RESUMO
The Trypanosoma cruzi adenylyl cyclase (AC) multigene family encodes different isoforms (around 15) sharing a variable large N-terminal domain, which is extracellular and receptor-like, followed by a transmembrane helix and a conserved C-terminal catalytic domain. It was proposed that these key enzymes in the cAMP signalling pathway allow the parasite to sense its changing extracellular milieu in order to rapidly adapt to its new environment, which is generally achieved through a differentiation process. One of the critical differentiation events the parasitic protozoan T. cruzi undergoes during its life cycle, known as metacyclogenesis, occurs in the digestive tract of the insect and corresponds to the differentiation from noninfective epimastigotes to infective metacyclic trypomastigote forms. By in vitro monitoring the activity of AC during metacyclogenesis, we showed that both the activity of AC and the intracellular cAMP content follow a similar pattern of transient stimulation in a two-step process, with a first activation peak occurring during the first hours of nutritional stress and a second peak between 6 and 48 h, corresponding to the cellular adhesion. During this differentiation process, a general mechanism of upregulation of AC expression of both mRNA and protein is triggered and in particular for a major subclass of these enzymes that are present in various gene copies commonly associated to the THT gene clusters. Although the scattered genome distribution of these gene copies is rather unusual in trypanosomatids and seems to be a recent acquisition in the evolution of the T. cruzi clade, their encoded product redistributed on the flagellum of the parasite upon differentiation could be important to sense the extracellular milieu.
Assuntos
Adenilil Ciclases/metabolismo , Proteínas de Protozoários/metabolismo , Trypanosoma cruzi/enzimologia , Trypanosoma cruzi/crescimento & desenvolvimento , Adenilil Ciclases/química , Adenilil Ciclases/genética , Sequência de Aminoácidos , Animais , Doença de Chagas/parasitologia , Regulação da Expressão Gênica no Desenvolvimento , Regulação Enzimológica da Expressão Gênica , Estágios do Ciclo de Vida , Dados de Sequência Molecular , Família Multigênica , Isoformas de Proteínas/química , Isoformas de Proteínas/genética , Isoformas de Proteínas/metabolismo , Proteínas de Protozoários/química , Proteínas de Protozoários/genética , Alinhamento de Sequência , Trypanosoma cruzi/genética , Trypanosoma cruzi/metabolismo , Regulação para CimaRESUMO
Neste trabalho procuramos caracterizar uma subfamília de adenilato ciclase associada a uma unidade poligênica localizada na região flanqueadora 3 de um novo locus THT ( o terceiro cluster de genes que codificam para a isoforma de transportador de glicose TcrHT1 ). Assim, o estudo do perfil de expressão dos genes por técnica de Northern blot revelou a presença de precursores policistrônicos, aparecendo durante a diferenciação do Trypanosoma cruzi. Este RNA sofre processamento pós-transcricional dando origem aos mRNAs menores que surgem em maior intensidade nas formas tripomastigotas metacíclicas, sugerindo que existem controles a nível pós-transcricional que podem estar ligados, diretamente ou indiretamente, ao processo de metaciclogênese. Utilizando fragmentos de DNA clonados, que codificavam para porções dos domínios amino-terminal ou C-terminal ( domínio catalítico ) produzimos e purificamos as proteínas recombinantes. Estas foram utilizadas para a produção de anticorpos específicos. O antisoro anti-domínio extracelular revelou além do fragmento esperado de 140 kDa, uma grande banda inesperada de massa molecular de cerca de 200 kDa que poderia corresponder a um precursor que sofrerá processamento pós-traducional. Durante os ensaios de western-blot ( uni e bidimensional ) ficou evidenciado que as formas tripomastigotas metacíclicas possuem uma expressão deste gene cerca de três vezes maior que nas formas epimastigotas. A análise em gel de poliacrilamida em duas dimensões, quando associada a western-blot, demonstrou a presença de pelo menos oito isoformas diferentes de adenilato ciclase, com pontos isoelétricos entre 4,5 a 5,5. Através de ensaios de imunofluorescência utilizando ambos anticorpos especificos, as marcações observadas sugerem sua localização na membrana, independente do estágio do ciclo celular do parasita. Análise por Southern-blotting propõe que as adenilato ciclases de T. cruzi estão representadas no genoma do parasita em várias cópias, sete pelo menos, não organizadas em tandem. Quando comparamos nossos resultados com dados de outros autores, fica claro o polimorfismo entre as diferentes adenilato ciclases caracterizadas.