Purificação parcial e caracterização cinética da enzima Polifenol oxidase de banana nanica (Musa acuminata) / Partial purification and kinetics caracterization of enzyme Polyphenol oxidase of stunded banana (Musa acuminata)

Introdução - Extrato bruto de banana nanica (Musa acuminata); uma das melhores fontes vegetais da enzima Polifenol oxidase (PFO) [EC.1.14.18.1]13, foi parcialmente purificada e caracterizada pretendendo-se usar, para futuros estudos como material biocatalítico para a oxidação aeróbica dos substratos fenólicos. Material e Métodos - Foi estudada a extração da PFO dessa fonte13 e a purificação parcial desse extrato bruto usando etanol, acetona e sulfato de amônio (0-80%), que precipitam o excesso de enzimas presentes nesse extrato, com posterior diálise. A seguir, foi determinada a atividade e proteína total nesses extratos. O pH de estabilidade e de atividade, o efeito da temperatura e da estabilidade ao calor sobre a atividade da enzima; além da determinação da estabilidade (tempo de armazenamento), foram determinados. Resultados - A purificação parcial do extrato bruto apresentou melhores resultados com sulfato de amônio (40%) dialisado em membrana semi-permeável, comparado com etanol e acetona; isto pode ser devido esses dois últimos terem precipitado a enzima em questão, por apresentarem baixa constante dielétrica.O pH de estabilidade foi de 6,0 e o pH de atividade foi de 6,5; mantendo-se a faixa encontrada para o extrato bruto13. A temperatura ótima encontrada foi de 30°C e o tempo de armazenamento desse extrato foi em torno de 50 dias, apresentando menor decréscimo de atividade com o tempo, quando comparado com o extrato bruto13. Conclusão - As características cinéticas do extrato parcialmente purificado não apresentaram grandes variações comparado com o extrato bruto13; além do tempo de purificação enzimática ser longo, aumentando o tempo para análises analíticas usando essa enzima.

Introduction - Crude extract of stunded banana (Musa acuminate); best source of enzyme Polyphenol oxidase (PPO) [EC.1.14.18.1]13, it was partially purificated and characterized and will be used to futures studies as biocatalitic material to the aerobic oxidation of phenolics substrates. Material and Methods - The extraction of PPO in this source was studied13 and the partial purification in this crude extract using ethanol, acetone and sulphate of ammonia (0 - 80%), that precipitate the excess of enzymes presents in this extract and after dialysis. Ahead, the activity and total protein was determined in this extracts. The pH of estability and activity, the effect of temperature and estability to the heat upon the activity of enzyme; beyond of determination of estability (stockpile's time), they were determinated. Results - The partial purificated of crude extract introduced best results with dialysied sulphate of ammonia (40%), compared with ethanol and acetone; this can be due to these two last had precipitated the enzyme in question, by they introduce low constant dielectric. The pH of estability was 6,0 and the pH of activity was 6,5; keeping the range found to the crude extract13. The temperature found it was 30°C and stockpile's time in this extract was about 50 days, introducing minor decrease activity with the time, when compared with the crude extract13. Conclusion - Characteristics kinetics of extract partially purificated didn't introduce large variations compared with the crude extract13; beyond of time enzymatic purification to be long, increasing the time for analytics analysis using this enzyme.

Determinação de paracetamol (acetaminofenol) em produtos farmacêuticos usando um biossensor de Polifenol oxidase, obtida de extrato bruto de banana nanica (Musa acuminata) / Spectrophotometric determination of paracetamol in pharmaceutical products using a biosensor of Polyphenol oxidase, obtained of crude extract of stunded banana (Musa acuminata)

Introdução - Extrato bruto de banana nanica (Musa acuminata); melhor fonte de enzima Polifenoloxidase (PFO) [EC.1.14.18.1] foi estudado como material biocatalítico para a oxidação aeróbica de substratos fenólicos. Material e Métodos - Foi estudada a extração da PFO dessa fonte. A atividade da enzima PFO e proteína total foram determinadas nesse extrato. Um biossensor amperométrico foi construído usando 100 U de PFO proveniente do extrato bruto de banana nanica, imobilizada sobre uma membrana de teflon (Celgard 2400) com o uso do reagente bifuncional glutaraldeído 2,5% m/V. Após secagem, esta membrana enzimática foi acoplada na extremidade de um eletrodo de oxigênio. Esse biossensor foi usado na determinação de compostos fenólicos; utilizado no estudo da determinação do teor de paracetamol em formulações farmacêuticas como Tandrilax, Cefalium, Diatyl, Vick pirena e Descon. Comparando os resultados obtidos pelo método amperométrico proposto com o oficial espectrofotométrico. Resultados - Os medicamentos analisados por amperometria apresentaram valores compatíveis com o da farmacopéia, observando-se seletividade do método proposto. Conclusões - Verificou-se que a porcentagem de erro apresentou valores menores que 1% estando, portanto, de acordo com o procedimento padrão oficial. A vantagem do método amperométrico apresentado é possuir baixo custo, rapidez nas determinações e boa sensibilidade comparado com métodos cromatográficos de determinação desse fármaco.

Introduction - Partial purificated extract of stunded banana (Musa acumunata), the best source of enzyme Poliphenol oxidase (PPO) [EC.1.14.18.1] was studied as biocatalitic material to the aerobic oxidation of phenolics substrates using an amperometry biosensor with PPO immobilized. Material and Methods - The extraction of PPO was studied in the source, the partial purification of this crude extract using ammonium sulphate (40%), that precipitate the enzyme excess presents in this extract with posterior dialysis. After it was determinated the total activity and proteins in the two extracts. An amperometric biosensor was builded using 50 U of PPO proceeding of purificated partial extract of stunded banana; immobilized on a Teflon membrane (Celgard 2400), with the use of the reagent glutaraldeyde 2,5% m/v. After drying, this enzymatic membrane was copled in the extremity of an oxygen electrode. This biosensor was used in the determination of phenolics in urine samples of persons that use drugs, metabolizing phenols by amperometry and by spectrophotometry. Results - In the urine samples, was possible to notice that persons that use L- Dopa shows greather quantity of phenols than persons that use amphetamines. Conclusions -The percentage of error in the samples studied was minor that 3%, using the crude extract and purificated partialment, using the spectrophotometric standard method, showing the efficiency of the amperometric method used with or without the enzymatic purification.

Determinação espectrofotométrica e amperométrica de compostos fenólicos em urina humana, usando extrato parcialmente purificado de banana nanica (Musa acuminata) / Spectrophotometric and amperometric determination of compounds phenolics in human urine, utilizing purificated partialment extract of banana nanica (Musa acuminata)

Introdução - Extrato parcialmente purificado de banana nanica (Musa acuminata), melhor fonte de enzima Polifenol oxidase (PFO) [EC.1.14.18.1] (Bonfim et al.3, 2000), foi estudado como material biocatalítico para a oxidação aeróbica dos substratos fenólicos usando um biossensor amperométrico com PFO imobilizada. Métodos - Foi estudada a extração da PFO dessa fonte (Bonfim et al.3, 2000), a purificação parcial desse extrato bruto usando sulfato de amônio (40%), que precipita o excesso de enzimas presentes nesse extrato com posterior diálise (Perone15, 2004). A seguir foi determinada a atividade e proteína total nos dois extratos. Um biossensor amperométricofoi construído usando 50 U de PFO proveniente do extrato parcialmente purificado de banana nanica (Perone15, 2004), imobilizada sobre uma membrana de teflon (Celgard 2400) com o uso do reagente bifuncional glutaraldeído 2,5% m/V. Após secagem, essa membrana enzimática foi acoplada na extremidade de um eletrodo de oxigênio. Esse biossensor foi usado na determinação de compostos fenólicos em urina de indivíduos que consomem drogas metabolizando fenólicos, por amperometria e por espectrofotometria. Resultados - Nas amostras de urina observou-se que indivíduos que usam L-dopa apresentaram maior concentração de fenólicos que indivíduos que usam anfetaminas. Conclusões - A porcentagem de erro nas amostras estudadas foi menor que 3%, usando extrato bruto (Perone14, 2003) e parcialmente purificado, usando o método padrão espectrofotométrico (Folin-Denis), mostrando a eficiência do método amperométrico empregado, com ou sem purificação enzimática.

Introduction - Partial purificated extract of stunded banana (Musa acuminata), the best source of enzyme Poliphenol oxidase (PPO) [EC.1.14.18.1] (Bonfim et al.3, 2000), was studied as biocatalitic material to the aerobic oxidation of phenolics substrates using an amperometry biosensor with PPO immobilized. Methods - The extraction of PPO was studied in the source (Bonfim et al.3, 2000), the partial purification of this crude extract using ammonium sulphate (40%), that precipitate the enzyme excess presents in this extract with posterior dialysis. After it was determinated the total activity and proteins in the two extracts. An amperometric biosensor was builded using 50 U of PPO proceeding of purificated partial extract of stunded banana; immobilized on a Teflon membrane (Celgard 2400), with the use of the reagent glutaraldeyde 2,5% m/V. After drying, this enzymatic membrane was copled in the extremity of an oxygen electrode. This biosensor was used in the determination of phenolics in urine samples of persons that use drugs, metabolizing phenols by amperometry and by spectrophotometry. Results - In the urine samples, was possible to notice that persons that use L- Dopa shows greather quantity of phenols than persons that use amphetamines. Conclusions - The percentage of error in the samples studied was minor that 3%, using the crude extract (Perone14, 2003) and purificated partialment, using the spectrophotometric standard method (Folin-Denis), showing the efficiency of the amperometric method used with or without the enzymatic purification.

Determinação espectrofométrica e amperométrica de compostos fenólicos em urina humana, usando extrato parcialmente purificado de banana nanica (Musa acuminata) / Spectrophotometric and amperometric determination of compounds phenolics in human urine, utilizing purificated partialment extract of banana nanica (Musa acuminata)

Introdução - Extrato parcialmente purificado de banana nanica (Musa acuminata), melhor fonte de enzima Polifenol oxidase (PFO) [EC. 1.14.18.1] (Bonfim et al., 2000), foi estudado como material biocatalítico para a oxidação aeróbica dos substratos fenólicos usando um biossensor amperométrico com PFO imobilizada. Métodos - Foi estudada a extração da PFO dessa fonte (Bonfim et al., 2000), a purificação parcial desse extrato bruto usando sulfato de amônio (40%), que precipita o excesso de enzimas presentes nesse extrato com posterior diálise (Perone, 2004). A seguir foi determinada a atividade e a proteína total nos dois extratos. Um biossensor amperométrico foi construído usando 50 U de PFO proveniente do extrato parcialmente purificado de banana nanica (Perone, 2004), imobilizada sobre uma membrana de teflon (Celgard 2400) com o uso do reagente bifuncional glutaraldeído 2,5% m/V. Após secagem, essa membrana enzimática foi acoplada na extremidade de um eletrodo de oxigênio. Esse biossensor foi usado na determinação de compostos fenólicos em urina de indivíduos que consomem drogas metabolizando fenólicos, por amperometria e por espectrofotometria. Resultados - Nas amostras de urina observou-se que indivíduos que usam L-dopa apresentaram maior concentração de fenólicos que indivíduos que usam anfetaminas. Conclusões - A porcentagem de erro nas amostras estudadas foi menor que 3%, usando extrato bruto (Perone, 2003) e parcialmente purificado, usando o método padrão espectrofotométrico (Folin-Denis), mostrando a eficiência do método amperométrico empregado, com ou sem purificação enzimática.