RESUMO
A proteína prion celular (PrPc) é uma isoforma de uma proteína infecciosa conhecida por seu envolvimento na encefalopatia espongiforme bovina (doença da vaca louca) e pela possível transmissão para o homem. O mecanismo de propagação da infecção resulta da modificação conformacional da proteína celular pela forma infecciosa, e portanto sem envolvimento de material genético do agente infeccioso. PrPc é expressa em todos os tecidos e sua estrutura primária apresenta uma grande similaridade entre as espécies, o que sugere que PrPc deva cumprir um papel fisiológico importante, o qual ainda esta sendo investigado. Nosso grupo caracterizou recentemente a proteína prion celular como um novo ligante de laminina (LN) e que esta interação está envolvida em processos de plasticidade neuronal. A interação de PrPc ocorre num decapeptídeo da região amino-terminal da cadeia y-1 de LN.Dada a importância da laminina nos processos tumorais e a pouca informação a respeito do papel de PrPc, pareceu-nos bastante relevante avaliar se a interação de PrPc com a LN poderia participar da adesão de linhagens celulares normais, transformadas e metastáticas (Nlli3T3, Nlli3T3jun, Nlli3T3ras, SKMel, A2058, C6). Avaliamos ainda a participação de PrPc nos processos de migração e colonização in vitro utilizando-se de células Nlli3T3ras. Demostramos que o bloqueio de prion celular na superficie de células normais e tumorais inibe sua adesão à latninina e ao peptídeo da cadeia y-1 de LN. A especificidade para o evento é mostrada pela ausência de efeito quando fibronectina (FN), que sabidamente não liga PrPc, é usada. Como esperado, anticorpos contra a cadeia integrina B-1 inibem a adesão celular em LN e FN. Curiosamente, estes anticorpos bloqueiam a adesão celular ao peptídeo da cadeia y-1 de LN, que nunca foi descrito na literatura como ligante de integrinas B-1, sugerindo que a cadeia integrina B-1 esta também relacionada, direta ou indiretamente, com este domínio da LN no processo de adesão celular. Culturas primárias de fibroblastos de camundongos normais e de animais que tiveram o gene de PrPc removido (PrPc_/_) foram usadas para que entendêssemos melhor a participação de PrPc na adesão celular à LN. As células derivadas de animais normais tiveram o mesmo comportamento descrito para as linhagens celulares já estudadas. Entretanto, células derivadas de animais PrPc_/_ não aderem ao peptídeo da cadeia y-1 de LN nem à LN. Células normais e PrPc0/0 expressam integrina B-1, aderem em FN e esta adesão é inibida por anticorpos anti integrina B-1, indicando que ambas têm integrinas B-1 funcionais. Portanto especulamos que neste modelo de adesão, a interação PrPc-LN procede ou modula direta ou indiretamente a associação da cadeia integrina B-1 à LN. O bloqueio de PrPc em células Nlli3 T3ras inibe sua migração tanto para LN como para o peptídeo da cadeia y-1 de LN em cerca de 85%. Entretanto, este bloqueio não tem nenhum efeito sobre a migração em FN. Ensaios in vivo foram conduzidos para avaliar se o bloqueio de prion celular da superfície de células Nlli3T3ras poderia impedir sua colonização em pulmões de camundongos das cepas Balb/c e Suíços. Nossos resultados mostram que quando comparados com controles os animais injetados com células onde prion celular é bloqueado apresentam redução de 50% no número de colônias pulmonares. Portanto, nossos resultados sugerem que a interação prion celular-laminina está envolvida nos eventos de adesões, migrações e colonizações pulmonares.
Cellular prion protein (PrPc) is a normal cell membrane sialoglycoprotein whose function is under investigation. We have recently observed that PrPc is a saturable, specific, highaffinity receptor for laminin (LN) and its binding site resides in a carboxy-terminal decapeptide (RNIAEIIKDI) from the y-1 LN chain. Herein we investigated the role o f the PrPc-LN interaction in the adhesion of normal, transformed and metastatic cell lines (Nlli3T3, Nlli3T3cjun, Nlli3T3ras, SKMel, A2058 and C6). The PrPc participation on tumoral metastatic cellline (Nlli3T3ras) migration in vitro and lung colonization in vivo was also investigated. Our data showed that PrPc impairment with specific antibodies blocked cell adhesion to LN or to the decapeptide from the y-1 LN chain by 80%, no inhibition was observed when fibronectin was used as substratum. As expected, antidodies against B-1 integrin chain were able to block cell adhesion to LN. However, they blocked adhesion to the decapeptide from the y-1 LN chain, which should not be a binding site for integrins. Primary culture fibroblasts from normal and PrPc deleted mice were used to better understand the PrPc participation on LN cell adhesion. Cells derived from normal mice had the same behavior of the cell lines previously studied. However, PrPc deleted cells did not adhere either on y-1 LN decapeptide or whole LN. Normal and PrPc deleted cells express B-1 integrin, adhere on fibronectin and this adhesion was inhibited by anti B-1 antibodies, indicating that they have fuctional B-1 integrins. Therefore we speculated that PrPc interaction with LN, in these experimental conditions was necessary to trigger cell adhesion. PrPc impairment blocked Nlli3T3ras cell migration through laminin and peptide from the y-1 LN chain-coated membranes by 85%. However, it did not have any effect on migration to fibronectin. W e procedure experiments in vivo in an attempt to understand the role ofPrPc on Nlli3T3ras celllung colony formation. We observed that when PrPc at the cell surface is blocked with specific antibodies the lung colonization decreased by 50%. These findings suggest that PrPc interaction with LN might participates on cell adhesion, migration and invasion.