Alteration of sex ratio and DNA integrity of bovine sperm centrifuged in continuous density gradients / Desvio da proporção de sexo e da integridade do DNA dos espermatozóides bovinos centrifugados em gradientes de densidade contínuos

The objective of the present study was to verify the sex ratio and presence of DNA fragmentation by TUNEL technique (In situ terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay) in bovine spermatozoa centrifuged in density gradients of Percoll or OptiPrep during the sperm separation. Approximately 40 million of frozen/thawed bovine spermatozoa were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers ranging from 1.110g/mL to 1.123g/mL in polystyrene tubes of 15mL. The tubes were kept at 4C for 24h before the deposition of sperm. Centrifugation of the tubes was performed at 500xg for 15min at 22C. Supernatants were aspirated and the sediment recovered for verification of DNA fragmentation by TUNEL technique. A deviation of in vitro produced embryos for females in Percoll gradient (62% females) was obtained in relation to OptiPrep and Control groups, (47.1 and 48.7% of females, respectively). No sperm DNA fragmentation was detect in centrifuged samples (Percoll or OptiPrep gradients). Thus, it was possible to sexing sperm, obtaining a higher percentage of X sperm than the control group, using a methodology that is simple and without damage to the sperm DNA.

O objetivo, neste trabalho, foi verificar o desvio da proporção de sexo e a presença de fragmentação do DNA, pela técnica de TUNEL (In situ terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay), em espermatozoides bovinos centrifugados em gradientes de densidade de Percoll ou OptiPrep durante a separação espermática. Doses de sêmen de touros foram descongeladas, e cerca de 40 milhões de espermatozoides foram depositados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas entre 1.110g/mL e 1.123g/mL, em tubos de 15mL, em que permaneceram por 24h a 4C antes da deposição dos espermatozoides. Os tubos foram centrifugados a 500xg por 15min a 22C. Os sobrenadantes foram aspirados, e os sedimentos, recuperados para verificação da fragmentação do DNA pela técnica de TUNEL. Obteve-se um desvio dos embriões produzidos in vitro para fêmeas no gradiente de Percoll (62% de fêmeas), em relação aos grupos OptiPrep e Controle (47,1 e 48,7% de fêmeas, respectivamente). Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozoides nas amostras centrifugadas, tanto no gradiente de Percoll quanto de OptiPrep. Dessa forma, foi possível realizar a sexagem espermática, com uma maior porcentagem de espermatozoides X do que o grupo controle, por meio de metodologia mais simples e sem provocar danos ao DNA dos espermatozoides.

Alteration of sex ratio and DNA integrity of bovine sperm centrifuged in continuous density gradients / Desvio da proporção de sexo e da integridade do DNA dos espermatozóides bovinos centrifugados em gradientes de densidade contínuos

The objective of the present study was to verify the sex ratio and presence of DNA fragmentation by TUNEL technique (In situ terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay) in bovine spermatozoa centrifuged in density gradients of Percoll or OptiPrep during the sperm separation. Approximately 40 million of frozen/thawed bovine spermatozoa were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers ranging from 1.110g/mL to 1.123g/mL in polystyrene tubes of 15mL. The tubes were kept at 4C for 24h before the deposition of sperm. Centrifugation of the tubes was performed at 500xg for 15min at 22C. Supernatants were aspirated and the sediment recovered for verification of DNA fragmentation by TUNEL technique. A deviation of in vitro produced embryos for females in Percoll gradient (62% females) was obtained in relation to OptiPrep and Control groups, (47.1 and 48.7% of females, respectively). No sperm DNA fragmentation was detect in centrifuged samples (Percoll or OptiPrep gradients). Thus, it was possible to sexing sperm, obtaining a higher percentage of X sperm than the control group, using a methodology that is simple and without damage to the sperm DNA.

O objetivo, neste trabalho, foi verificar o desvio da proporção de sexo e a presença de fragmentação do DNA, pela técnica de TUNEL (In situ terminal deoxinucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assay), em espermatozoides bovinos centrifugados em gradientes de densidade de Percoll ou OptiPrep durante a separação espermática. Doses de sêmen de touros foram descongeladas, e cerca de 40 milhões de espermatozoides foram depositados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas entre 1.110g/mL e 1.123g/mL, em tubos de 15mL, em que permaneceram por 24h a 4C antes da deposição dos espermatozoides. Os tubos foram centrifugados a 500xg por 15min a 22C. Os sobrenadantes foram aspirados, e os sedimentos, recuperados para verificação da fragmentação do DNA pela técnica de TUNEL. Obteve-se um desvio dos embriões produzidos in vitro para fêmeas no gradiente de Percoll (62% de fêmeas), em relação aos grupos OptiPrep e Controle (47,1 e 48,7% de fêmeas, respectivamente). Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozoides nas amostras centrifugadas, tanto no gradiente de Percoll quanto de OptiPrep. Dessa forma, foi possível realizar a sexagem espermática, com uma maior porcentagem de espermatozoides X do que o grupo controle, por meio de metodologia mais simples e sem provocar danos ao DNA dos espermatozoides.

Separation of x-bearing bovine sperm by centrifugation in continuous percoll and optiprep density gradient: effect in sperm viability and in vitro embryo production / Separação de espermatozoides portadores do cromossomo x bovino por centrifugação em gradiente de densidade contínuo de percoll e optiprep: efeito sobre a viabilidade espermática e na produção in vitro de embriões

The aim of this study was to separate X-bearing bovine sperm by continuous Percoll and OptiPrep density gradients and to validate the sexing of resultant in vitro produced embryos by Polimerase Chain Reaction (PCR). Frozen/thawed sperm was layered on density gradients which were previously prepared in polystyrene tubes, 24 h before procedures and maintained at 4 C. The tubes were centrifuged at 500 x g for 15 min at 22 C. Supernatants were gently aspirated and the sperm recovered from the bottom of the tubes. Viability and integrity of sperm were evaluated by Trypan Blue/Giemsa stain. Cleavage and blastocyst rates were determined by in vitro production of embryos and PCR was performed for identification of the embryos genetic sex. No damage in viability and acrossomal integrity and in cleavage and blastocyst rates was found in the Percoll and OptiPrep treatment compared to the non-centrifuged group (P>0.05). The percentage of female embryos in the Percoll and OptiPrep group was 63.0 and 47.6%, respectively. The female embryos in control group were 48.7%. A sexual deviation in the Percoll density gradient was achieved without reduction of sperm viability and in vitro production rates.KEY WORDS: Bovine, centrifugation, in vitro production of embryos, PCR, X-bearing sperm.

O objetivo deste estudo foi separar espermatozoides bovinos portadores do cromossomo X pela centrifugação em gradiente de densidade contínuo de Percoll e OptiPrep, e validar a sexagem pela reação em cadeia da polimerase (PCR), dos embriões produzidos in vitro. Para a sexagem, espermatozoides descongelados foram depositados nos gradientes de densidade, previamente preparados, em tubos de poliestireno, 24 horas antes da sexagem e mantidos a 4C. Centrifugou-se a 500 x g por quinze minutos a 22C. Os sobrenadantes foram aspirados, e os espermatozoides recuperados do fundo dos tubos. Avaliaram-se a viabilidade e a integridade dos espermatozoides pela coloração Azul de Tripan/Giemsa e determinou-se a taxa de clivagem e de blastocisto pela produção in vitro dos embriões, identificando-se o sexo genético deste embriões pela PCR. Não foram detectados danos à viabilidade e à integridade acrossomal, nem nas taxas de clivagem e de blastocistos no grupo Percoll e OptiPrep em comparação com o grupo não centrifugado (P>0,05). A porcentagem de embriões fêmeas no grupo Percoll e OptiPrep foi de 63% e 47,6%, respectivamente, e no grupo controle foi de 48,7%. Houve um desvio na proporção sexual no gradiente de Percoll, sem redução da viabilidade espermática e das taxas de produção in vitro.PALAVRAS-CHAVES: Bovino, centrifugação, espermatozoides X, produção in vitro de embriões, PCR.

SEPARATION OF X-BEARING BOVINE SPERM BY CENTRIFUGATION IN CONTINUOUS PERCOLL AND OPTIPREP DENSITY GRADIENT: EFFECT IN SPERM VIABILITY AND IN VITRO EMBRYO PRODUCTION / SEPARAÇÃO DE ESPERMATOZOIDES PORTADORES DO CROMOSSOMO X BOVINO POR CENTRIFUGAÇÃO EM GRADIENTE DE DENSIDADE CONTÍNUO DE PERCOLL E OPTIPREP: EFEITO SOBRE A VIABILIDADE ESPERMÁTICA E NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES

The aim of this study was to separate X-bearing bovine sperm by continuous Percoll and OptiPrep density gradients and to validate the sexing of resultant in vitro produced embryos by Polimerase Chain Reaction (PCR). Frozen/thawed sperm was layered on density gradients which were previously prepared in polystyrene tubes, 24 h before procedures and maintained at 4 C. The tubes were centrifuged at 500 x g for 15 min at 22 C. Supernatants were gently aspirated and the sperm recovered from the bottom of the tubes. Viability and integrity of sperm were evaluated by Trypan Blue/Giemsa stain. Cleavage and blastocyst rates were determined by in vitro production of embryos and PCR was performed for identification of the embryos genetic sex. No damage in viability and acrossomal integrity and in cleavage and blastocyst rates was found in the Percoll and OptiPrep treatment compared to the non-centrifuged group (P>0.05). The percentage of female embryos in the Percoll and OptiPrep group was 63.0 and 47.6%, respectively. The female embryos in control group were 48.7%. A sexual deviation in the Percoll density gradient was achieved without reduction of sperm viability and in vitro production rates.KEY WORDS: Bovine, centrifugation, in vitro production of embryos, PCR, X-bearing sperm.

O objetivo deste estudo foi separar espermatozoides bovinos portadores do cromossomo X pela centrifugação em gradiente de densidade contínuo de Percoll e OptiPrep, e validar a sexagem pela reação em cadeia da polimerase (PCR), dos embriões produzidos in vitro. Para a sexagem, espermatozoides descongelados foram depositados nos gradientes de densidade, previamente preparados, em tubos de poliestireno, 24 horas antes da sexagem e mantidos a 4C. Centrifugou-se a 500 x g por quinze minutos a 22C. Os sobrenadantes foram aspirados, e os espermatozoides recuperados do fundo dos tubos. Avaliaram-se a viabilidade e a integridade dos espermatozoides pela coloração Azul de Tripan/Giemsa e determinou-se a taxa de clivagem e de blastocisto pela produção in vitro dos embriões, identificando-se o sexo genético deste embriões pela PCR. Não foram detectados danos à viabilidade e à integridade acrossomal, nem nas taxas de clivagem e de blastocistos no grupo Percoll e OptiPrep em comparação com o grupo não centrifugado (P>0,05). A porcentagem de embriões fêmeas no grupo Percoll e OptiPrep foi de 63% e 47,6%, respectivamente, e no grupo controle foi de 48,7%. Houve um desvio na proporção sexual no gradiente de Percoll, sem redução da viabilidade espermática e das taxas de produção in vitro.PALAVRAS-CHAVES: Bovino, centrifugação, espermatozoides X, produção in vitro de embriões, PCR.

Sexing of in vitro fertilized bovine embryos by multiplex PCR / Sexagem de embriões bovinos fecundados in vitro pela técnica de PCR multiplex

In the present study the polymerase chain reaction (PCR) was used for sexing ninety-two in vitro fertilized bovine embryos. The embryos were obtained after in vitro fertilization of oocytes from slaughterhouses. The oocytes were matured, fertilized, and cultured until the blastocyst stage. The embryos were washed in PBS solution, and transferred to polypropylene tubes with containing ultrapure water and immediately frozen at -196ºC. The embryos were thawed on ice and treated with proteinase K. For the PCR reaction, aliquots of 34 µl from each tube were mixed to the primers BC1.2 and microsatellite sequence 1715, dNTPs, MgCl2, 10X PCR buffer, Taq DNA polymerase and water in a final volume of 50 µl. The samples were amplified and the PCR products separated by electrophoresis in a 8% polyacrylamide gel. The gels were stained in ethidium bromide solution and vizualized under UV-light. The amplification rate was 93.47%, with 41 (47.67%) male embryos and 45 (52.32%) female embryos. The use of 8% polyacrylamide gel was efficient for separating DNA fragments of very similar size.

Neste trabalho, a técnica de PCR ("polymerase chain reaction") foi utilizada para a sexagem de 92 embriões bovinos fertilizados in vitro. Os embriões originaram-se de fertilização in vitro de oócitos aspirados de ovários de fêmeas bovinas, provenientes de abatedouros comerciais. Os oócitos foram maturados, fertilizados e cultivados até o estádio de blastocisto. Os embriões foram lavados em solução de PBS, transferidos para tubos de polipropileno contendo água ultrapura, e imediatamente congelados a -196ºC. Os embriões foram descongelados sobre isopor contendo gelo picado e tratados com proteinase K. Para a reação de PCR, utilizaram-se alíquotas de 34 µl de cada tudo, onde foram acrescidos dois pares de primers, seqüência BC1.2 e seqüência satélite 1.715, desoxinucleotídeos, MgCl2, tampão PCR 10X, TaqDNA polimerase e água, em um volume final de 50 µl. As amostras foram amplificadas e a eletroforese realizada em gel de poliacrilamida a 8%. Os géis foram corados com solução de brometo de etídio e analisados em transiluminador de luz ultravioleta. Um índice de 93,47% de amplificação foi atingido, com 41 embriões (47,67%) machos e 45 (52,32%) embriões fêmeas. O uso de gel de poliacrilamida a 8% foi eficaz na separação de fragmentos de DNA muito próximos.

Transferrin and albumin polimorphism and its correlation with sexual maturity in bulls / Polimorfismo da transferrina e albumina e as associações com precocidade sexual em bovinos da raça Nelore doadores de sêmen

The association between biochemical polymorphic systems and early sexual maturity was assessed subjecting 16 animals (from 17 to 36 months old) to eletrophoretic studies, searching for transferrin and albumin polymorphisms. Two albumin alleles, AlbA (AlbF) and AlbB (AlbS), but only either as AlbB homozigotes or AlbAB heterozigotes were observed. There were no AlbA homozigotes. It was not possible to detect relationships between albumin genotypes and early sexual maturity. Regarding transferrin, it was possible to detect two alleles (TfD and TfE). When trying to establish a relationship between transferrin electrophoretic pattern and the desirable economic trait (early sexual maturity) it is suggested that the TfD allele could be associated with bulls that probably will provide freezable semen at an early age.

O presente estudo utilizou 16 animais Bos taurus indicus da raça Nelore doadores de sêmen. Estes animais foram divididos em grupos de acordo com a idade em que o sêmen congelou pela primeira vez. O grupo I, considerado precoce, apresentou animais com sêmen passível de congelação com idade inferior a 20 meses. O grupo II, composto por animais que tiveram o sêmen congelado com idade entre 21 e 26 meses. E o grupo III, tido como tardio, composto por animais com sêmen congelável com idade superior a 27 meses. Para análise dos padrões eletroforéticos da transferrina e albumina, amostras de sangue foram colhidas em tubos heparinizados e submetidos a centrifugação de 2.500 G por 15 minutos para separação do plasma sangüíneo. As amostras de plasma sangüíneo foram processadas para que a corrida eletroforética em gel de poliacrilamida pudesse ser realizada. Para a coloração do gel, usou-se Coomasie Brilliant Blue. Após análise dos padrões eletroforéticos da transferrina e albumina, observou-se que não houve relação detectável entre os fenótipos da albumina e precocidade sexual de touros doadores. Entretanto, em relação à transferrina, foi possível sugerir uma associação entre o alelo TfD com touros portadores de sêmen congelável precocemente ou medianamente em termos de idade à congelação.