Prevalence of equine infectious anemia in stud farms in Minas Gerais, Brazil / Prevalência da anemia infecciosa equina em haras de Minas Gerais, Brasil

Horse breeding is expanding in Brazil. Nevertheless, equine infectious anemia (EIA) a transmissible, incurable disease is an obstacle to the development of the horse industry. Therefore, to determine the incidence of EIA at stud farms in the state of Minas Gerais, Brazil, a serological survey was conducted to estimate the prevalence and identify potential risk factors for equine infectious anemia virus (EIAV) transmission. This was the second stage of an ongoing study on the epidemiology of the disease, which was first observed in draft horses. A sample of 7,742 equids from 717 stud farms in seven regions within the State was tested between May 2004 and January 2006. Laboratory tests including enzyme-linked immunosorbent assays and agar gel immunodiffusion were conducted for screening and confirmation, respectively. The prevalence of EIA was estimated to be 0.44% (95% confidence interval [CI]=0.00-0.871) at the farm level and 0.07% (95% CI=0.00-0.251) at the animal level. The low prevalence of EIA in stud farms might be explained by the higher zootechnical value of stable-bred animals, which leads to periodical serological control and compliance with the slaughter of test-positive animals in order to keep the farm EIA-free. Moreover, stable-bred horses usually travel more and are subjected to more official controls than are draft horses. The highest prevalence of EIA was observ

A criação de cavalos está em expansão no Brasil. No entanto, a anemia infecciosa equina (EIA), uma doença transmissível, incurável é um obstáculo ao desenvolvimento da indústria equidea. Dessa forma, para determinar a incidência de AIE em haras de Minas Gerais, foi realizado um levantamento sorológico para estimar a prevalência e identificar potenciais fatores de risco para a transmissão do vírus da anemia infecciosa equina (EIAV). Esta foi a segunda etapa de um estudo em curso sobre a epidemiologia da doença, que foi realizado pela primeira vez em animais de serviço. Uma amostra de 7.742 equídeos de 717 fazendas em sete regiões do Estado foi testada entre maio de 2004 e janeiro de 2006. Testes de laboratório incluindo ensaios imunoenzimáticos e a imunodifusão em gel de ágar foram conduzidos para triagem e confirmação, respectivamente. A prevalência de AIE foi estimada em 0,44% (intervalo de confiança de 95% [IC] = 0,00-0,871) ao nível de propriedade e 0,07% (IC 95% = 0,00-0,251) ao nível animal. A baixa prevalência de AIE em haras pode ser explicada pelo maior valor zootécnico de animais de raça estabulados, o que leva ao controle sorológico periódico e ao cumprimento do abate de animais positivos ao teste, a fim de manter a fazenda livre da AIE. Além disso, os cavalos de haras geralmente viajam mais e são submetidos aos controles oficiais com maior frequência do que os animai

Prevalence of equine infectious anemia in stud farms in Minas Gerais, Brazil / Prevalência da anemia infecciosa equina em haras de Minas Gerais, Brasil

Horse breeding is expanding in Brazil. Nevertheless, equine infectious anemia (EIA) a transmissible, incurable disease is an obstacle to the development of the horse industry. Therefore, to determine the incidence of EIA at stud farms in the state of Minas Gerais, Brazil, a serological survey was conducted to estimate the prevalence and identify potential risk factors for equine infectious anemia virus (EIAV) transmission. This was the second stage of an ongoing study on the epidemiology of the disease, which was first observed in draft horses. A sample of 7,742 equids from 717 stud farms in seven regions within the State was tested between May 2004 and January 2006. Laboratory tests including enzyme-linked immunosorbent assays and agar gel immunodiffusion were conducted for screening and confirmation, respectively. The prevalence of EIA was estimated to be 0.44% (95% confidence interval [CI]=0.00-0.871) at the farm level and 0.07% (95% CI=0.00-0.251) at the animal level. The low prevalence of EIA in stud farms might be explained by the higher zootechnical value of stable-bred animals, which leads to periodical serological control and compliance with the slaughter of test-positive animals in order to keep the farm EIA-free. Moreover, stable-bred horses usually travel more and are subjected to more official controls than are draft horses. The highest prevalence of EIA was observ

A criação de cavalos está em expansão no Brasil. No entanto, a anemia infecciosa equina (EIA), uma doença transmissível, incurável é um obstáculo ao desenvolvimento da indústria equidea. Dessa forma, para determinar a incidência de AIE em haras de Minas Gerais, foi realizado um levantamento sorológico para estimar a prevalência e identificar potenciais fatores de risco para a transmissão do vírus da anemia infecciosa equina (EIAV). Esta foi a segunda etapa de um estudo em curso sobre a epidemiologia da doença, que foi realizado pela primeira vez em animais de serviço. Uma amostra de 7.742 equídeos de 717 fazendas em sete regiões do Estado foi testada entre maio de 2004 e janeiro de 2006. Testes de laboratório incluindo ensaios imunoenzimáticos e a imunodifusão em gel de ágar foram conduzidos para triagem e confirmação, respectivamente. A prevalência de AIE foi estimada em 0,44% (intervalo de confiança de 95% [IC] = 0,00-0,871) ao nível de propriedade e 0,07% (IC 95% = 0,00-0,251) ao nível animal. A baixa prevalência de AIE em haras pode ser explicada pelo maior valor zootécnico de animais de raça estabulados, o que leva ao controle sorológico periódico e ao cumprimento do abate de animais positivos ao teste, a fim de manter a fazenda livre da AIE. Além disso, os cavalos de haras geralmente viajam mais e são submetidos aos controles oficiais com maior frequência do que os animai

Comparative study of Mycobacterium bovis primary isolation methods.

For the definitive diagnosis of bovine tuberculosis, isolation of the etiologic agent is required. However, there is no consensus on the best methodology for isolation of Mycobacterium bovis in Brazil. This study evaluated the most used decontaminants and culture media in the country, in order to identify the best combination for the Brazilian samples. Three decontaminants - 2% sodium hydroxide (w/v), 0.75% hexadecylpiridinium chloride (w/v) and 5% sulphuric acid (v/v) and four culture media - 7H11 Middlebrook with additives and OADC supplement "A" (7H11 A), the same media with another supplement trademark (7H11 B), tuberculosis blood agar (B83) and Stonebrink's medium were compared. Regarding the isolation, there were no significant differences between the decontaminants and media combinations, except 7H11A combined to any decontaminant. However, the mean colonies score was significantly greater when the samples were decontaminated with 5% sulphuric acid and inoculated in 7H11 B or SB, without significant difference between them, although colonies appeared earlier on 7H11B than on SB. The trademark of OADC supplement influenced the isolation rate and the number of isolated colonies in Middlebrook 7H11. An incubation time of four weeks was required to detect all positive samples in 7H11 B after decontamination with 5% sulphuric acid but there was an increase in the number of colonies until the sixth week of incubation. Overall, the best strategy for the primary isolation of M. bovis from Brazilian samples was the decontamination with 5% sulphuric acid (final concentration) and inoculation in Middlebrook 7H11 medium formulated with OADC supplement "B".

Detection of agents associated with respiratory diseases of swine by real time PCR

Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) is a group of diseases that cause high losses in the swine industry. Several infectious agents are related to PRDC including porcine circovirus 2 (PCV-2), pseudorabies virus (SuHV-1),Haemophilus parasuis (HP), Mycoplasma hypneumoniae (MH) and Pasteurela multocida (PM). The aim of this study was to develop real-time PCRs (qPCR) for the detection of these infectious agents. Oligonucleotides were designed for each specific infectious agent and labeled with different fluorophores to amplify specific parts of the genome. This was done in two groups of reactionsa duplex qPCR for SuHV-1 and PCV-2 and a multiplex qPCR to detect the three bacteria simultaneously. The reactions were tested in 142 pooled samples of swine lymph nodes and lungs with clinical signs of PRDC. There were 135 samples that tested positive for PCV-2, 61 for HP, 29 for PM, 30 for MH and zero for SuHV-1. We recorded 76 cases of co-infection. The qPCRs developed in this study are useful tools in the diagnosis of PRDC.

Complexo de Doenças Respiratórias de Suínos (CDRS ) é um grupo de doenças que causam grandes perdas na indústria suína. Vários agentes infecciosos estão relacionados com a CDRS , entre eles o circovírus suíno 2 (PCV -2), vírus da pseudo-raiva (SuHV -1) , Haemophilus parasuis (HP) ,Mycoplasma hypneumoniae (MH ) e Pasteurela multocida (PM). O objetivo com este estudo foi desenvolver PCR em tempo real (qPCR) para a detecção destes agentes infecciosos. Os oligonucleotídeos foram concebidos para cada agente infeccioso específico e marcado com fluoróforos diferentes para amplificar partes específicas do genoma em dois grupos de reacções , uma qPCR dúplex em SuHV -1 e PCV- 2 e uma qPCR multiplex para detectar as três bactérias simultaneamente. As reações foram testadas em 142 amostras de pools de linfonodos e pulmões de suínos com sinais clínicos de CDRS. Foram detectadas 135 amostras positivas para PCV- 2 , 61 para a HP, 29 para PM e 30 para MH e zero para SuHV -1, dentre esses foram registrados 76 casos de co-infecção . As qPCRs desenvolvidas neste estudo são ferramentas úteis no diagnóstico da CDRS.

Detection of agents associated with respiratory diseases of swine by real time PCR

Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) is a group of diseases that cause high losses in the swine industry. Several infectious agents are related to PRDC including porcine circovirus 2 (PCV-2), pseudorabies virus (SuHV-1),Haemophilus parasuis (HP), Mycoplasma hypneumoniae (MH) and Pasteurela multocida (PM). The aim of this study was to develop real-time PCRs (qPCR) for the detection of these infectious agents. Oligonucleotides were designed for each specific infectious agent and labeled with different fluorophores to amplify specific parts of the genome. This was done in two groups of reactionsa duplex qPCR for SuHV-1 and PCV-2 and a multiplex qPCR to detect the three bacteria simultaneously. The reactions were tested in 142 pooled samples of swine lymph nodes and lungs with clinical signs of PRDC. There were 135 samples that tested positive for PCV-2, 61 for HP, 29 for PM, 30 for MH and zero for SuHV-1. We recorded 76 cases of co-infection. The qPCRs developed in this study are useful tools in the diagnosis of PRDC.

Complexo de Doenças Respiratórias de Suínos (CDRS ) é um grupo de doenças que causam grandes perdas na indústria suína. Vários agentes infecciosos estão relacionados com a CDRS , entre eles o circovírus suíno 2 (PCV -2), vírus da pseudo-raiva (SuHV -1) , Haemophilus parasuis (HP) ,Mycoplasma hypneumoniae (MH ) e Pasteurela multocida (PM). O objetivo com este estudo foi desenvolver PCR em tempo real (qPCR) para a detecção destes agentes infecciosos. Os oligonucleotídeos foram concebidos para cada agente infeccioso específico e marcado com fluoróforos diferentes para amplificar partes específicas do genoma em dois grupos de reacções , uma qPCR dúplex em SuHV -1 e PCV- 2 e uma qPCR multiplex para detectar as três bactérias simultaneamente. As reações foram testadas em 142 amostras de pools de linfonodos e pulmões de suínos com sinais clínicos de CDRS. Foram detectadas 135 amostras positivas para PCV- 2 , 61 para a HP, 29 para PM e 30 para MH e zero para SuHV -1, dentre esses foram registrados 76 casos de co-infecção . As qPCRs desenvolvidas neste estudo são ferramentas úteis no diagnóstico da CDRS.

Estudo comparativo de protocolos de imunodifusão em gel de agar para o diagnóstico da anemia infecciosa equina no Brasil / Comparative study of agar gel immunodiffusion (AGID) protocols for the diagnosis of equine infectious anemia in Brazil

Para avaliar diferentes protocolos da imunodifusão em gel de ágar (IDGA) para diagnóstico da anemia infecciosa equina (AIE), foram utilizados dois kits comerciais de IDGA: kit A importado e kit B fabricado no Brasil. O kit A foi submetido aos protocolos recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). O kit B, nacional, foi submetido somente ao protocolo recomendado pelo MAPA e foi utilizado como referência nesse estudo. Foi utilizado um total de 345 amostras de soro que incluiu amostras de campo, amostras de laboratórios oficiais e controle fraco positivo proveniente do National Veterinary Services Laboratories (NVSL, EUA). Foram avaliados parâmetros tais como a sensibilidade do kit A nos dois protocolos, o limite de detecção dos kits e a ocorrência de reações não específicas ou não-identidade. O teste IDGA com o kit A, quando realizado de acordo com o protocolo recomendado pelo OIE, demonstrou boa concordância com o kit B e 99% de sensibilidade relativa. No entanto, quando o kit A foi executado com o protocolo recomendado pelo MAPA, houve falha na detecção de 1,16% de amostras fracas positivas, e sua sensibilidade relativa diminuiu para 96%. O limite de detecção do kit A foi menor do que o limite de detecção do kit B para amostras fracas positivas em ambos os protocolos. A ocorrência de reações inespecífi

To evaluate the Equine Infectious Anemia (EIA) agar gel immunodiffusion (AGID) protocols, two different kits commercially available in Brazil were used: an imported kit (kit A) and a domestically produced kit (kit B). Kit A was submitted to the protocols recommended by the World Organization for Animal Health (OIE) and the protocol recommended by the Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Kit B, the Brazilian kit, was submitted only to the MAPA-recommended protocol and was used as a reference in this study. A total of 345 equid serum samples, including field samples, serum sets from official laboratories and a weak positive serum control from National Veterinary Services Laboratories (NVSL), were used. Parameters such as the sensitivity of kit A in the two protocols, the detection limit of kits and the occurrence of nonspecific reactions or non-identity were evaluated. When Kit A was used for an AGID procedure performed according to the OIE-recommended protocol, the kit demonstrated good agreement with kit B and 99 % relative sensitivity. However, when kit A was processed according to the MAPA-recommended protocol, it failed to detect 1.16 % of weak positive samples and its relative sensitivity decreased to 96 %. The detection limit of kit A was lower than the detection limit of kit B for weak positive samples in both protocols. The occurrence of nonidentity

Estudo comparativo de protocolos de imunodifusão em gel de agar para o diagnóstico da anemia infecciosa equina no Brasil / Comparative study of agar gel immunodiffusion (AGID) protocols for the diagnosis of equine infectious anemia in Brazil

Para avaliar diferentes protocolos da imunodifusão em gel de ágar (IDGA) para diagnóstico da anemia infecciosa equina (AIE), foram utilizados dois kits comerciais de IDGA: kit A importado e kit B fabricado no Brasil. O kit A foi submetido aos protocolos recomendados pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) e Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). O kit B, nacional, foi submetido somente ao protocolo recomendado pelo MAPA e foi utilizado como referência nesse estudo. Foi utilizado um total de 345 amostras de soro que incluiu amostras de campo, amostras de laboratórios oficiais e controle fraco positivo proveniente do National Veterinary Services Laboratories (NVSL, EUA). Foram avaliados parâmetros tais como a sensibilidade do kit A nos dois protocolos, o limite de detecção dos kits e a ocorrência de reações não específicas ou não-identidade. O teste IDGA com o kit A, quando realizado de acordo com o protocolo recomendado pelo OIE, demonstrou boa concordância com o kit B e 99% de sensibilidade relativa. No entanto, quando o kit A foi executado com o protocolo recomendado pelo MAPA, houve falha na detecção de 1,16% de amostras fracas positivas, e sua sensibilidade relativa diminuiu para 96%. O limite de detecção do kit A foi menor do que o limite de detecção do kit B para amostras fracas positivas em ambos os protocolos. A ocorrência de reações inespecífi

To evaluate the Equine Infectious Anemia (EIA) agar gel immunodiffusion (AGID) protocols, two different kits commercially available in Brazil were used: an imported kit (kit A) and a domestically produced kit (kit B). Kit A was submitted to the protocols recommended by the World Organization for Animal Health (OIE) and the protocol recommended by the Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Kit B, the Brazilian kit, was submitted only to the MAPA-recommended protocol and was used as a reference in this study. A total of 345 equid serum samples, including field samples, serum sets from official laboratories and a weak positive serum control from National Veterinary Services Laboratories (NVSL), were used. Parameters such as the sensitivity of kit A in the two protocols, the detection limit of kits and the occurrence of nonspecific reactions or non-identity were evaluated. When Kit A was used for an AGID procedure performed according to the OIE-recommended protocol, the kit demonstrated good agreement with kit B and 99 % relative sensitivity. However, when kit A was processed according to the MAPA-recommended protocol, it failed to detect 1.16 % of weak positive samples and its relative sensitivity decreased to 96 %. The detection limit of kit A was lower than the detection limit of kit B for weak positive samples in both protocols. The occurrence of nonidentity

Diagnóstico e genotipagem do vírus da pseudoraiva por nested-PCR e análise de restrição enzimática

Pseudorabies is a disease caused by Suid herpesvirus 1 (PrV) and is responsible for considerable economic losses in the swine industry. The PrV has only one serotype, but based on RFLP (restriction fragment length polymorphism) the virus was divided into four genotypes named I, II, III, IV. The classical methods for PrV genotyping usually require virus isolation, DNA purification enzyme restriction analysis and a long electrophoresis. The aim of this research was to describe a faster and more sensitive method to detect and genotype PrV based on nested-PCR and restriction enzyme analysis. Twenty PrV isolates from south and southeast regions of Brazil, and the standard strain Shope were grown in PK-15 cells and submitted to PCR for glycoprotein E gene amplification. Additionally were tested 75 clinical samples (swine brain), with 25 positives for virus isolation and seroneutralization, and 50 negatives from a flock free PR with negative results in seroneutralization test. There was 100% of agreement between results of nested-PCR and virus isolation and seroneutralization and all samples detected were classified as genotype II. The nested-PCR, combined with restriction enzyme analysis, was able to detect and genotype PrV in 1-2 days with a sensitivity of 10-1,3 TCID50 mL-1. It was faster than classical methods described in the literature that require at least 7 days to be completed.

A pseudoraiva (PR) é uma enfermidade viral responsável por consideráveis perdas econômicas na indústria de suínos. O vírus da pseudoraiva (PrV) apresenta apenas um sorotipo, mas, por análise de restrição enzimática, foi classificado em quatro genótipos denominados I, II, III e IV. Os métodos usados para genotipagem dependem do isolamento do vírus, da purificação do DNA viral, da restrição enzimática do genoma completo e da visualização após eletroforese. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um método mais rápido e sensível para detectar e genotipar o PrV por nested-PCR e análise de restrição enzimática. Vinte isolados do PrV das regiões Sul e Sudeste do Brasil e a estirpe padrão Shope foram replicadas em células PK-15 e submetidas à nested-PCR para o gene da glicoproteína E. Além desses vírus previamente isolados, foram avaliadas 75 amostras clínicas de cérebro de suíno em um total de 25 animais positivos para a PR no isolamento e na soroneutralização viral e 50 amostras negativas provenientes de animais negativos na soroneutralização viral e de granjas sem histórico de PR. Todas as amostras clínicas tiveram resultados compatíveis com o isolamento e a soroneutralização, e a totalidade das amostras positivas foi classificada como genótipo II. A sensibilidade analítica da nested-PCR foi de 10-1,3 TCID50 mL-1. A combinação da nested-PCR e da restrição enzimática foi capaz de detectar e genotipar o vírus com resultados em um a dois dias, sendo mais rápida que os métodos convencionais de restrição do genoma completo que podem demorar até sete dias.

Diagnóstico e genotipagem do vírus da pseudoraiva por nested-PCR e análise de restrição enzimática

Pseudorabies is a disease caused by Suid herpesvirus 1 (PrV) and is responsible for considerable economic losses in the swine industry. The PrV has only one serotype, but based on RFLP (restriction fragment length polymorphism) the virus was divided into four genotypes named I, II, III, IV. The classical methods for PrV genotyping usually require virus isolation, DNA purification enzyme restriction analysis and a long electrophoresis. The aim of this research was to describe a faster and more sensitive method to detect and genotype PrV based on nested-PCR and restriction enzyme analysis. Twenty PrV isolates from south and southeast regions of Brazil, and the standard strain Shope were grown in PK-15 cells and submitted to PCR for glycoprotein E gene amplification. Additionally were tested 75 clinical samples (swine brain), with 25 positives for virus isolation and seroneutralization, and 50 negatives from a flock free PR with negative results in seroneutralization test. There was 100% of agreement between results of nested-PCR and virus isolation and seroneutralization and all samples detected were classified as genotype II. The nested-PCR, combined with restriction enzyme analysis, was able to detect and genotype PrV in 1-2 days with a sensitivity of 10-1,3 TCID50 mL-1. It was faster than classical methods described in the literature that require at least 7 days to be completed.

A pseudoraiva (PR) é uma enfermidade viral responsável por consideráveis perdas econômicas na indústria de suínos. O vírus da pseudoraiva (PrV) apresenta apenas um sorotipo, mas, por análise de restrição enzimática, foi classificado em quatro genótipos denominados I, II, III e IV. Os métodos usados para genotipagem dependem do isolamento do vírus, da purificação do DNA viral, da restrição enzimática do genoma completo e da visualização após eletroforese. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um método mais rápido e sensível para detectar e genotipar o PrV por nested-PCR e análise de restrição enzimática. Vinte isolados do PrV das regiões Sul e Sudeste do Brasil e a estirpe padrão Shope foram replicadas em células PK-15 e submetidas à nested-PCR para o gene da glicoproteína E. Além desses vírus previamente isolados, foram avaliadas 75 amostras clínicas de cérebro de suíno em um total de 25 animais positivos para a PR no isolamento e na soroneutralização viral e 50 amostras negativas provenientes de animais negativos na soroneutralização viral e de granjas sem histórico de PR. Todas as amostras clínicas tiveram resultados compatíveis com o isolamento e a soroneutralização, e a totalidade das amostras positivas foi classificada como genótipo II. A sensibilidade analítica da nested-PCR foi de 10-1,3 TCID50 mL-1. A combinação da nested-PCR e da restrição enzimática foi capaz de detectar e genotipar o vírus com resultados em um a dois dias, sendo mais rápida que os métodos convencionais de restrição do genoma completo que podem demorar até sete dias.

Diagnóstico e genotipagem do vírus da pseudoraiva por nested-PCR e análise de restrição enzimática

Pseudorabies is a disease caused by Suid herpesvirus 1 (PrV) and is responsible for considerable economic losses in the swine industry. The PrV has only one serotype, but based on RFLP (restriction fragment length polymorphism) the virus was divided into four genotypes named I, II, III, IV. The classical methods for PrV genotyping usually require virus isolation, DNA purification enzyme restriction analysis and a long electrophoresis. The aim of this research was to describe a faster and more sensitive method to detect and genotype PrV based on nested-PCR and restriction enzyme analysis. Twenty PrV isolates from south and southeast regions of Brazil, and the standard strain Shope were grown in PK-15 cells and submitted to PCR for glycoprotein E gene amplification. Additionally were tested 75 clinical samples (swine brain), with 25 positives for virus isolation and seroneutralization, and 50 negatives from a flock free PR with negative results in seroneutralization test. There was 100% of agreement between results of nested-PCR and virus isolation and seroneutralization and all samples detected were classified as genotype II. The nested-PCR, combined with restriction enzyme analysis, was able to detect and genotype PrV in 1-2 days with a sensitivity of 10-1,3 TCID50 mL-1. It was faster than classical methods described in the literature that require at least 7 days to be completed.

A pseudoraiva (PR) é uma enfermidade viral responsável por consideráveis perdas econômicas na indústria de suínos. O vírus da pseudoraiva (PrV) apresenta apenas um sorotipo, mas, por análise de restrição enzimática, foi classificado em quatro genótipos denominados I, II, III e IV. Os métodos usados para genotipagem dependem do isolamento do vírus, da purificação do DNA viral, da restrição enzimática do genoma completo e da visualização após eletroforese. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um método mais rápido e sensível para detectar e genotipar o PrV por nested-PCR e análise de restrição enzimática. Vinte isolados do PrV das regiões Sul e Sudeste do Brasil e a estirpe padrão Shope foram replicadas em células PK-15 e submetidas à nested-PCR para o gene da glicoproteína E. Além desses vírus previamente isolados, foram avaliadas 75 amostras clínicas de cérebro de suíno em um total de 25 animais positivos para a PR no isolamento e na soroneutralização viral e 50 amostras negativas provenientes de animais negativos na soroneutralização viral e de granjas sem histórico de PR. Todas as amostras clínicas tiveram resultados compatíveis com o isolamento e a soroneutralização, e a totalidade das amostras positivas foi classificada como genótipo II. A sensibilidade analítica da nested-PCR foi de 10-1,3 TCID50 mL-1. A combinação da nested-PCR e da restrição enzimática foi capaz de detectar e genotipar o vírus com resultados em um a dois dias, sendo mais rápida que os métodos convencionais de restrição do genoma completo que podem demorar até sete dias.