Determination of aspartate kinase activity in maize tissues

Lysine, threonine, methionine and isoleucine are synthesized from aspartate in a branched pathway in higher plants. Aspartate kinase plays a key role in the control of the aspartate pathway. The enzyme is very sensitive to manipulation and storage and the hydroxamate assay normally used to determine aspartate kinase activity has to be altered according to the plant species and tissue to be analyzed. We have optimized the assay for the determination of aspartate kinase in maize plants callus cell cultures. Among all the assay parameters tested, the concentration of ATP/Mg and temperature were critical for enzyme activity. In the case of temperature, 35°C was shown to be the optimum temperature for aspartate kinase activity.

Lisina, treonina, metionina e isoleucina são derivados do aspartato. Aspartato quinase tem um papel chave no controle da via metabólica do aspartato. A enzima é muito sensível à manipulação e armazenagem e o ensaio enzimático do hidroxamato que é normalmente utilizado para determinar a atividade da aspartato quinase deve ser alterado de acordo com a espécie de planta e tecido vegetal a ser analisado. Nós otimizamos o ensaio para a determinação da atividade da aspartato quinase em culturas celulares de calos de milho. Entre os vários parâmetros testados do ensaio, a concentração de ATP/Mg e temperatura foram críticos para atividade enzimática. No caso da temperatura, 35°C foi a temperatura ótima para atividade da aspartato quinase.

Determination of aspartate kinase activity in maize tissues

Lysine, threonine, methionine and isoleucine are synthesized from aspartate in a branched pathway in higher plants. Aspartate kinase plays a key role in the control of the aspartate pathway. The enzyme is very sensitive to manipulation and storage and the hydroxamate assay normally used to determine aspartate kinase activity has to be altered according to the plant species and tissue to be analyzed. We have optimized the assay for the determination of aspartate kinase in maize plants callus cell cultures. Among all the assay parameters tested, the concentration of ATP/Mg and temperature were critical for enzyme activity. In the case of temperature, 35°C was shown to be the optimum temperature for aspartate kinase activity.

Lisina, treonina, metionina e isoleucina são derivados do aspartato. Aspartato quinase tem um papel chave no controle da via metabólica do aspartato. A enzima é muito sensível à manipulação e armazenagem e o ensaio enzimático do hidroxamato que é normalmente utilizado para determinar a atividade da aspartato quinase deve ser alterado de acordo com a espécie de planta e tecido vegetal a ser analisado. Nós otimizamos o ensaio para a determinação da atividade da aspartato quinase em culturas celulares de calos de milho. Entre os vários parâmetros testados do ensaio, a concentração de ATP/Mg e temperatura foram críticos para atividade enzimática. No caso da temperatura, 35°C foi a temperatura ótima para atividade da aspartato quinase.

Distribution of soluble amino acids in maize endosperm mutants

For human nutrition the main source of vegetable proteins are cereal and legume seeds. The content of total soluble amino acids in mature endosperm of wild-type, opaque and floury maize (Zea mays L.) mutants were determined by HPLC. The total absolute concentration of soluble amino acids among the mutants varied depending on the mutant. The o11 and o13 mutants exhibited the highest average content, whereas o10, fl3 and fl1 exhibited the lowest average content. In general, the mutants exhibited similar concentrations of total soluble amino acids when compared to the wild-type lines, with the clear exception of mutants o11 and fl1, with the o11 mutant exhibiting a higher concentration of total soluble amino acids when compared to its wild-type counterpart W22 and the fl1 mutant a lower concentration when compared to its wild-type counterpart Oh43. For methionine, the mutants o2 and o11 and wild-type Oh43 exhibited the highest concentrations of this amino acid. Significant differences were not observed between mutants for other amino acids such as lysine and threonine. The high lysine concentrations obtained originally for these mutants may be due to the amino acids incorporated into storage proteins, but not those present in the soluble form.

A principal fonte de proteínas vegetais para alimentação humana e animal é fornecida pelos grãos de cereais e leguminosas. O conteúdo de aminoácidos solúveis totais foi determinado por HPLC em endospermas de milho (Zea mays L.) normal e mutantes opaco e floury. A concentração de aminoácidos solúveis totais variou entre os mutantes. Os mutantes o11 e o13 se destacaram com médias superiores, enquanto que mutantes o10, fl3 e fl1 apresentaram as menores médias. De maneira geral, para a concentração total de aminoácidos solúveis, os grãos dos mutantes foram similares aos seus tipos selvagens com exceção dos mutantes o11 e fl1 sendo que o primeiro apresentou valor maior que seu tipo selvagem W22, enquanto que o fl1 teve valor menor que o Oh43. Para metionina, os mutantes o2 e o11 e o tipo selvagem Oh43 apresentaram as mais altas concentrações deste aminoácido. Valores similares foram observados entre os mutantes e os tipos selvagens para concentração de outros aminoácidos analisados, tais como lisina e treonina. As altas concentrações sugeridas originalmente para estes mutantes devem ser devidas aos níveis destes aminoácidos incorporados nas proteínas de reserva, mas não na forma solúvel.

Distribution of soluble amino acids in maize endosperm mutants

For human nutrition the main source of vegetable proteins are cereal and legume seeds. The content of total soluble amino acids in mature endosperm of wild-type, opaque and floury maize (Zea mays L.) mutants were determined by HPLC. The total absolute concentration of soluble amino acids among the mutants varied depending on the mutant. The o11 and o13 mutants exhibited the highest average content, whereas o10, fl3 and fl1 exhibited the lowest average content. In general, the mutants exhibited similar concentrations of total soluble amino acids when compared to the wild-type lines, with the clear exception of mutants o11 and fl1, with the o11 mutant exhibiting a higher concentration of total soluble amino acids when compared to its wild-type counterpart W22 and the fl1 mutant a lower concentration when compared to its wild-type counterpart Oh43. For methionine, the mutants o2 and o11 and wild-type Oh43 exhibited the highest concentrations of this amino acid. Significant differences were not observed between mutants for other amino acids such as lysine and threonine. The high lysine concentrations obtained originally for these mutants may be due to the amino acids incorporated into storage proteins, but not those present in the soluble form.

A principal fonte de proteínas vegetais para alimentação humana e animal é fornecida pelos grãos de cereais e leguminosas. O conteúdo de aminoácidos solúveis totais foi determinado por HPLC em endospermas de milho (Zea mays L.) normal e mutantes opaco e floury. A concentração de aminoácidos solúveis totais variou entre os mutantes. Os mutantes o11 e o13 se destacaram com médias superiores, enquanto que mutantes o10, fl3 e fl1 apresentaram as menores médias. De maneira geral, para a concentração total de aminoácidos solúveis, os grãos dos mutantes foram similares aos seus tipos selvagens com exceção dos mutantes o11 e fl1 sendo que o primeiro apresentou valor maior que seu tipo selvagem W22, enquanto que o fl1 teve valor menor que o Oh43. Para metionina, os mutantes o2 e o11 e o tipo selvagem Oh43 apresentaram as mais altas concentrações deste aminoácido. Valores similares foram observados entre os mutantes e os tipos selvagens para concentração de outros aminoácidos analisados, tais como lisina e treonina. As altas concentrações sugeridas originalmente para estes mutantes devem ser devidas aos níveis destes aminoácidos incorporados nas proteínas de reserva, mas não na forma solúvel.

Manipulação de cereais para acúmulo de lisina em sementes

The nutrition value of a protein is directly related to its amino acid composition. Some of these amino acids, termed essential amino acids, cannot be synthesized by humans and therefore must be supplied in the diet for adults and in particular for infants and children. Lysine is an essential amino acid synthesized via the aspartic acid metabolic pathway, in which threonine, methionine and isoleucine are also endproducts. Moreover, lysine is the first limiting amino acid in all cereal grains. For over 30 years, the aspartic acid metabolic pathway has been studied in higher plants with the aim of identifying and characterizing the key regulatory points controlling the biosynthetic pathway. Two clear distinct time periods, one begining with the development of tissue culture techniques (1970-80's) and the second with the development of plant transformation techniques (90's), has encouraged the production of biochemical mutants and transgenic plants with specific alterations in key enzymes of the pathway, leading to the overproduction and accumulation of threonine in all plant tissues. However, the accumulation of lysine in seeds has been particularly difficult to achieve. Such an observation, associated with the recent biochemical studies on lysine degradation in cereal and legume plant species, has indicated that the manipulation of lysine degradation is as important as the manipulation of lysine synthesis, if the goal of accumulating this amino acid in cereal seeds is to be achieved. In maize, the study and use of other mutants such as the opaque-2 and QPM (Quality Protein Maize) varieties, has contributed significantly to our understanding of the regulatory aspects of the aspartate pathway. The strategies of obtaining cereals rich in lysine and their relevance to the manipulation of other amino acids have been discussed.

A lisina é um aminoácido essencial cuja via de biossíntese faz parte da via metabólica do ácido aspártico, pela qual são também sintetizados os aminoácidos treonina, metionina e isoleucina. Além disso, a lisina é o principal aminoácido limitante em todos os cereais e por cerca de 30 anos a via do ácido aspártico tem sido estudada em plantas, com o intuito de desvendar e caracterizar os principais pontos chave na regulação das vias de biossíntese desses aminoácidos. Duas etapas distintas, uma primeira originada a partir do desenvolvimento da cultura de tecidos (anos 70-80) e a segunda a partir do desenvolvimento de técnicas para a transformação de plantas (anos 90), permitiram que mutantes bioquímicos e plantas trangênicas fossem produzidos com alterações específicas em passos metabólicos chave, levando à superprodução e acúmulo de treonina em vários tecidos das plantas. Entretanto, a acumulação de lisina em sementes não foi obtida. Tal fato, associado a estudos bioquímicos da via de degradação da lisina em cereais e em leguminosas, indicou que a manipulação da degradação seria tão ou mais importante que a manipulação da biossíntese de lisina para o acúmulo deste aminoácido em sementes dos cereais . Em milho, o uso e estudo de outros mutantes tais como o opaco-2 e variedades QPM (Quality Protein Maize) contribuíram significativamente para a compreensão dos eventos regulatórios. As estratégias para a obtenção de materiais ricos em lisina e sua relevância à manipulação de outros aminoácidos são revisados.

Manipulação de cereais para acúmulo de lisina em sementes

The nutrition value of a protein is directly related to its amino acid composition. Some of these amino acids, termed essential amino acids, cannot be synthesized by humans and therefore must be supplied in the diet for adults and in particular for infants and children. Lysine is an essential amino acid synthesized via the aspartic acid metabolic pathway, in which threonine, methionine and isoleucine are also endproducts. Moreover, lysine is the first limiting amino acid in all cereal grains. For over 30 years, the aspartic acid metabolic pathway has been studied in higher plants with the aim of identifying and characterizing the key regulatory points controlling the biosynthetic pathway. Two clear distinct time periods, one begining with the development of tissue culture techniques (1970-80's) and the second with the development of plant transformation techniques (90's), has encouraged the production of biochemical mutants and transgenic plants with specific alterations in key enzymes of the pathway, leading to the overproduction and accumulation of threonine in all plant tissues. However, the accumulation of lysine in seeds has been particularly difficult to achieve. Such an observation, associated with the recent biochemical studies on lysine degradation in cereal and legume plant species, has indicated that the manipulation of lysine degradation is as important as the manipulation of lysine synthesis, if the goal of accumulating this amino acid in cereal seeds is to be achieved. In maize, the study and use of other mutants such as the opaque-2 and QPM (Quality Protein Maize) varieties, has contributed significantly to our understanding of the regulatory aspects of the aspartate pathway. The strategies of obtaining cereals rich in lysine and their relevance to the manipulation of other amino acids have been discussed.

A lisina é um aminoácido essencial cuja via de biossíntese faz parte da via metabólica do ácido aspártico, pela qual são também sintetizados os aminoácidos treonina, metionina e isoleucina. Além disso, a lisina é o principal aminoácido limitante em todos os cereais e por cerca de 30 anos a via do ácido aspártico tem sido estudada em plantas, com o intuito de desvendar e caracterizar os principais pontos chave na regulação das vias de biossíntese desses aminoácidos. Duas etapas distintas, uma primeira originada a partir do desenvolvimento da cultura de tecidos (anos 70-80) e a segunda a partir do desenvolvimento de técnicas para a transformação de plantas (anos 90), permitiram que mutantes bioquímicos e plantas trangênicas fossem produzidos com alterações específicas em passos metabólicos chave, levando à superprodução e acúmulo de treonina em vários tecidos das plantas. Entretanto, a acumulação de lisina em sementes não foi obtida. Tal fato, associado a estudos bioquímicos da via de degradação da lisina em cereais e em leguminosas, indicou que a manipulação da degradação seria tão ou mais importante que a manipulação da biossíntese de lisina para o acúmulo deste aminoácido em sementes dos cereais . Em milho, o uso e estudo de outros mutantes tais como o opaco-2 e variedades QPM (Quality Protein Maize) contribuíram significativamente para a compreensão dos eventos regulatórios. As estratégias para a obtenção de materiais ricos em lisina e sua relevância à manipulação de outros aminoácidos são revisados.