Efecto del cizallamiento y del difosfato de adenosina sobre la activación plaquetaria y la formación de microagregados en controles sanos. Valoración mediante citometría de flujo / Effect of shear rate and adenosine diphosphate on platelet activation and microaggregate formation. Evaluation by flow cytometry

Introducción. Diversos estudios demuestran que las velocidades de cizallamiento elevadas provocan activación plaquetaria. Sin embargo, no está descrito cómo se comportan las plaquetas activadas por cizallamiento ante estímulos posteriores. No está bien establecido si las plaquetas después de activarse por cizallamiento en el flujo sanguíneo in vivo responden más o menos a la subsiguiente acción de agonistas fisiológicos, como el ADP (adenosine diphosphate ‘difosfato de adenosina’). Ésta es la cuestión abordada en el presente estudio, en el que se remedan in vitro las condiciones del flujo sanguíneo en las arterias no estenóticas. Material y métodos. Se valora la activación plaquetaria mediante citometría de flujo. El cizallamiento se induce en un viscosímetro de cono y plato a una velocidad de 230s−1, que remeda el cizallamiento fisiológico del flujo sanguíneo en las arterias sanas. Como marcadores de activación se determinan el antígeno CD62, el complejo glucoproteínas IIb/IIIa en su forma activa y la formación de los microagregados plaquetarios (MAP). Material y métodos. Se valora el porcentaje de plaquetas activadas espontáneamente y el número de los MAP. Seguidamente, se valora el porcentaje de las plaquetas activadas y los MAP tras estimular con ADP. En paralelo, se sigue el mismo procedimiento, pero se somete previamente la sangre a cizallamiento durante 5min. En estas muestras cizalladas se valora el porcentaje de las plaquetas activadas y los MAP antes y después de estimular con ADP. Resultados. El cizallamiento, así como el ADP, aumentan el porcentaje de las plaquetas activadas en la sangre. Cuando las plaquetas cizalladas se someten ulteriormente al ADP, el porcentaje de las plaquetas que se activan resulta significativamente menor que cuando el ADP estimula directamente las plaquetas en la sangre sin cizallar. Conclusiones. Las plaquetas sometidas a cizallamiento resultan refractarias a activarse subsiguientemente por acción de los agonistas, mientras que las plaquetas no cizalladas responden adecuadamente a éste. Esta respuesta refractaria in vitro puede representar un mecanismo de defensa celular que podría evitar in vivo un mayor grado de activación y agregación cuando las plaquetas se enfrentan a un agonista fisiológico en zonas donde aumente el cizallamiento de la sangre circulante (AU)

Introduction. Several studies show that high shear rate cause platelet activation. But the behaviour of these activated platelets by shear and subsequent stimulus by, for example, ADP is not well established. This paper investigates an in vitro model of blood flow conditions in non-stenotic arteries. Material and methods. Platelet activation is studied by flow cytometry. The shear is induced in a cone-plate viscometer at 230s−1 that mimics the blood flow conditions in healthy arteries. CD62 and GpIIb/IIIa in their active form are selected as platelet activation markers, as well as for the formation of platelet microaggregates (MAP). Material and methods. The percentage of spontaneously activated platelets and the number of MAP are determined. The percentage of activated platelets and MAP after stimulating with ADP is then evaluated. In parallel, the same procedure is followed, but after previously subjecting blood samples to a shear for 5min. In these sheared samples the percentage of activated platelets and MAP also are measured before and after stimulating with ADP. Results. Shearing, as well as ADP, increases the percentage of activated platelets in whole blood. When the platelets are subsequently subjected to ADP, the percentage of activated platelets is significantly lower than when the ADP directly stimulates platelets without shearing. Conclusions. Platelets subjected to shearing become refractory when they are subsequently activated by action of a physiological agonist such as ADP. However the platelets that are not sheared respond appropriately to this agonist. This refractory response in vitro may represent a cellular defence mechanism to prevent a greater degree of in vivo activation-aggregation when platelets are faced with an agonist in areas where the shear rate increases in the blood flow (AU)

Utilidad de la citometría de flujo en la determinación de microagregados plaquetarios en pacientes con stent tratados con clopidogrel / Flow cytometry evaluation of platelet microaggregates determination in patients with coronary stent implants treated with clopidogrel

Introducción: La monitorización de pacientes con síndrome coronario agudo (SCA) con stent cardíaco, tratados con clopidogrel resulta conveniente, dada la frecuencia con que dichos pacientes no responden adecuadamente al tratamiento. En efecto, según nuestra experiencia, aproximadamente un 30% de casos pueden clasificarse como pacientes no respondedores (NR). No está establecido si pacientes NR presentan, como factor de riesgo, mayor número de microagregados plaquetarios (MAP) que los pacientes respondedores (R). La formación de MAP puede afectar a la microcirculación y es un factor de riesgo de formación de trombos mayores, por lo que su estudio puede resultar de gran interés. Material y métodos: Se han valorado 78 pacientes consecutivos con un stent cardíaco implantado. El tratamiento consiste en un bolo inicial de 300 mg de clopidogrel, seguido de una dosis diaria de clopidogrel (75 mg) y ácido acetilsalicílico (100 mg). Aproximadamente 1 semana después de iniciado el tratamiento, se determina, mediante citometría de flujo (EPICS-XL, Beckman-Coulter, Izasa), el número MAP circulantes y los formados ex vivo por acción del ADP 2,5 μM. Para ello, con voluntarios sanos, se selecciona previamente la población plaquetaria, en función del forward y side scatter y por ser eventos CD61- positivos. En esta región se elige la subpoblación que ocupa el 5% superior, en la que, por definición, se encuentran los MAP. Una vez establecido el protocolo de adquisición de datos, se analizan las muestras problema. Los pacientes se clasifican como respondedores o no, en función de la exposición de CD62 plaquetaria inducida por accio´n de ADP 2,5 μM. Resultados: El conjunto de 78 pacientes presenta mayor número de MAP circulantes que los controles (167±58/5.000 plaquetas frente a 113±56/5.000 plaquetas; p<0,001).El incremento en el número de MAP por acción de ADP es similar en los 50 controles y en los 51 pacientes que responden adecuadamente al tratamiento. Los 27 pacientes NR presentan mayor respuesta al ADP que los pacientes R, con un incremento en el número de MAP de 251±75/5.000 plaquetas, significativamente mayor que en los pacientes R (196±67/5.000 plaquetas; p<0,001). Conclusiones: La técnica propuesta posibilita la detección de MAP formados espontáneamente y por acción del ADP, lo que permite monitorizar el tratamiento antiplaquetario en los pacientes SCA con stent implantado(AU)

Introduction: It is not well established whether non-responder patients(NR) to clopidogrel show, as a risk factor, higher number of platelet microaggregates (PMAs) than responder patients (R). These MAPs can affect the microcirculation and is a risk factor to forming larger thrombi, therefore the present study is interesting from this point of view. Material and methods: Seventy-eight acute coronary syndrome (ACS) patients (78% male, aged 62.8±12.23 years) were included in this study. These patients underwent coronary stent implantation and treated with routine medication (clopidogrel 75 mg/day and aspirin 100 mg/day), after a loading bolus of 300 mg clopidogrel. The control group was made up of 50 healthy volunteers matched for age and gender who had not been given any pharmacological treatment. Using whole blood flow cytometry, ADP-stimulated and circulating platelet CD62 expression and platelet microaggregates was determined in the entire study population. After a week of treatment the number of circulating platelet microaggregates was evaluated by flow cytometry (EPICS-XL, Beckman-Coulter, Izasa), and the number of MAPs formed ex vivo by ADP 2.5 μM activation was also evaluated . With this aim, using healthy individuals, the platelet population was selected by their forward and side scatter values and as CD61-positive events. The subpopulation that occupied the upper 5% in this region where MAPs are detected,was chosen. After the analytical conditions were established, samples were analyzed. Patients were responders, or not, depending on the CD62 expression after being activated with ADP 2.5 μM. Results: Seventy-eight patients showed a higher number of circulating MAPs than controls (177±75/5000 platelets vs. 121±62/5000 platelets; P<0.001). The increase in the MAPs number by ADP activation is higher in the 50 controls than in the 51 responder patients (79±45% vs. 23±18%; P<0.001). The 27 NR patients reacted to ADP in a similar way than controls, with a increase in the number of MAPs of 62±43%, significantly higher than in R (P<0.001). The findings of this study demonstrate the beneficial effects of clopidogrel in reducing platelet reactivity in 66% of the study patients. These results demonstrate the wide inter-individual variability in ADP response in patients treated with clopidogrel and imply that individualized monitoring of this type of patient is advisable. Conclusions: The method described enables us to explore platelet microaggregates formation and may be of great help in monitoring clopidogrel efficacy in ACS patients with stent(AU)

The Effects of Eprosartan on Cytoplasmic Free Calcium Mobilisation, Platelet Activation and Microparticle Formation in Hypertension. Could they be Relevant to Stroke Prevention?

The study examined a number of parameters of platelet function and activation in hypertensive patients compared with normotensive patients. It also examined the effects of the angiotensin receptor blocker eprosartan on these parameters. There were 30 patients with stage 1 or stage 2 hypertension plus 31 well-matched controls in this study. Phosphatidylserine, a measure of circulating activated platelets, was expressed more in hypertensive patients than in controls. Eprosartan partially corrected the enhanced platelet reactivity.There were greater numbers of activated platelet microparticles in hypertensive patients compared to controls. Again, eprosartan reduced this hyperproduction. Calcium kinetics of platelets were measured with flow cytometry using fluorescent markers.The free calcium concentration and its rise in response to thrombin were greater in hypertensive patients. Eprosartan significantly changed these parameters towards control values and reduced platelet activation. PATIENTS: Thus, eprosartan has the potential to reduce the risk of atherosclerotic events in hypertensive patients.