Macrophage apoptosis using alendronate in targeted nanoarchaeosomes.

Nanoarchaeosomes are non-hydrolysable nanovesicles made of archaeolipids, naturally functionalised with ligand for scavenger receptor class 1. We hypothesized that nitrogenate bisphosphonate alendronate (ALN) loaded nanoarchaeosomes (nanoarchaeosomes(ALN)) may constitute more efficient macrophage targeted apoptotic inducers than ALN loaded nanoliposomes (nanoliposomes (ALN)). To that aim, ALN was loaded in cholesterol containing (nanoARC-chol(ALN)) or not (nanoARC(ALN)) nanoarchaeosomes. Nanoarchaeosomes(ALN) (220-320 nm sized, ~ -40 mV ξ potential, 38-50 µg ALN/mg lipid ratio) displayed higher structural stability than nanoliposomes(ALN) of matching size and ξ potential, retaining most of ALN against a 1/200 folds dilution. The cytotoxicity of nanoARC(ALN) on J774A.1 cells, resulted > 30 folds higher than free ALN and nanoliposomes(ALN) and was reduced by cholesterol in nanoARC-chol(ALN). Devoid of ALN, nanoARC-chol was non-cytotoxic, exhibited pronounced anti-inflammatory activity on J774.1 cells, strongly reducing reactive oxygen species (ROS) and IL-6 induced by LPS. Nanoarchaeosomes bilayer extensively interacted with serum proteins but resulted refractory to phospholipases. Upon J774A.1 cells uptake, nanoarchaeosomes induced cytoplasmic acid vesicles, reduced the mitochondrial membrane potential by 20-40 % without consuming ATP neither damaging lysosomes and increasing pERK. Refractory to chemoenzymatic attacks, either void or drug loaded, nanoarchaeosomes induced either anti-inflammation or macrophages apoptosis, constituting promising targeted nanovesicles for multiple therapeutic purposes.

Potential Inhibitors of the Activity of the Cholesterol-Ester Transfer Protein.

The cholesterol-ester transfer protein (CETP) exchanges lipids between high-density lipoproteins (HDLs) and low-density lipoproteins (LDLs). The excessive transport of lipids from HDLs to LDLs mediated by this protein can cause an alteration in the deposition of lipoproteins onto the arterial walls, thus promoting the development of arteriosclerosis. Different CETP inhibitors have been tested in recent years, but none has been confirmed as being effectively palliative for the disease. We employed in silico databases and molecular docking as a computational method to predict how potential CETP inhibitors could interact with the active site of the CETP protein. Upon previously comparing two computer software packages to determine which generated a greater number of accurate CETP-inhibitor-complex structures, we chose the more appropriate program for our studies. We then abstracted a series of databases of known CETP inhibitors and noninhibitors exhibiting different 50% concentrations of CETP-inhibitory (INH) activity, to generate virtual structures for docking with different combinations of the CETP receptor. From this process, we obtained as the most suitable structure 4F2A_1OB_C_PCW-it accordingly having a greater area under the receiver operating characteristic curve. The molecular docking of known compounds in comparison with the respective conformation of this inhibitor enabled us to obtain ΔGs (in kcal/mol) from which data we made a first exploration of unknown compounds for CETP-INH activity. Thus, the 4F2A_1OB_C_PCW structure was docked with DrugBank-Approved commercial compounds in an extensive database, whose status had already been established from pharmacokinetics and toxicology. In this study, we present a group of potential compounds as CETP-inhibitor candidates.

Respuestas celulares mediadas por partículas lipoproteicas discoidales conteniendo apolipoproteína A-I: Importancia en el transporte reverso de colesterol

Todas las rHDL utilizadas fueron capaces de promover la salida de colesterol de células aunque con menor capacidad que apoA-I libre. Las rHDL con POPC de 96 A y de 78 A resultaron ser tan activas como apoA-I libre para movilizar el colesterol intracelular sintetizado de novo hacia la membrana plasmática. De las rHDL con POPC y colesterol, solo las de 78 A resultaron ser activas en movilizar el colesterol intracelular sintetizado de novo. Tanto las de 96 A (que contienen 2 moléculas de apoA-I por disco) como las de 120 A (con 3 moléculas de apoA-I por disco) pierden completamente esta actividad. Si bien AI 77-120 es activo para la remoción de colesterol (informe 2005) no lo es para la de fosfolípidos sugiriendo la especificidad de esta región para la remoción de colesterol. Cuando empleamos la variante AK107 y la mutante H9-10@H3-4 tampoco hubo remoción significativa de fosfolípidos. Según estos resultados, no necesariamente los aceptores de colesterol tienen que ser previamente lipidados con fosfolípidos para que sean activos y para que funcionen como aceptores potenciales de colesterol. ApoA-I deslipidizada no activa la hidrólisis de PIP2 en fosfatidilinositol trifosfato (IP3) y diacilgliceroles (DG) cuando las células CHOKI son incubadas con la proteína a tiempos cortos de 2, 4 y 10 minutos, lo que coincide con observaciones de Nofer y col (2000) en fibroblastos. Tampoco se observaron incrementos en la concentración de calcio intracelular en células CHOKI cuando las mismas son tratadas con apoA-I. Se optimizaron las condiciones para detectar ABCA1 y SRBI en células CCD27SK y CHOKI, lo cual servió como base para ensayos preliminares de la interacción de los mismos con apoA-I y sus variantes AK107 y H9-10@H3-4. Con células CCD27SK se observaron productos de croslinking reconocidos por el anticuerpo anti-apoAI de un peso molecular cercano a 250 Kda en todos los casos testeados (con apoA-I, AK107 y H9-10@H3-4). Con células CHOKI, sin embargo, sólo detectamos este producto en el caso de apoA-I. Este tamaño corresponde al producto de croslinking de apoAI con ABCA1, aunque aún queda por confirmar que se trate de esta proteína. Para ello, planeamos en el futuro usar una immunoprecipitación con un anticuerpo anti-ABCA1 previamente a la separación electroforética e immunoblotting con anti-apoAI.

Dominios funcionales de Apolipoproteína A-I humana involucrados en la unión a membranas y remoción de colesterol de células periféricas

El primer objetivo planteado en el plan de trabajo fue determinar la importancia del dominio central de apo AI involucrado en las primeras etapas del RCT. Para ello se usaron: 1) apo AI humana aislada de plasma 2) un mutante de apo AI (H10_H4) en el que la hélice alfa helicoidal 4 (comprendiendo los residuos 88-120 de la apo AI) fue delecionada e intercambiada por la hélice 10 (residuos 220-243) con mayor índice de hidrofobicidad 3) un mutante natural de apo AI (AI 0-K107) que presenta una deleción de un residuo de lisina (Lys) en posición 107. Pacientes con dicha mutación poseen alteración del RCT y del metabolismo de HDL 4) un péptido sintético con la secuencia de apo AI comprendida entre los residuos 77 y 120, el cual se demostró previamente que posee alta afinidad por membranas artificiales ricas en colesterol. Como segundo objetivo nos propusimos estudiar la influencia del estado de lipidación , tamaño y composición del las rHDL sobre la apoAI y la capacidad de apoAI de interactuar e intercambiar lípidos con células CHO. Para ello se utilizaron dos tipos diferentes de rHDL con las cuales se evaluó la capacidad de las mismas en : Remover el CO; Movilizar pooles de CO intracelular a partir de la cuantificación de colestenona (producto de la oxidación de CO en membranas celulares). Asimismo se intentó medir la capacidad de apo AI y las variables mencionadas a unirse a la membrana celular e interactuar con ABCA1 y SR-B1.

Functional independence of a peptide with the sequence of human apolipoprotein A-I central region.

Previous results [J. Biol. Chem. 276 (2001) 16978] indicated that an apolipoprotein A-I (apoAI) central region swings away from lipid contact in discoidal high density lipoproteins (HDL), but it is able to penetrate into the bilayer of lipid vesicles. In this work, we have studied the interaction with lipid membranes of a synthetic peptide with the sequence of apoAI region between residues 77 and 120 (AI 77-120). Like apoAI, AI 77-120 binds to phospholipid vesicles and shows selectivity for cholesterol-containing membranes. Moreover, AI 77-120 promotes cholesterol desorption from membranes in a similar fashion as apoAI and can stimulate cholesterol efflux from Chinese hamster ovary cells. AI 77-120 has a considerable alpha-helical content in water solution, and its secondary structure is not largely modified after binding to membranes. Both apoA-I and AI 77-120 are oligomeric in the lipid-bound state, suggesting that dimerization of the central domain could be required for the membrane binding activity of apoA-I in HDL.

Dominios funcionales de Apolipoproteína A-I humana involucrados en la unión a membranas y remoción de colesterol de células periféricas

El primer objetivo planteado en el plan de trabajo fue determinar la importancia del dominio central de apo AI involucrado en las primeras etapas del RCT. Para ello se usaron: 1) apo AI humana aislada de plasma 2) un mutante de apo AI (H10_H4) en el que la hélice alfa helicoidal 4 (comprendiendo los residuos 88-120 de la apo AI) fue delecionada e intercambiada por la hélice 10 (residuos 220-243) con mayor índice de hidrofobicidad 3) un mutante natural de apo AI (AI 0-K107) que presenta una deleción de un residuo de lisina (Lys) en posición 107. Pacientes con dicha mutación poseen alteración del RCT y del metabolismo de HDL 4) un péptido sintético con la secuencia de apo AI comprendida entre los residuos 77 y 120, el cual se demostró previamente que posee alta afinidad por membranas artificiales ricas en colesterol. Como segundo objetivo nos propusimos estudiar la influencia del estado de lipidación , tamaño y composición del las rHDL sobre la apoAI y la capacidad de apoAI de interactuar e intercambiar lípidos con células CHO. Para ello se utilizaron dos tipos diferentes de rHDL con las cuales se evaluó la capacidad de las mismas en : Remover el CO; Movilizar pooles de CO intracelular a partir de la cuantificación de colestenona (producto de la oxidación de CO en membranas celulares). Asimismo se intentó medir la capacidad de apo AI y las variables mencionadas a unirse a la membrana celular e interactuar con ABCA1 y SR-B1.

Respuestas celulares mediadas por partículas lipoproteicas discoidales conteniendo apolipoproteína A-I: Importancia en el transporte reverso de colesterol

Todas las rHDL utilizadas fueron capaces de promover la salida de colesterol de células aunque con menor capacidad que apoA-I libre. Las rHDL con POPC de 96 A y de 78 A resultaron ser tan activas como apoA-I libre para movilizar el colesterol intracelular sintetizado de novo hacia la membrana plasmática. De las rHDL con POPC y colesterol, solo las de 78 A resultaron ser activas en movilizar el colesterol intracelular sintetizado de novo. Tanto las de 96 A (que contienen 2 moléculas de apoA-I por disco) como las de 120 A (con 3 moléculas de apoA-I por disco) pierden completamente esta actividad. Si bien AI 77-120 es activo para la remoción de colesterol (informe 2005) no lo es para la de fosfolípidos sugiriendo la especificidad de esta región para la remoción de colesterol. Cuando empleamos la variante AK107 y la mutante H9-10@H3-4 tampoco hubo remoción significativa de fosfolípidos. Según estos resultados, no necesariamente los aceptores de colesterol tienen que ser previamente lipidados con fosfolípidos para que sean activos y para que funcionen como aceptores potenciales de colesterol. ApoA-I deslipidizada no activa la hidrólisis de PIP2 en fosfatidilinositol trifosfato (IP3) y diacilgliceroles (DG) cuando las células CHOKI son incubadas con la proteína a tiempos cortos de 2, 4 y 10 minutos, lo que coincide con observaciones de Nofer y col (2000) en fibroblastos. Tampoco se observaron incrementos en la concentración de calcio intracelular en células CHOKI cuando las mismas son tratadas con apoA-I. Se optimizaron las condiciones para detectar ABCA1 y SRBI en células CCD27SK y CHOKI, lo cual servió como base para ensayos preliminares de la interacción de los mismos con apoA-I y sus variantes AK107 y H9-10@H3-4. Con células CCD27SK se observaron productos de croslinking reconocidos por el anticuerpo anti-apoAI de un peso molecular cercano a 250 Kda en todos los casos testeados (con apoA-I, AK107 y H9-10@H3-4). Con células CHOKI, sin embargo, sólo detectamos este producto en el caso de apoA-I. Este tamaño corresponde al producto de croslinking de apoAI con ABCA1, aunque aún queda por confirmar que se trate de esta proteína. Para ello, planeamos en el futuro usar una immunoprecipitación con un anticuerpo anti-ABCA1 previamente a la separación electroforética e immunoblotting con anti-apoAI.

Respuestas celulares mediadas por partículas lipoproteicas discoidales conteniendo apolipoproteína A-I: Importancia en el transporte reverso de colesterol

Todas las rHDL utilizadas fueron capaces de promover la salida de colesterol de células aunque con menor capacidad que apoA-I libre. Las rHDL con POPC de 96 A y de 78 A resultaron ser tan activas como apoA-I libre para movilizar el colesterol intracelular sintetizado de novo hacia la membrana plasmática. De las rHDL con POPC y colesterol, solo las de 78 A resultaron ser activas en movilizar el colesterol intracelular sintetizado de novo. Tanto las de 96 A (que contienen 2 moléculas de apoA-I por disco) como las de 120 A (con 3 moléculas de apoA-I por disco) pierden completamente esta actividad. Si bien AI 77-120 es activo para la remoción de colesterol (informe 2005) no lo es para la de fosfolípidos sugiriendo la especificidad de esta región para la remoción de colesterol. Cuando empleamos la variante AK107 y la mutante H9-10@H3-4 tampoco hubo remoción significativa de fosfolípidos. Según estos resultados, no necesariamente los aceptores de colesterol tienen que ser previamente lipidados con fosfolípidos para que sean activos y para que funcionen como aceptores potenciales de colesterol. ApoA-I deslipidizada no activa la hidrólisis de PIP2 en fosfatidilinositol trifosfato (IP3) y diacilgliceroles (DG) cuando las células CHOKI son incubadas con la proteína a tiempos cortos de 2, 4 y 10 minutos, lo que coincide con observaciones de Nofer y col (2000) en fibroblastos. Tampoco se observaron incrementos en la concentración de calcio intracelular en células CHOKI cuando las mismas son tratadas con apoA-I. Se optimizaron las condiciones para detectar ABCA1 y SRBI en células CCD27SK y CHOKI, lo cual servió como base para ensayos preliminares de la interacción de los mismos con apoA-I y sus variantes AK107 y H9-10@H3-4. Con células CCD27SK se observaron productos de croslinking reconocidos por el anticuerpo anti-apoAI de un peso molecular cercano a 250 Kda en todos los casos testeados (con apoA-I, AK107 y H9-10@H3-4). Con células CHOKI, sin embargo, sólo detectamos este producto en el caso de apoA-I. Este tamaño corresponde al producto de croslinking de apoAI con ABCA1, aunque aún queda por confirmar que se trate de esta proteína. Para ello, planeamos en el futuro usar una immunoprecipitación con un anticuerpo anti-ABCA1 previamente a la separación electroforética e immunoblotting con anti-apoAI.

Dominios funcionales de Apolipoproteína A-I humana involucrados en la unión a membranas y remoción de colesterol de células periféricas

El primer objetivo planteado en el plan de trabajo fue determinar la importancia del dominio central de apo AI involucrado en las primeras etapas del RCT. Para ello se usaron: 1) apo AI humana aislada de plasma 2) un mutante de apo AI (H10_H4) en el que la hélice alfa helicoidal 4 (comprendiendo los residuos 88-120 de la apo AI) fue delecionada e intercambiada por la hélice 10 (residuos 220-243) con mayor índice de hidrofobicidad 3) un mutante natural de apo AI (AI 0-K107) que presenta una deleción de un residuo de lisina (Lys) en posición 107. Pacientes con dicha mutación poseen alteración del RCT y del metabolismo de HDL 4) un péptido sintético con la secuencia de apo AI comprendida entre los residuos 77 y 120, el cual se demostró previamente que posee alta afinidad por membranas artificiales ricas en colesterol. Como segundo objetivo nos propusimos estudiar la influencia del estado de lipidación , tamaño y composición del las rHDL sobre la apoAI y la capacidad de apoAI de interactuar e intercambiar lípidos con células CHO. Para ello se utilizaron dos tipos diferentes de rHDL con las cuales se evaluó la capacidad de las mismas en : Remover el CO; Movilizar pooles de CO intracelular a partir de la cuantificación de colestenona (producto de la oxidación de CO en membranas celulares). Asimismo se intentó medir la capacidad de apo AI y las variables mencionadas a unirse a la membrana celular e interactuar con ABCA1 y SR-B1.