The influence of pH, polyethylene glycol and polyacrylic acid on the stability of stem bromelain

Enzyme stability is critical in biotechnology, pharmaceutical and cosmetic industries. Investigations on this subject have drawn attention because of its practical application. Bromelain is a thiol-endopeptidase, obtained from pineapple (Ananas comosus), known for its clinical and therapeutic applications, particularly to selective burn debridement and improvement of antibiotic action and anti-inflammatory activities. To date, the use of bromelain in pharmacological or industrial applications is limited, due to commercial availability, costs, and sensitivity to pH and temperature. Therefore, a better understanding of enzyme stability would be of great interest. The aim of this study was to evaluate bromelain activity and stability in several pH (2.0 to 8.0) and in polyethylene glycol and polyacrylic acid solutions. We observed that bromelain was able to maintain its stability at pH 5.0 for the temperatures studied. PEG solutions increased bromelain stability, but PAA solutions had the opposite effect.

Estabilidade de enzimas é uma questão fundamental em indústrias biotecnológicas, farmacêuticas e cosméticas. As investigações sobre o assunto têm chamado a atenção por sua aplicação prática. A bromelina é uma tiol-endopeptidase, obtida a partir do abacaxi (Ananas comosus). É conhecida por suas aplicações clínicas e terapêuticas, especialmente para desbridamento seletivo de queimaduras, melhoria de ações antibiótica e de atividades anti-inflamatórias. Até o momento, a utilização da bromelina em aplicações farmacológicas industriais é limitada, devido à disponibilidade comercial, os custos, a sensibilidade ao pH e temperatura. Portanto, a maior compreensão da estabilidade desta enzima seria de grande interesse. O objetivo deste estudo foi avaliar a estabilidade da atividade da bromelina em vários pH (2,0 a 8,0) e em soluções de polietilenoglicol e de ácido poliacrílico. Observamos que a bromelina foi capaz de manter a sua estabilidade em pH 5.0, em todas as temperaturas estudadas. Soluções de PEG aumentaram a estabilidade da bromelina, enquanto que soluções de PAA obtiveram efeito oposto.

Extração de bromelina dos resíduos de abacaxi ( Ananas comosus ) por sistemas de duas fases aquosas e sua aplicação em hidrogel polimérico / Extraction of bromelain from pineapple waste ( Ananas comosus ) by aqueous two-phase systems and its application in polymeric hydrogels

Bromelina é um nome coletivo para enzimas proteolíticas encontradas no talo, fruto e folhas do abacaxi (Ananas comosus Merr). A bromelina possui propriedades anti-inflamatórias, de debridamento, entre outras. Para a produção da bromelina deve-se, preferencialmente, usar resíduos do abacaxi, visto que os produtos do fruto têm aplicação comercial. Este trabalho teve como objetivo a extração de bromelina a partir de cascas de abacaxi através de sistema de duas fases aquosas (SDFA), e sua aplicação em hidrogel polimérico. Foram realizados estudos de estabilidade da bromelina comercial, em que se observou maior estabilidade em pH 5,0 com menor perda da atividade relativa em todas as temperaturas estudadas (20, 30, 40 e 50°C). O estudo da extração da bromelina em SDFA formado por polietileno glicol (PEG) e ácido poliacrílico (PAA) (com auxílio da análise de variância de parâmetros como rendimento, fator de purificação e coeficiente de partição) proporcionou rendimento de 335% e fator de purificação de 25,8. Os hidrogéis poliméricos à base de PEG estudados apresentaram-se flexíveis, com pouca elasticidade e taxa de absorção superior a 1000%. Hidrogel carreado de bromelina pelo método de turgescência proporcionou a maior liberação da enzima, assim como a maior atividade (80% da bromelina liberada em 24 h e 278 ± 89 U/mL)

Bromelain is a collective name for the proteolytic enzymes found in the stem, fruit and leaves of pineapple (Ananas comosus Merr.). Bromelain possesses anti-inflammatory properties, debridement, among others. For bromelain production one should preferably use the waste materials, whereas pineapple fruit products have commercial application. This study aimed to extract bromelain from pineapple peels using aqueous two-phase system (ATPS), and its application in polymeric hydrogels. Stability studies of commercial bromelain were performed, which found greater stability at pH 5.0 with minor loss of relative activity at all temperatures studied. The study of bromelain extraction in ATPS composed by polyethylene glycol (PEG) and poly acrylic acid (PAA) (with assistance of variance analysis of parameters such as yield, purification factor and partition coefficient) showed yield 335% and purification factor of 25.8. The PEG-based hydrogels studied presented flexibility, low elasticity and swelling ratio higher than 1000%. Hydrogel containing bromelain, loading by embedding (solvent sorption) method, yielded the highest enzyme release, as well as the highest activity (80% bromelain released over 24 h and 278 ± 89 U / mL)

Polymer-based alternative method to extract bromelain from pineapple peel waste.

Bromelain is a mixture of proteolytic enzymes present in all tissues of the pineapple (Ananas comosus Merr.), and it is known for its clinical therapeutic applications, food processing, and as a dietary supplement. The use of pineapple waste for bromelain extraction is interesting from both an environmental and a commercial point of view, because the protease has relevant clinical potential. We aimed to study the optimization of bromelain extraction from pineapple waste, using the aqueous two-phase system formed by polyethylene glycol (PEG) and poly(acrylic acid). In this work, bromelain partitioned preferentially to the top/PEG-rich phase and, in the best condition, achieved a yield of 335.27% with a purification factor of 25.78. The statistical analysis showed that all variables analyzed were significant to the process.

LPS-protein aggregation influences protein partitioning in aqueous two-phase micellar systems.

Lipopolysaccharide endotoxins (LPS) are the most common pyrogenic substances in recombinant peptides and proteins purified from Gram-negative bacteria, such as Escherichia coli. In this respect, aqueous two-phase micellar systems (ATPMS) have already proven to be a good strategy to purify recombinant proteins of pharmaceutical interest and remove high LPS concentrations. In this paper, we review our recent experimental work in protein partitioning in Triton X-114 ATPMS altogether with some new results and show that LPS-protein aggregation can influence both protein and LPS partitioning. Green fluorescent protein (GFPuv) was employed as a model protein. The ATPMS technology proved to be effective for high loads of LPS removal into the micelle-rich phase (%REM(LPS) > 98 %) while GFPuv partitioned preferentially to the micelle-poor phase (K GFP(uv) < 1.00) due to the excluded-volume interactions. However, theoretically predicted protein partition coefficient values were compared with experimentally obtained ones, and good agreement was found only in the absence of LPS. Dynamic light scattering measurements showed that protein-LPS interactions were taking place and influenced the partitioning process. We believe that this phenomenon should be considered in LPS removal employing any kind of aqueous two-phase system. Nonetheless, ATPMS can still be considered as an efficient strategy for high loads of LPS removal, but being aware that the excluded-volume partitioning theory available might overestimate partition coefficient values due to the presence of protein-LPS aggregation.

Choice of sterilizing/disinfecting agent: determination of the decimal reductionTime (D-Value) / Escolha de esterilização/desinfecção: determinação do tempo de redução decimal (D-Value)

Efforts to diminish the transmission of infections include programs in which disinfectants play a crucial role. Hospital surfaces and medical devices are potential sources of cross contamination, and each instrument, surface or area in a health care unit can be responsible for spread of infection. The decimal reduction time was used to study and compare the behavior of selected strains of microorganisms. The highest D-values for various bacteria were obtained for the following solutions: (i) 0.1 percent sodium dichloroisocyanurate (pH 7.0) - E. coli and A. calcoaceticus (D = 5.9 min); (ii) sodium hypochlorite (pH 7.0) at 0.025 percent for B. stearothermophilus (D = 24 min), E. coli and E. cloacae (D = 7.5 min); at 0.05 percent for B. stearothermophilus (D = 9.4 min) and E. coli (D = 6.1 min). The suspension studies were an indication of the disinfectant efficacy on a surface. The data in this study reflect the formulations used and may vary from product to product. The expected effectiveness from the studied formulations shows that the tested agents can be recommended for surface disinfection as stated in present guidelines and emphasize the importance and need to develop routine and novel programs to evaluate product utility.

Esforços para diminuir o risco de transmissões de infecções incluem programas nos quais os desinfetantes desempenham papel crucial. As superfícies de materiais médico-hospitalares, se não estiverem diretamente ligados à transmissão de doenças, podem contribuir, potencialmente, para uma contaminação cruzada secundária. Cada instrumento ou superfície do estabelecimento do ambiente de saúde que entra em contato com um paciente é um disseminador potencial de infecção. Para estudar e comparar o comportamento dos microrganismos selecionados foram realizados ensaios de determinação do tempo de redução decimal. Os maiores valores D determinados, foram: (i) 0,1 por cento dicloroisocianurato de sódio (NaDCC) (pH 7.0) - E. coli e A. calcoaceticus (D = 5,9 min); (ii) hipoclorito de sódio (pH 7,0) à 0,025 por cento para B. stearothermophilus (D = 24 min), E. coli e E. cloacae (D = 7,5 min); e à 0,05 por cento para B. stearothermophilus (D = 9,4 min) e E. coli (D = 6,1 min). Este estudo estabelece que as suspensões estudadas são indicação da eficácia de desinfecção recomendada pela legislação, mas os resultados podem variar de produto para produto. Para desinfecção de mãos clorexidina pode ser utilizada, pois apresentou valores D baixos. Para desinfecção de nível intermediário de equipamentos e instrumentos recomenda-se a utilização de NaDCC, devido à estabilidade e baixo efeito corrosivo para equipamentos e materiais. Glutaraldeído, apesar de muito aceito para processos esterilizantes, tem eficácia comparável a soluções de formaldeído.

Minimal inhibitory concentration (MIC) determination of disinfectant and/or sterilizing agents / A concentração inibitória mínima (MIC) determinação de desinfetante e / ou agentes de esterilização

Due to the growing number of outbreaks of infection in hospital and nurseries, it becomes essential to set up a sanitation program that indicates that the appropriate chemical agent was chosen for application in the most effective way. Validating the effectiveness of decontamination and disinfection is an important and often challenging task. In order to study and compare the behavior of selected microorganisms, they were submitted to minimal inhibitory concentration (MIC). The MIC intervals, which reduced bacteria populations over 6 log10, were: 59 to 156 mg/L of quaternary ammonium compounds (QACs); 63 to 10000 mg/L of chlorhexidine; 1375 to 3250 mg/L of glutaraldehyde; 39 to 246 mg/L of formaldehyde; 43750 to 87500 mg/L of ethanol; 1250 to 6250 mg/L of iodine in polyvinyl-pyrolidone complexes, 150 to 4491 mg/L of chlorine-releasing-agents (CRAs) and 469 to 2500 mg/L of hydrogen peroxide. Chlorhexidine showed non inhibitory activity over germinating spores. A. calcoaceticus showed resistance to the majority of the agents tested, followed by E. cloacae and S. marcescens.

Devido ao número crescente de surtos de infecção hospitalar, torna-se proeminente o estabelecimento de um programa de sanitização que liste os agentes químicos a serem empregados e o modo de aplicação mais efetivo. Validação da eficácia de descontaminação é uma tarefa ao mesmo tempo importante e desafiadora. Para estudar e comparar o comportamento dos microrganismos selecionados foram realizados ensaios de concentração inibitória mínima (CIM). A CIM capaz de reduzir o bioburden inicial (>6 log10) foi: 59 - 156 mg/L de quartenários de amônia; 63 - 10000 mg/L de clorexidina, 1375 - 3250 mg/mL de glutaraldeído, 39 - 246 mg/L de formaldeído, 43750 - 87500 mg/L de etanol 1250 - 6250 mg/L de PVPI, 150 - 4491 mg/L de compostos liberadores de cloro e 469 -2500 mg/L de peróxido de hidrogênio.