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Scand J Immunol ; 57(5): 439-45, 2003 May.
Artigo em Inglês | MEDLINE | ID: mdl-12753500

RESUMO

Assessment of cytokine expression has become crucial to understand host responses to infections as well as autoimmunity. Several approaches including Northern blot, RNase protection assay and enzyme-linked immunosorbent assay have been used for this purpose, but they are time consuming, labour intense, and relatively large quantity of the samples is usually required. Recently, a technique termed real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) has been developed to determine genetic expression with great sensitivity and specificity; however, specialized instrumentation and costly reagents are usually needed. We aimed at using low-cost reagents for real-time PCR. This was achieved by adapting a conventional RT-PCR protocol to the quantitative real-time format, by the addition of the SYBR Green I reagent. We validated the approach by assessing the cytokine gene expression of murine splenocytes upon stimulation with phorbol 12-myristate 12-acetate (PMA)-ionomycin. The results using this technique were compared with those obtained with the well-established gene array method. We conclude that the use of the SYBR Green I reagent during real-time RT-PCR provides a highly specific and sensitive method to quantify cytokine expression with accuracy and no post-PCR manipulation.


Assuntos
Citocinas/biossíntese , Corantes Fluorescentes/análise , Perfilação da Expressão Gênica/métodos , Compostos Orgânicos , Reação em Cadeia da Polimerase/métodos , RNA Mensageiro/biossíntese , Actinas/biossíntese , Actinas/genética , Animais , Benzotiazóis , Sistemas Computacionais/economia , Análise Custo-Benefício , Custos e Análise de Custo , Citocinas/genética , Diaminas , Feminino , Perfilação da Expressão Gênica/economia , Indicadores e Reagentes/economia , Interferon gama/biossíntese , Interferon gama/genética , Interleucina-12/biossíntese , Interleucina-12/genética , Subunidade p40 da Interleucina-12 , Interleucina-2/biossíntese , Interleucina-2/genética , Ionomicina/farmacologia , Ativação Linfocitária/efeitos dos fármacos , Camundongos , Camundongos Endogâmicos BALB C , Análise de Sequência com Séries de Oligonucleotídeos , Reação em Cadeia da Polimerase/economia , Subunidades Proteicas/biossíntese , Subunidades Proteicas/genética , Quinolinas , RNA Mensageiro/análise , Sensibilidade e Especificidade , Baço/citologia , Linfócitos T/efeitos dos fármacos , Linfócitos T/metabolismo , Acetato de Tetradecanoilforbol/farmacologia , Fator de Crescimento Transformador beta/biossíntese , Fator de Crescimento Transformador beta/genética
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