RESUMO
Many neurodegenerative diseases, including tauopathies, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, and the polyglutamine diseases, are characterized by intracellular aggregation of pathogenic proteins. It is difficult to study modifiers of this process in intact cells in a high-throughput and quantitative manner, although this could facilitate molecular insights into disease pathogenesis. Here we introduce a high-throughput assay to measure intracellular polyglutamine protein aggregation using fluorescence resonance energy transfer (FRET). We screened over 2800 biologically active small molecules for inhibitory activity and have characterized one lead compound in detail. Y-27632, an inhibitor of the Rho-associated kinase p160ROCK, diminished polyglutamine protein aggregation (EC(50) congruent with 5 microM) and reduced neurodegeneration in a Drosophila model of polyglutamine disease. This establishes a novel high-throughput approach to study protein misfolding and aggregation associated with neurodegenerative diseases and implicates a signaling pathway of previously unrecognized importance in polyglutamine protein processing.
Assuntos
Amidas/farmacologia , Bioensaio/métodos , Inibidores Enzimáticos/farmacologia , Transferência Ressonante de Energia de Fluorescência/métodos , Peptídeos/antagonistas & inibidores , Peptídeos/análise , Piridinas/farmacologia , Amidas/uso terapêutico , Animais , Animais Geneticamente Modificados , Células COS , Morte Celular/efeitos dos fármacos , Morte Celular/genética , Modelos Animais de Doenças , Regulação para Baixo/efeitos dos fármacos , Regulação para Baixo/genética , Drosophila melanogaster , Avaliação Pré-Clínica de Medicamentos/métodos , Inibidores Enzimáticos/uso terapêutico , Humanos , Proteína Huntingtina , Corpos de Inclusão/química , Corpos de Inclusão/efeitos dos fármacos , Corpos de Inclusão/metabolismo , Peptídeos e Proteínas de Sinalização Intracelular , Proteínas do Tecido Nervoso/deficiência , Proteínas do Tecido Nervoso/genética , Doenças Neurodegenerativas/tratamento farmacológico , Doenças Neurodegenerativas/genética , Doenças Neurodegenerativas/metabolismo , Proteínas Nucleares/deficiência , Proteínas Nucleares/genética , Peptídeos/metabolismo , Células Fotorreceptoras de Invertebrados/efeitos dos fármacos , Células Fotorreceptoras de Invertebrados/metabolismo , Células Fotorreceptoras de Invertebrados/patologia , Dobramento de Proteína , Proteínas Serina-Treonina Quinases/antagonistas & inibidores , Proteínas Serina-Treonina Quinases/metabolismo , Piridinas/uso terapêutico , Transdução de Sinais/efeitos dos fármacos , Transdução de Sinais/genética , Expansão das Repetições de Trinucleotídeos/efeitos dos fármacos , Expansão das Repetições de Trinucleotídeos/genética , Quinases Associadas a rhoRESUMO
Incorporation of an unnatural amino acid containing a photolabile group in the side chain allows specific interactions between two proteins to be prevented. The photocaged ras protein in which Asp 38 has been substituted by its ß-nitrobenzyl ester (Nb) is unable to interact with its effector protein p120-GAP (see drawing below) although it has the same intrinsic GTPase activity. After photocleavage of the Nb group, 50% of the p120-GAP-dependent GTPase activity relative to the wild-type protein is restored.
