RESUMO
A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é uma das leucemias mais importantes e, segundo o INCA, atingiu nos últimos anos a margem de 80% entre crianças menores de cinco anos. Sendo causa multifatorial, a prevenção não é tão simples. Assim, a L-Asparaginase II vem recebendo destaque mundial como uma estratégia no tratamento desta patologia. A enzima possui afinidade pela asparagina, hidrolisando-a e indisponibilizando para as células neoplásicas que necessitam como fonte de nutriente; e sem este, as células entram em remissão e morrem. Contudo, o Brasil ainda não possui produção nacional deste biofármaco, o que resulta em maior custo e risco de insuficiência na distribuição. Existem estudos em andamento, no entanto a produção desta enzima é complexa, envolvendo processos desde clonagem e cultivo do microrganismo, onde será produzida a enzima, até a extração e posterior purificação. Há três métodos mais utilizados de extração: sonicação e pérola de vidro, que causam a lise total da célula, gerando mais impurezas, e o choque osmótico que por uma perturbação na osmolaridade celular libera a enzima do periplasma, tornando o processo mais vantajoso, facilitando a purificação. O objetivo deste estudo foi estabelecer e padronizar condições ideais da extração propondo uma estratégia de escalonamento com robustez. Foi realizado ensaios para definir concentração de soluções I e II; avaliar a concentração celular; avaliar a relação de volume de solução/concentração celular e uma estratégia de escalonamento. A melhor condição das soluções foi: Tris-HCl 200 mM; Sacarose 20%; EDTA 5 mM (Sol I) e Água (Sol II). Verificou-se que a atividade enzimática aumenta em função da DO600, até certo ponto, com volume das soluções constante. Para melhor rendimento, foi necessário encontrar uma proporção entre concentração celular e o volume de solução. O planejamento fatorial realizado, com este propósito, apresentou inconsistências, estatisticamente, devido ao método de Nessler ainda estar em definição. No ensaio de escalonamento verificou-se escape a enzima no sobrenadante I, resultando em baixo rendimento. Conclui-se que é necessário um estudo mais detalhado para definir a proporção de soluções X DO600; bem como uma investigação cautelosa do escape enzimático precoce.
RESUMO
Acute Lymphoid Leukemia is one of the important leukemia and, according to INCA, in 2017 it hit the 80% margin among children under five. Being multifactorial, prevention is not so simple. Thus, L-Asparaginase II has received worldwide prominence as a strategy in the treatment of this pathology. The enzyme has an affinity for asparagine, hydrolyzing it and making it unavailable to the neoplastic cells that need it as a nutrient source; and without it, the cells get into remission and die. However, Brazil still does not have national production of this biopharmaceutical, which results in a higher cost and risk of distribution insufficiency. There are studies in progress, however the production of this enzyme is complex, involving processes from cloning and culture of the microorganism, where the enzyme will be produced, until the extraction and subsequent purification. There are three most commonly used methods of extraction: sonication and glass beads, which cause total cell lysis, generating more impurities, and osmotic shock that by a disturbance in the cellular osmolarity releases the enzyme from the periplasm, making the process more advantageous and facilitating purification. The objective of this study was to establish and standardize optimal extraction conditions, proposing a robust scaling strategy. Tests were carried out to define the concentration of solutions I and II; evaluate cell concentration; evaluate the volume / solution concentration ratio and a scaling strategy. The best condition of the solutions was: 200 mM Tris-HCl; 20% Sucrose; 5 mM EDTA (Sol I) and Water (Sol II). It has been found that the enzymatic activity increases as a function of DO600, to some extent, with constant volume of solutions. For better yield, it was necessary to find a ratio between cell concentration and the volume of solution. The factorial planning executed, with this purpose, presented statistically inconsistencies, due to the method of Nessler still being in definition. In the staining assay the enzyme was found to escape in the supernatant I, resulting in low yield. We conclude that a more detailed study is needed to define the proportion of solutions X DO600; as well as a cautious investigation of early enzymatic escape
A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é uma das leucemias mais importantes e, segundo o INCA, atingiu nos últimos anos a margem de 80% entre crianças menores de cinco anos. Sendo causa multifatorial, a prevenção não é tão simples. Assim, a L-Asparaginase II vem recebendo destaque mundial como uma estratégia no tratamento desta patologia. A enzima possui afinidade pela asparagina, hidrolisando-a e indisponibilizando para as células neoplásicas que necessitam como fonte de nutriente; e sem este, as células entram em remissão e morrem. Contudo, o Brasil ainda não possui produção nacional deste biofármaco, o que resulta em maior custo e risco de insuficiência na distribuição. Existem estudos em andamento, no entanto a produção desta enzima é complexa, envolvendo processos desde clonagem e cultivo do microrganismo, onde será produzida a enzima, até a extração e posterior purificação. Há três métodos mais utilizados de extração: sonicação e pérola de vidro, que causam a lise total da célula, gerando mais impurezas, e o choque osmótico que por uma perturbação na osmolaridade celular libera a enzima do periplasma, tornando o processo mais vantajoso, facilitando a purificação. O objetivo deste estudo foi estabelecer e padronizar condições ideais da extração propondo uma estratégia de escalonamento com robustez. Foi realizado ensaios para definir concentração de soluções I e II; avaliar a concentração celular; avaliar a relação de volume de solução/concentração celular e uma estratégia de escalonamento. A melhor condição das soluções foi: Tris-HCl 200 mM; Sacarose 20%; EDTA 5 mM (Sol I) e Água (Sol II). Verificou-se que a atividade enzimática aumenta em função da DO600, até certo ponto, com volume das soluções constante. Para melhor rendimento, foi necessário encontrar uma proporção entre concentração celular e o volume de solução. O planejamento fatorial realizado, com este propósito, apresentou inconsistências, estatisticamente, devido ao método de Nessler ainda estar em definição. No ensaio de escalonamento verificou-se escape a enzima no sobrenadante I, resultando em baixo rendimento. Conclui-se que é necessário um estudo mais detalhado para definir a proporção de soluções X DO600; bem como uma investigação cautelosa do escape enzimático precoce.
