Evaluation of prenucleic acid extraction for increasing sensitivity of detection of virus in bovine follicular fluid pools.

Bovine viral diarrhea virus (BVDV), bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), and bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) are major cattle pathogens that can be present in biological materials used in assisted reproduction biotechnologies. The aim of the present study was to increase the sensitivity of the polymerase chain reaction (PCR) for detection of BVDV, BoHV-1, and BoHV-5 in bovine follicular fluid (FF) collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production. Ovaries were collected immediately after slaughter at a commercial abattoir, aspirated, and the 7336 samples of FF were pooled in 84 samples. Before testing the FF field samples, sensitivity of the protocol was determined using a prenucleic acid extraction procedure that was directly compared with standard RNA or DNA extraction protocols. The prenucleic acid extraction procedure increased sensitivity of reverse transcription (RT)-PCR for BVDV and nested PCR for BoHV-1 and BoHV-5 by 100 and 10 times, respectively. The 84 FF pools were assayed for BVDV, BoHV-1, and BoHV-5 using virus isolation and RT-PCR or nested PCR. Fourteen (16.7%) FF pools were positive for BVDV RNA, and one (1.2%) was positive for BoHV-1 DNA. Two of the BVDV RT-PCR positive samples and the one BoHV-1 PCR positive sample were also positive in cell culture, demonstrating that FF contained infectious viruses. In this study, the prenucleic acid extraction procedure increased the sensitivity of RT-PCR and PCR detection. This study highlighted the importance of assuring biosecurity by detecting the presence of viral pathogens in biological materials used during in vitro embryo production.

Estudo morfológico de embriões bovinos fertilizados in vitro expostos experimentalmente à neospora caninum

ABSTRACT During the last ten years the Neospora caninum infection have emerged as an important reproductive disease in cattle, and in several countries has been the main cause of abortion. Considering the importance of the disease our aim was to perform a morphological analysis ofin vitrofertilized bovine embryos experimentally exposed to Neospora caninum. The embryos were produced from oocytes harvested from ovaries collected in slaughterhouse. They were divided in 2 groups: control, kept with HTF medium, and infected with 10µL of N. caninum. The embryos were kept in CO2 incubator during 48 and 96h. The observations were performed under inverted optical microscope. There were no morphological changes in the control group. The infected group presented cytoplasm with dark granulation, cleavage blockage and pelucide zone (ZP) rupture. In some cases, taquizoite like structures were visualized under the ZP. Those results showed that there is an interaction between the embryo and the pathogen,probably by means of an initial process of binding with the ZP, which eventually allows its entrance under the ZP. The current study becomes relevant when we take into account the possibility of Neospora caninum transmission via animal reproduction techniques.

RESUMO Durante a última década, a infecção por Neospora caninum tem emergido como uma importante doença reprodutiva em bovinos e, em vários países, tem sido diagnosticada como principal causa de aborto. Tendo em vista a importância dessa doença esse trabalho teve como objetivo avaliar morfologicamente embriões bovinos produzidos in vitro infectados experimentalmente por N. caninum. Os embriões foram produzidos in vitro a partir de oócitos colhidos de ovários de bovinos provenientes de abatedouro. Foram separados em grupo controle, mantido somente com meio HTF e grupo infectado com 10 mL de N. caninum. Os embriões foram avaliados após 48 e 96h em microscópio óptico invertido. Os embriões do grupo controle não apresentaram alterações morfológicas. No grupo infectado foi verificado o aparecimento de grânulos escuros no citoplasma, bloqueio da clivagem e ruptura da zona pelúcida (ZP). Em alguns casos, observou-se estruturas semelhantes a taquizoitos de N. caninum no interior da ZP. Esses resultados sugerem que, de alguma maneira há a interação do patógeno com o embrião, talvez em um processo inicial de ligação com a ZP, promovendo posteriormente sua entrada. Esses estudos tornam-se relevantes quando se leva em consideração a possível transmissão da N. caninum por técnicas conceptivas artificiais.

Avaliação da sensibilidade de zigotos murinos a brucella abortus para o estabelecimento de um modelo experimental em estudos de interações embriões-patógenos

ABSTRACT The aim of this study was evaluate in-vitro the susceptibility of mouse zygotes to Brucella abortus, with the purpose of establishing an accessible model for embryo-pathogen interaction studies. The female mice (Swiss Webster) were superovulated and mated with fertile males of the same strain, and then the zygote retrieval was performed. The bacterial suspension was prepared at the moment of inoculation, and the dilution was 106 brucellas/mL. The zygotes were divided into control and infected groups (30 µL of the bacterial suspension); after 24 and 96h their morphology and viability were analyzed. Morphological changes were not observed in the control group, but the infected one presented irregular blastomers, defective cleavage, granular cytoplasm with degenerative-like morphology. The cleavage rates were 77.4% (control) and 59.2% (infected) (2 de 0.001674; p 0.05) after 24h, and after 96h 14.5% (control) and 7% (infected) (2 de 0.141616; p 0.05). According to the data, mice zygotes are susceptible to B. abortus in-vitro infection. Probably they could be used as an efficient and accessible experimental model for studies of embryo-pathogen interactions.

RESUMO O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro a sensibilidade de zigotos murinos à Brucella abortus, a fim de estabelecer um modelo acessível para o estudo de interações embriões-patógenos. Para a coleta dos zigotos, foram utilizados camundongos fêmeas (Swiss Webster) acasaladas com machos inteiros, após superestimulação ovariana. Para a infecção foi utilizada a bactéria B. abortus 1119.3 e a suspensão foi preparada no momento da inoculação (diluição de 106 bactérias/mL). Os zigotos foram separados em controle e infectados (30 µL da suspensão de bactérias), e após 24 e 96h foram analisados quanto à morfologia e taxa de clivagem. No grupo controle não foram verificadas alterações morfológicas, já no infectado foi possível verificar a presença de blastômeros irregulares, falha de divisão, citoplasma com granulação e aspecto degenerativo. As taxas de clivagem após 24h foram de 77,4% (controle) e 59,2% (infectados) (2 de 0,001674; p 0,05) e após 96h de infecção 14,5% (controle) e 7% (infectados) (2 de 0,141616; p 0,05). Considerando os resultados pode-se concluir que os zigotos murinos são sensíveis à B. abortus após exposição in vitro. Provavelmente os zigotos murinos possam ser utilizados como modelo experimental, de baixo custo e fácil acesso, para estudos da interação embrião-B. abortus.

OCCURENCE OF BOVINE HERPESVIRUS 1 (BoHV-1) IN FOLICULAR FLUID AND EPITHELIAL CELLS OF BOVINE OVIDUCT / Ocorrência do herpesvirus bovino 1 (bohv-1) no líquido folicular e células epiteliais de oviduto bovino

RESUMO O objetivo desse estudo foi verificar a ocorrência do herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) no líquido folicular de ovários e células epiteliais de oviduto bovino colhidos de abatedouro. Foi realizada a reação de polimerase em cadeia (nested PCR) das amostras resultantes de 12 colheitas, utilizando primers que amplificam o gene da glicoproteína B (gB) do BoHV-1. Uma amostra de líquido folicular apresentou reação positiva enquanto as amostras de células epiteliais de oviduto bovino apresentaram reações negativas. Este resultado é de grande relevância, pois o BoHV-1 constitui um risco para a produção in vitro de embriões, tendo como conseqüência a mortalidade embrionária que é uma importante causa de falha reprodutiva e tem profundo impacto na produção animal.

ABSTRACT The objective of that study was to verify the incidence of the bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) in follicular fluid and bovine oviduct epithelial cells of slaughterhouse animals. There were 12 collections and a total of 138 ovaries, after extraction with the protein k enzyme, the samples were amplified, and internal fragment of the gene of the gB of BoHV-1 was used. A sample of follicular fluid presented a band of 175pb being shown positive to the test, while the samples of bovine oviduct epithelial cells, were all verified negatives. This discovery is of great relevance, because BoHV-1 constitutes a risk for the production of embryos in vitro. Leading to embryonic mortality, which has a deep impact in the animal production.

Avaliação da sensibilidade de zigotos murinos ao herpesvírus bovino-1: um modelo experimental para estudos de interações embrião-vírus / Evaluation of the susceptibility mice zygotes to bovine herpesvirus 1: an experimental model for embryo-virus interaction studie

RESUMO O objetivo desse trabalho foi avaliar a sensibilidade de zigotos murinos ao herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), visando a obtenção de um modelo in vitro para estudos sobre a interação embriãovírus e sobre o potencial risco de transmissão de viroses através da técnica de fertilização in vitro (FIV). Foram utilizados camundongos fêmeas (Balb C) entre 6-8 semanas de idade, superovuladas com os hormônios eCG e hCG, acasaladas com machos inteiros para colheita dos zigotos. Esses foram separados em 3 grupos, controle e exposto 24h a duas concentrações da suspensão viral (10 µL e 30 µL). Cada grupo foi dividido para análise da morfologia e para avaliação da presença de partículas virais empregando a reação em cadeia pela polimerase (PCR), após o procedimento de lavagens seqüenciais e tratamento com tripsina. De acordo com os resultados obtidos, os zigotos murinos poderão fornecer subsídios como modelo experimental para estudos sobre a biologia das interações embrião-vírus, uma vez que se apresentaram sensíveis ao BoHV-1.

ABSTRACT The aim of this work was to evaluate mouse zygote susceptibility to BoHV-1, to obtain an in vitro model, to allow studies about embryo-virus interaction and the potential risk of the transmission of the virus through IVF techniques. Female mice (Balb C) aged 6-8 weeks were superovulated with the hormones eCG and hCG and mated for zygotes retrieval. The zygotes were divided in 3 groups: control and exposed to the virus for 24h (two different concentrations -10 µL and 30 µL). Each group was divided for morphological evaluation and polymerase chain reaction (PCR) analysis was performed after sequential washing procedures with trypsin treatment. According to the results, mouse zygotes could be used as an experimental model for embryo-virus biology interaction studies.