations in beef bulls supplemented or not with zinc in mineral salt / Alterações na morfologia espermática em touros de corte com e sem suplementação de zinco na mistura mineral

Seminal characteristics of bulls without Zn in the mineral supplementation (ZN-0, n=4, 0mg/Zn/kg/dia) were compared with bulls contemporary with appropriate mineral supplementation (ZN-60FI, n=4, 60mg/Zn/kg/dia). The semen was evaluated biweekly, between 17 and 29 months of age. The prevalence of abnormal chromatin and morphometric profile (length, superior and inferior width (µm) and area (µm2) of the sperm head were included in the analysis. ZN-0 bulls presented reduction of normal sperms in relation to ZN-60FI (63.3 ±2.88 x 74.5 ±2.83%), higher abnormal chromatin (16.7 ±2.05 x 9.3 ±0.81%) and abnormal intermediate piece (9.3 ±0.81 x 3.2 ±0.80%), respectively. Abnormalities of intermediate piece were characterized by irregularities in the mitochondrial organization and rupture of the external dense fibers in electronic microscopy. The area of head sperm of ZN-60 bulls was lower (25.0 ±3.8 x 27.9 ±4.6, p

rebanho sem Zn na suplementação mineral (ZN-0, n=4, 0mg/Zn/kg/dia) foram comparadas com as de touros contemporâneos criados com suplementação adequada (ZN-60FI, n=4, 60mg/Zn/kg/dia). O sêmen foi colhido quinzenalmente, entre 17 e 29 meses de idade. Incluíram-se no exame a análise da cromatina espermática e o perfil morfométrico da cabeça espermática, com base no comprimento, largura superior e inferior (µm) e área (µm2). Os touros do ZN-0 apresentaram redução de espermatozoides normais em relação ao ZN-60FI (62,4 ±2,88% x 74,5 ±2,83), sendo que a prevalência de anormalidades de cromatina (16,7 ±2,05%) e de defeitos de peça intermediária (9,3 ±0,81%) foi superior aos do ZN-60FI (9,5 ±2,03 e 3,2 ±0,80, respectivamente). A microscopia eletrônica de transmissão mostrou irregularidades mitocondriais e ruptura dos feixes de fibras densas externas.  Nos touros do ZN-60FI, a área da cabeça espermática foi proporcionalmente inferior a do ZN-0. Conclui-se que touros criados e mantidos a campo, provenientes de rebanhos com deficiência na suplementação de Zn, estão sujeitos à redução da qualidade seminal, por apresentarem maior frequência de anormalidades morfológicas, na cromatina, e nos padrões morfométricos da cabeça espermática com predomínio de lesões na estrutura mitocondrial e nos feixes de fibras densas na peça intermediária.PALAVRAS-CHAVES: Bovino, cromatina, morfometria espermáti

Infertilidade associada a defeito microtubular dos espermatozóides de jumento (Equus asinus) avaliados por microscopia eletrônica de transmissão

A donkey infertility was described by transmission electron microscopy (MET). The spermiogram evaluated by light microscopy showed low sperm motility and high concentration of abnormal sperm with proximal cytoplasmic droplets. The material was evaluated by MET, where it was observed disarrangement of microtubules, causing irregular protrusions in the spermatic neck. The last test done was the in vivo fertility, using four mares, with a reproductive healthy historic, where no pregnancy occurred. Facing the results that we had in vivo, associated with the MET findings, we diagnosed infertility associated with microtubular defect of the spermatozoa.

Descreve-se um caso de infertilidade de um jumento SRD confirmada por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET). O espermiograma, avaliado sob microscopia ótica, revelou baixa motilidade e alta concentração de anormalidades espermáticas do tipo gota citoplasmática proximal. O material foi avaliado por MET, observando-se um acúmulo desordenado de microtúbulos causando protusões irregulares na região do colo espermático. O último teste realizado correspondeu ao de fertilidade in vivo, utilizando-se quatro éguas portadoras de bom histórico reprodutivo, nas quais não foi possível confirmar nenhuma prenhez. Frente aos resultados obtidos, associados aos achados da MET, estabeleceu-se o diagnóstico de infertilidade associada a defeito microtubular dos espermatozóides.

Infertilidade associada a defeito microtubular dos espermatozóides de jumento (Equus asinus) avaliados por microscopia eletrônica de transmissão

A donkey infertility was described by transmission electron microscopy (MET). The spermiogram evaluated by light microscopy showed low sperm motility and high concentration of abnormal sperm with proximal cytoplasmic droplets. The material was evaluated by MET, where it was observed disarrangement of microtubules, causing irregular protrusions in the spermatic neck. The last test done was the in vivo fertility, using four mares, with a reproductive healthy historic, where no pregnancy occurred. Facing the results that we had in vivo, associated with the MET findings, we diagnosed infertility associated with microtubular defect of the spermatozoa.

Descreve-se um caso de infertilidade de um jumento SRD confirmada por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET). O espermiograma, avaliado sob microscopia ótica, revelou baixa motilidade e alta concentração de anormalidades espermáticas do tipo gota citoplasmática proximal. O material foi avaliado por MET, observando-se um acúmulo desordenado de microtúbulos causando protusões irregulares na região do colo espermático. O último teste realizado correspondeu ao de fertilidade in vivo, utilizando-se quatro éguas portadoras de bom histórico reprodutivo, nas quais não foi possível confirmar nenhuma prenhez. Frente aos resultados obtidos, associados aos achados da MET, estabeleceu-se o diagnóstico de infertilidade associada a defeito microtubular dos espermatozóides.